多用途和靈敏的生物傳感器的製造方法

2023-09-18 04:39:40 2

多用途和靈敏的生物傳感器的製造方法
【專利摘要】所考慮的方法和裝置包括帶電的探針和中和劑在包括核酸、蛋白質和小分子在內的廣泛分析物的電化學檢測中的用途。在某些實施方案中，所述中和劑與所述探針形成複合物，其與所述探針本身相比具有降低的電荷量級，並且當將所述複合物暴露給所述分析物時，所述中和劑從所述探針上被置換下來。
【專利說明】多用途和靈敏的生物傳感器
[0001]相關申請
本文要求於2011年11月23日申請的美國臨時專利申請號61/563，130的優選權，所述申請通過引用以其整體結合到本文中。
發明領域
[0002]本發明領域是用於表徵或檢測廣泛的分析物(包括核酸、蛋白質和小分子)的分析裝置。
[0003]背景
非常需要開發出能夠檢測廣泛的不同分子靶標的通用傳感器。例如，這樣的多用途平臺具有為使用不同類型的儀器而進行的測試提供了單一解決方法的可能性。然而，迄今為止，已經開發出極少數通用檢測系統，對於直接樣品分析或臨床使用而言都不具有足夠靈敏度。此外，比目前使用的檢測方法快速而更靈敏的檢測方法將會滿足濫用藥物的篩選、醫學診斷、醫療點檢測(point-of-care testing)和環境監測的要求。
[0004]對於這樣的通用傳感器而言，電化學檢測是有吸引力的方式，因為它不依賴於複雜而相對脆弱的光學系統並且可製作傳感器表面為緊湊而相對便宜的微晶片，其含有具有不同特異性並可基本上同時閱讀的傳感器陣列。已經開發出報告傳感器-固定化單層的靜電變化的傳感方法，其具有多種讀出策略，包括場效應電晶體(Tian，B.等人(2010)Science 13:830-834)、微懸臂梁(Wu, G.，等人.(2001) Nat.B1technol.19:856-860)和電化學傳感器(Drummond, T.G.; Hill, M.G.;和 Barton, J.Κ.(2008) Nat.B1technol.21:1192-1199)。然而，可以靈敏地檢測各種各樣分析物的有效方法仍未實現。對於快速、靈敏、便攜和成本有效的檢測而言，電化學信號轉導方法已經引起特別關注。一種電化學系統已經顯示出用於多用途檢測的前景，但對於在檢測前需要複雜耗時的靶序列的酶促擴增的核酸分析物而言具有有限的靈敏度(Lai，R.L.等人(2006) Proc.Natl.Acad.Sc1.103:4017-4021)。
[0005]概述
本文所述的裝置和方法提供了電化學檢測的新方法，其為包括核酸、蛋白質和小分子在內的廣泛分析物提供了良好的靈敏度。在某些實施方案中，將探針序列或探針適體固定在檢測局部電荷的傳感器表面。將該探針序列或探針適體暴露給假配體或中和劑，後兩者與所述探針序列或探針適體結合併具有與之相反的電荷，從而降低了所述探針的局部環境中存在的總體或全部電荷的量級。在某些實施方案中，將可能含有分析物的樣品與所述探針接觸。目標分析物(如果在樣品中存在的話)與所述探針序列或探針適體形成複合物。複合物的形成置換了中和劑，從而通過例如在隨後檢測的測試表面附近產生較高電荷密度而改變所述探針局部環境的電荷狀態。所述中和劑可含有一個或多個序列錯配，以提高分析物從所述探針序列或探針適體上置換的效率。
[0006]任何合適的傳感器表面都可使用。在某些實施方案中，所述傳感器表面提供電荷依賴性的反應。在某些實施方案中，所述傳感器表面是納米結構的電化學檢測電極。在某些實施方案中，所述傳感器表面是場效應電晶體、微懸臂梁或電化學傳感器。在某些實施方案中，使用具有不同的附著探針的至少2個傳感器表面，所述探針能夠與不同分析物形成複合物。
[0007]所述分析物可以是分析程序中的任何物質或目標化合物，包括但不限於核酸、蛋白質和小分子。在一個實施方案中，所述目標分析物可以是小分子，包括但不限於治療藥、濫用藥物、環境汙染物和游離核苷酸。在這樣的實施方案中，所述探針可以是經設定以結合小分子的適體，並且可包括與所述探針結合併被小分子置換的中和劑。
