一種非水相中脂肪酶合成酶活力的快速測定方法

2023-09-17 18:17:20 1

專利名稱：一種非水相中脂肪酶合成酶活力的快速測定方法
技術領域：
本發明涉及一種非水相中脂肪酶合成酶活力的快速測定方法，可用在非水相中具有高酯合成活性的脂肪酶生產菌的篩選及酶活快速測定，屬於非水相脂肪酶催化技術領域。
背景技術：
脂肪酶作為一種甘油三酯水解酶，隨著非水相酶學的不斷深入和發展，已經成為非水相生物催化過程中用於有機合成的高效催化劑，能有效催化酯化與轉酯化反應，已成功用於許多重要的化合物生產，如芳香酯、單甘酯、手性化合物以及生物柴油等等。脂肪酶種類多，催化特性千差萬別，所以有目的的選擇所需要的脂肪酶是催化過程的關鍵。
酶的選擇取決於酶活力測定方法，因此針對不同的目的已經形成了許多種不同的脂肪酶酶活測定方法，絕大多數的脂肪酶酶活測定方法都是基於其水解特性，即測定的是脂肪酶的水解活力。然而問題在於有機相中的合成酶活和水相中的水解酶活不對應(Wu，Jaaskelainen et al.，Enzyme and MicrobialTechnology，1996，226)，根據水解酶活篩選得到的脂肪酶並不適合於酯化、轉酯化反應和在非水相中進行催化。國外許多研究者在研究過程中均發現這一問題，並採取了一些手段來解決這一矛盾。因而一些研究者基於酯化和轉酯化反應開發出了脂肪酶合成酶活的測定方法，這些方法大多採用GC、HPLC甚至滴定法測定酸或者酯的量以測定酶活，而這些方法的缺點在於當樣品量大或用於篩選工作時將會需要大量的實驗和時間消耗。針對以上缺點，Konarzycka-Bessler等人(Konarzycka-Bessler and Bornscheuer，AngewandteChemie-International Edition，2003，1418)開發了一種用於水解酶合成酶活高通量篩選的方法，和其原理相似Min Su Han等人(Han，Jung et al.，Journal ofOrganic Chemistry，2004，2583)也發明了一種用於測定有機相中蛋白酶轉酯化活力的方法，兩者均採用螢光顯色的方法。然而並不是所有實驗室都具備螢光分光光度計，並且螢光底物通常價格昂貴，且對反應溶劑要求高。

發明內容
(1)要解決的問題本發明的目的是建立一種非水相中脂肪酶合成酶活力的快速測定方法，該方法用於脂肪酶生產菌的篩選。所用底物選擇對硝基苯酚酯和乙醇，其價格低廉，且容易獲得，採用普通分光光度法進行測定，測定方法簡單易行，絕大多數實驗室儀器可滿足要求。
(2)技術方案本發明利用脂肪酶在非水相體系中催化對硝基苯酚酯與醇之間的轉酯化反應，反應5-30分鐘後，吸取50μL的反應液用1ml 0.1M的NaOH溶液在比色皿或多孔微孔板中萃取，用比色法於410nm處測定吸光度以確定對硝基苯酚的生成量，一個脂肪酶酶活單位定義為生成1μmol的對硝基苯酚所需的酶量。反應溫度和反應時間對於不同的脂肪酶有所不同。本發明還可以根據脂肪酶不同的底物而特異性改變對硝基苯酚酯的碳鏈長度，適合於酯鏈長C4-C16的對硝基苯酚酯的轉酯化反應所用脂肪酶的合成酶活力測定。可用於考察已知脂肪酶在非水相中的底物特異性，可用作篩選特定底物特異性的脂肪酶。
反應原理 所用底物對硝基苯酚酯為對硝基苯酚丙酸酯，對硝基苯酚己酸酯，對硝基苯酚月桂酸酯或對硝基苯酚棕櫚酸酯，所用底物醇為乙醇。
本發明所述的非水相中脂肪酶合成酶活力的快速測定方法，轉酯化反應條件為對硝基苯酚酯濃度為10mM，醇濃度為1M，反應溫度30-60℃，反應時間5-30分鐘，搖床轉速200轉/分鐘，酶濃度為0.01-0.3U。
該非水相中脂肪酶合成酶活力的快速測定方法，用於在非水相中具有合成活性的脂肪酶生產菌的篩選，將脂肪酶生產菌培養一定時間後製備成細胞凍乾粉或發酵液凍乾粉後在比色皿或多孔微孔板中萃取、測定酶活，根據酶活高低篩選出目的菌株。使用96孔微孔板進行萃取、測定酶活，以提高測定和/或篩選的效率。