[0008]在某些實施方案中，可通過控制溫度而調整所述探針和假配體、所述探針和所述分析物、以及所述分析物和所述假配體之間的相對穩定性。在某些實施方案中，可通過緩衝液(在其中形成複合物)的組成而調整所述探針和假配體、所述探針和所述分析物、以及所述分析物和所述假配體之間的相對穩定性。
[0009]在某些實施方案中，所述目標分析物可以是靶核酸，包括但不限於DNA、RNA和肽核酸(PNA)。在這樣的實施方案中，所述探針可以是與分析物核酸至少部分互補的核酸序列，並可包括與所述探針序列結合併被所述靶核酸置換的中和劑。在某些實施方案中，所述探針可包含核酸，例如DNA或PNA。在某些實施方案中，所述假配體可包含PNA。
[0010]在某些實施方案中，所述目標分析物可以是蛋白質或蛋白質片段。在這樣的實施方案中，所述探針可以是經設計以結合到所述蛋白質或蛋白質片段的適體，並可包括與所述探針適體結合併被所述蛋白質或蛋白質片段置換的中和劑。在某些實施方案中，所述目標分析物可以是不帶電荷的分子。在某些實施方案中，所述分析物是分子量小於大約500道爾頓的小分子。
[0011]在某些實施方案中，所述目標分析物以高親和力結合到所述中和劑上。在這樣的實施方案中，所述中和劑和所述分析物之間複合物的形成將所述中和劑從所述探針中釋放出來，從而在所述傳感器表面附近引起電荷量級的增加。在這樣的實施方案中，所述中和劑可以摻有一個或多個鹼基對錯配，以降低其對所述探針的親和力。
[0012]附圖簡述
考慮以下詳述以及附圖，前述和其它目的和優勢將會是顯而易見的，其中在全文中同樣的參考字符是指同樣的部分。
[0013]圖1A說明了使用傳感器表面的帶負電探針進行靜電檢測的現有技術方法。
[0014]圖1B說明了一個實施方案，其中當分析物自固定在檢測表面的帶電荷探針上置換假配體時，在檢測表面附近產生大的電荷變化。
[0015]圖2顯示了用於按照某些實施方案檢測分析物的說明性程序。
[0016]圖3A說明了一個實施方案，其中在所述中和劑釋放和靶標結合時，帶電的報告離子接近所述探針。
[0017]圖3B顯示了含有多個納米結構的檢測電極的示例性的傳感器晶片。
[0018]圖3C顯示了示例性的納米結構的檢測電極。
[0019]圖4顯示了用於按照某些實施方案檢測分析物的示例性的系統。
[0020]圖5顯不了說明性的探針和中和劑序列的列表。
[0021]圖6A顯示了說明性的ATP生物傳感器，其中當ATP與探針適體結合時，在檢測電極上發生自DNA探針適體的中和劑置換。
[0022]圖6B顯示了當中和劑已與所述探針適體結合(+中和劑)，且隨後ATP自所述探針適體上置換中和劑(+ATP)之後，在中和劑不存在(僅適體)時的ATP生物傳感器的說明性的差示脈衝伏安圖。
[0023]圖6C顯示了說明性的ATP生物傳感器的信號強度和ATP濃度之間的關係。
[0024]圖6D顯示了在添加ATP時，在說明性的ATP生物傳感器上觀察到的信號變化的時間依賴性。
[0025]圖7A顯示了說明性的古柯鹼生物傳感器，其中當古柯鹼與所述探針適體結合時，在檢測電極上發生自探針適體的中和劑置換。
[0026]圖7B顯示了在古柯鹼存在(+古柯鹼)和古柯鹼不存在(_古柯鹼)時,古柯鹼生物傳感器的說明性的差示脈衝伏安圖。
[0027]圖7C顯示了說明性的古柯鹼生物傳感器的信號強度和古柯鹼濃度之間的關係。
[0028]圖8A顯示了說明性的核酸生物傳感器，其中當靶核酸與所述探針序列結合時，發生自固定在檢測電極上的探針序列的中和劑置換。
[0029]圖SB顯示了當中和劑已於所述探針序列結合(+中和劑)，且隨後通過IpM互補20聚體DNA靶自所述探針序列置換所述中和劑(+DNA靶)之後，在中和劑不存在(僅探針)時的DNA生物傳感器的差示脈衝伏安圖。
[0030]圖8C顯示了 DNA生物傳感器的信號強度和互補的20聚體DNA靶濃度之間的關係。
[0031]圖8D顯示了使用與互補的探針，生物傳感器的信號強度和大腸桿菌W.COli)總RNA濃度之間的關係。
[0032]圖SE顯示了使用與rpoB互補的探針，說明性的生物傳感器的信號強度和得自不同濃度的大腸桿菌的裂解物之間的關係。