以下採用對硝基苯酚棕櫚酸酯(pNPP)與乙醇作為底物，對來源於Brukholderia sp.的商品化脂肪酶L-PS-C和來源於Rhizopus chinenisis CCTCCM201021的全細胞脂肪酶(實驗室製備)進行更為詳盡的研究。
測定方法的可行性試劑及脂肪酶共使用了5種商品化脂肪酶和一種自備全細胞脂肪酶，分別是L-G(Amano G，Penicillium sp.lipase)Amano Pharmaceutical公司；L-PS-C(Amano PS-C，Brukholderia sp.lipase)Amano Pharmaceutical公司；L-AY(Amano AY，Candida rugosa lipase)Amano Pharmaceutical公司；
L-CR(lipase from Candida rugosa)Sigma公司；L-PP(lipase from Porcine Pancreas)Sigma公司，L-Rh(lipase from Rhizopus chinenisis，全細胞凍乾粉)實驗室製備，製備方法參見(Xu，Wang et al.，Journal of Molecular Catalysis B-Enzymatic，2002(18)，29-37)。
pNPP(對硝基苯酚棕櫚酸酯)購於Sigma公司，其他試劑均為分析純或者色譜純。
比色法測定合成酶活的典型過程準確稱取189mg pNPP溶於50mL經4分子篩除去水分的正庚烷中，配製成10mM的溶液。各脂肪酶2.5-10mg，加入到2mL的具塞塑料管中。加入0.5ml上述pNPP正庚烷溶液，然後加入30μL經4分子篩除去水分的無水乙醇(濃度約為1M)。200rmp，30-60℃條件下反應5-30分鐘，取50μL反應液用1mL 0.1M NaOH溶液萃取，於410nm處測定吸光度，若吸光值偏高，則將反應液稀釋一定濃度後測定。儀器為尤尼柯UNICOUV-2102 PC紫外可見分光光度計，1mL玻璃或者塑料比色皿。酶活的計算根據pNP(對硝基苯酚)標準濃度溶液繪製的標準曲線計算，一個酶活單位定義為生成1μmol pNP所需的酶量。
與本方法對照的脂肪酶合成酶活力測定方法為用氣相色譜檢測棕櫚酸乙酯的生成量取上述反應液150μL，用3mL 0.1M NaOH溶液萃取，混勻後離心，取上層清液加入一定量濃度的2-己醇內標後氣相檢測。色譜條件為初始溫度150℃，10℃/min升至220℃，保持10min，進樣口溫度250℃，檢測器溫度250℃。氣相色譜為Agilent 6820，色譜柱為AC20(PEG20000)，檢測器為FID。
與本方法對照的脂肪酶合成酶活力測定方法為脂肪酶催化合成辛酸乙酯的合成酶活測定辛酸和無水乙醇分別溶於正庚烷，濃度分別為0.6M和0.72M。分別取0.5mL反應底物於具塞塑料管中，加入約20mg脂肪酶，40℃，150rmp下振蕩反應30min。離心，取0.4mL上清液，加入0.1mL內標2-己醇，混勻，同時空白對照，氣相色譜法測定。氣相色譜測定條件為初始溫度90℃，保持1min，10℃/min升溫至200℃，保持5min，檢測器溫度250℃，進樣器溫度250℃。氣相色譜為Agilent 6820，色譜柱為AC20(PEG20000)，檢測器為FID。在測定條件下，每分鐘轉化1μmol辛酸乙酯的酶量定義為1個脂肪酶合成酶活單位。
本發明測定方法的最佳測定範圍與測定條件反應溫度不同脂肪酶對溫度的穩定性不同，對於非水相催化反應酶的溫度穩定性要遠好於水相催化反應。本測定方法在溫度30℃-60℃之間對於大多數脂肪酶而言都是有效的。
轉速由於非水相催化大多為固液兩相體系，而對於固液兩相系統，底物的傳質阻力是必然存在的，特別是對於固定化酶而言。第一層傳質阻力來源於固體催化劑表面所包裹的溶劑層，也稱之為外擴散阻力。當酶的反應速度遠小於底物擴散速度時，外擴散阻力不成為限制因素，而當酶的反應速度快時，外擴散阻力則為限制性因素。以脂肪酶L-PS-C為例，L-PS-C催化反應的速度較快，隨著轉速的加快反應速度顯著提高說明該反應為外擴散阻力控制，當轉速達到200rmp以上時，擴散阻力基本消失。對於本測定方法200rmp的轉速可滿足要求。
底物濃度酶活測定所需的底物濃度對於不同的酶而言差異很大，分別以脂肪酶L-PS-C和L-Rh全細胞脂肪酶為例，按上述比色法測定合成酶活的典型過程測定pNPP濃度在2.5-70mM範圍內的反應速率，採用Lineweaver-Burk法求得Km值。綜合考慮為使該方法對大多脂肪酶具有更好的通用性，採用10mM的對硝基苯酚酯濃度作為反應濃度，乙醇濃度為1M。
酶濃度酶濃度對於測定方法也是至關重要的，酶濃度過低會使得酶活檢測不到，而酶濃度過高則導致所測酶活不準確。仍然以酶活高的脂肪酶L-PS-C和酶活相對較低的L-Rh全細胞脂肪酶為例。按上述比色法測定合成酶活的典型過程，定時取樣測定不同酶濃度條件下的轉化曲線，稱取不同質量的酶加入到反應體系中，以此控制反應體系中的酶濃度。以酶濃度和反應速率繪製曲線，考察加酶濃度的最適範圍。結果表明當酶濃度在0.01-0.3U之間可以較準確地測定酶活。1U即為生成1μmol pNP所需的脂肪酶的量。
綜上所述，得出本測定方法的最佳測定條件(即轉酯化條件)如下底物濃度對硝基苯酚酯10mM，乙醇1M；反應溫度30℃-60℃；反應時間5-30分鐘，搖床轉速200rmp；酶濃度0.01-0.3U。
(3)有益效果本發明建立了一種適用於非水相中脂肪酶合成酶活力快速測定與篩選方法，能在酶量較小的情況下準確測定其合成酶活。所用底物易得，測定方法簡單，能快速測定脂肪酶合成酶活。對任意選取的6種脂肪酶採用不同合成酶活測定方法進行檢測，與本測定方法進行比較，證明了本測定方法的可行性。對一種商品化酶L-PS-C和L-Rh全細胞脂肪酶採用本測定方法進行了詳細研究，在確定最佳測定條件的同時也驗證了本方法能有效測定脂肪酶非水相體系中的合成酶活。
本發明與傳統的脂肪酶酶活力測定方法相比，根據水解酶活與非水相中的合成活性無必然聯繫這一現象，突出了非水相中脂肪酶的催化特性。將本發明用於高合成酶活脂肪酶生產菌的直接篩選，將會得到目的性更強，更適合於非水相催化的脂肪酶生產菌。本發明方法與國際上已有的有關脂肪酶合成酶活測定與篩選方法相比，無需氣相色譜、液相色譜，無需價格昂貴的螢光底物和螢光分光光度計。


圖1本發明方法(方法I)與方法III的相關度方法I比色法測定合成酶活；方法III脂肪酶酶催化合成辛酸乙酯的合成酶活測定。
具體實施例方式
實施例1用本發明方法對6種脂肪酶進行驗證選上述6種脂肪酶，用本發明所述的測定方法進行了驗證，並且為本測定方法用於脂肪酶非水相合成酶活力測定的可行性提供了有力證明，結果見表1。由於以上反應不是在最佳酶活測定條件下的結果，所以均以轉化率表示該酶催化合成活力的大小。氣相色譜檢測棕櫚酸乙酯的生成量的結果(表1中的方法II)和採用比色法測定的結果(表1中的方法I)相關度為90％，說明本發明的測定方法是可行的，且本發明所採用之檢測方法能有效測定脂肪酶催化對硝基苯酚棕櫚酸酯(pNPP)與乙醇的轉酯化反應。將比色法測定的結果(表1中的方法I)與脂肪酶酶催化合成辛酸乙酯的合成酶活測定結果(表1中的方法III)進行比較，六種脂肪酶用此兩種方法測定得到的合成酶活相關度在80％以上，而造成這一結果的原因是不同來源的脂肪酶底物特異性不同，從而導致了測定結果有所差別，但總體而言，本發明的測定方法，能有效測定脂肪酶非水相中的合成酶活。
表1

方法I比色法測定1小時內的轉化率方法II氣相色譜檢測棕櫚酸乙酯的轉化率方法III脂肪酶酶催化合成辛酸乙酯的轉化率實施例2用本發明方法進行L-PS-C脂肪酶酶活力測定稱取2.5mg L-PS-C脂肪酶置於2mL的具塞塑料管，加入0.5mL 10mM的pNPP正庚烷溶液和經4分子篩除去水分的30μL無水乙醇，200rmp，50℃條件下反應5min，取50μL反應液用1mL 0.1M NaOH溶液萃取，於410nm處測定吸光度，測得酶活為140.1U/g。
實施例3用本發明方法進行L-Rh全細胞脂肪酶酶活力測定稱取10mg L-Rh全細胞脂肪酶置於2mL的具塞塑料管，加入0.5mL 10mM的pNPP正庚烷溶液和經4分子篩除去水分的30μL無水乙醇，200rmp，40℃條件下反應30min，取50μL反應液用1mL 0.1M NaOH溶液萃取，於410nm處測定吸光度，測得酶活為5.6U/g。
實施例4脂肪酶生產菌篩選對於脂肪酶生產菌，需要篩選得到一株能在非水相中具有高合成活性的菌，採用氣相或液相檢測需要面對的將是巨大的工作量。從我們菌種選育過程中挑選出30株菌，製備成凍乾粉，製備方法參見(Xu，Wang et al.，Journal of MolecularCatalysis B-Enzymatic，2002(18)，29-37)。採用上述脂肪酶酶催化合成辛酸乙酯的合成酶活測定方法測定各菌的合成酶活，同時採用本發明之方法測定合成酶活，結果見附圖1。結果顯示兩種測定方法有較高的相關性，相關度接近83％，表明分光光度法能用於全細胞脂肪酶非水相中合成酶活的測定，並且將該方法用於高合成活性脂肪酶篩選的初篩，和以脂肪酶水解酶活作為初篩手段相比，可大大提高篩選效率和準確性。
實施例596孔板用於該測定方法的測定，提高測定效率。採用8×12型96微孔板，稱取一定量的酶粉於An-Fn(n＝1，3，5，7，9，11)孔中，或者將可溶性的酶粉溶於緩衝，按應加入的酶量加入酶液，凍幹後備用，Am-Fm(m＝2，4，6，8，10，12)孔中加入250μL0.1M NaOH溶液。反應時An-Fn加入200μL上述比色法測定合成酶活的典型過程中的pNPP正庚烷溶液，加入12μL無水乙醇，反應一定時間後8通道移液器吸取20μL反應液加入到相鄰的加有0.1M NaOH溶液的孔中，410nm處測定吸光度。
權利要求
1.一種非水相中脂肪酶合成酶活力的快速測定方法，其特徵是利用脂肪酶在非水相體系中催化對硝基苯酚酯與醇之間的轉酯化反應，反應5-30分鐘後，吸取50μl的反應液用1ml 0.1M的NaOH溶液在比色皿或多孔微孔板中萃取，用比色法於410nm處測定吸光度以確定對硝基苯酚的生成量，一個脂肪酶酶活單位定義為生成1μmol的對硝基苯酚所需的酶量。
2.根據權利要求1所述的非水相中脂肪酶合成酶活力的快速測定方法，其特徵是所用底物對硝基苯酚酯，適合於酯鏈長C4-C16的對硝基苯酚酯的轉酯化反應所用脂肪酶的合成酶活力測定。
3.根據權利要求1或2所述的非水相中脂肪酶合成酶活力的快速測定方法，其特徵是所用底物對硝基苯酚酯為對硝基苯酚丙酸酯，對硝基苯酚己酸酯，對硝基苯酚月桂酸酯或對硝基苯酚棕櫚酸酯。
4.根據權利要求1所述的非水相中脂肪酶合成酶活力的快速測定方法，其特徵是所用底物醇為乙醇。
5.根據權利要求1所述的非水相中脂肪酶合成酶活力的快速測定方法，其特徵是轉酯化反應條件為對硝基苯酚酯濃度為10mM，醇濃度為1M，反應溫度30-60℃，反應時間5-30分鐘，搖床轉速200轉/分鐘，酶濃度為0.01-0.3U。
6.根據權利要求1、2、3、4或5所述的非水相中脂肪酶合成酶活力的快速測定方法，其特徵是用於在非水相中具有合成活性的脂肪酶生產菌的篩選，將脂肪酶生產菌培養一定時間後製備成細胞凍乾粉或發酵液凍乾粉後在比色皿或多孔微孔板中萃取、測定酶活，根據酶活高低篩選出目的菌株。
7.根據權利要求1或6所述的非水相中脂肪酶合成酶活力的快速測定方法，其特徵是所用多孔微孔板為96孔微孔板進行萃取、測定酶活，以提高測定和/或篩選的效率。
全文摘要
一種非水相中脂肪酶合成酶活力的快速測定方法，屬於非水相脂肪酶催化技術領域。本發明是利用脂肪酶在非水相體系中催化對硝基苯酚酯與醇之間的轉酯化反應，反應一定時間後，吸取一定體積的反應液用0.1M的NaOH溶液萃取，用比色法於410nm處測定吸光度以確定對硝基苯酚的生成量，一個脂肪酶酶活單位定義為生成1μmol的對硝基苯酚所需的酶量。本發明用於高酯合成活性脂肪酶生產菌的直接篩選，將會得到目的性更強，更適合於非水相催化的脂肪酶生產菌。本發明方法與國際上已有的有關脂肪酶合成酶活力測定與篩選方法相比，無需氣相色譜、液相色譜，無需價格昂貴的螢光底物和螢光分光光度計。
文檔編號C12Q1/44GK1928116SQ20061008624
公開日2007年3月14日 申請日期2006年8月25日 優先權日2006年8月25日
發明者徐巖, 滕雲 申請人:江南大學