[0033]圖9A顯示了說明性的蛋白質生物傳感器，其中當蛋白質(在此情況下為凝血酶)與所述探針適體結合時，發生自固定在檢測電極上的探針適體的中和劑置換。
[0034]圖9B顯示了當中和劑已與所述探針適體結合(+中和劑)，且隨後通過10pM凝血酶自所述探針適體置換所述中和劑(+凝血酶)之後，在中和劑不存在(僅適體)時的說明性的凝血酶生物傳感器的差示脈衝伏安圖。
[0035]圖9C顯示了在非特異性封閉蛋白質牛血清白蛋白存在時(+BSA)和牛血清白蛋白不存在時(-BSA)，凝血酶生物傳感器的差示脈衝伏安圖。
[0036]圖9D顯示了凝血酶生物傳感器的信號強度和凝血酶濃度之間的關係。水平虛線顯示了由10nM牛血清白蛋白(一種非特異性蛋白質)產生的信號。
[0037]圖10顯示了說明性的核酸生物傳感器，其中當靶核酸與所述中和劑結合時，發生自固定在檢測電極上的探針序列的中和劑置換。
[0038]發明詳述
現有技術測定的基礎原理見圖1A。在現有技術測定中，如圖1A所示，將非-結合的探針分子附著到檢測電極表面。結果，在引入分析物之前，僅通過探針分子測量傳感器的電荷，所述分析物作為配體與探針分子結合併形成穩定複合物。當通過分析物結合之後，電極表面的電荷狀態被所述分析物的電荷改變。該方法在現有技術的基於電荷的傳感方法中具有明顯限制。首先，因為探針分子(其通常是帶負電的核酸)的固有電荷所致，背景信號可能很大。結果，如果探針電荷相對於分析物電荷而言非常大時，分析物與探針結合而產生的信號與背景信號之比可能很小，導致有限的測定靈敏度。結果，這樣的測定通常在分析之前都需要漫長、昂貴和易錯的分析物擴增(通過例如PCR等方法)。當與探針結合時在電極表面不產生明顯電荷變化的不帶電的分析物，尤其是低分子量分析物，可能是不可檢測的。最終，因為附著探針和分析物之間的複合物形成，檢測信號在電極表面的電荷量級上通常是減少的。這導致「信號關閉(signal-off)」測定結構，其中信號缺失表明分析物的存在，這種配置通常導致高的假陽性檢測率。現有技術的傳感方法本質上取決於分析物的信號振幅、它們的信號背景之比和它們的信號變化指示的分析物性質。遺憾的是，分析物的選擇並非測定設計者可以改變的變量，而是測試的需要。
[0039]圖1B所示的實施方案在傳感器表面的靜電性質的設計中引入新的自由度。將探針分子附著到電極表面並與中和劑結合，所述中和劑作為假配體對探針具有親和力並在複合物形成時中和所述探針的電荷。在某些實施方案中，可將裝置以及已經結合到所述探針上的中和劑供應給使用者。在某些實施方案中，使用者可將所述中和劑施用到含有探針的元件例如檢測電極，然後再加入分析物。在再一個實施方案中，使用者可將所述中和劑施用到含有探針的元件，基本上同時加入分析物。所述中和劑起到假配體的作用，其與探針形成可逆複合物並可被與所述探針形成複合物的配體或分析物置換。最終，所述中和劑可摻有與所述探針錯配的鹼基對，使得目標分析物更強烈、快速和/或穩定地結合所述探針，導致中和劑的置換。採用溫度變化或緩衝液組成的變化，也可調整中和劑對探針的親和力。緩衝液組成的這類變化包括但不限於在離子強度、多價陽離子的存在與否、有機溶劑的存在與否、離液劑的存在與否和親水性聚合物的存在與否上的變化。
[0040]中和劑可以是與探針分子形成複合物的任何分子。在某些實施方案中，這樣的複合物與附著探針相比具有降低的電荷量級，使得當加入目標分析物時，將所述中和劑從這種複合物上置換下來。所述中和劑可以是摻有中性或帶正電荷主鏈結構的核酸類似物。所述中和劑也可以是摻有帶負電荷主鏈結構、但具有淨正電荷的核酸類似物。在某些實施方案中，所述中和劑是肽核酸和陽離子胺基酸的綴合物，其特異性地結合到帶負電的探針上，使得所述中和劑-探針複合物的電荷與單獨的探針相比具有更少的負電。在其它實施方案中，所述中和劑可以摻有嗎啉代核酸類似物或甲基膦酸核酸類似物。
[0041]可置換的假配體的使用允許多個實施方案克服傳統電荷傳感測定的局限性。在某些實施方案中，通過測定設計者設計的電荷補償而抑制了測定中的背景信號，從而增強了信號檢測。在這樣的實施方案中，不僅通過分析物配體的分子電荷，而且通過探針分子的固有電荷(其在中和劑釋放時暴露出來)，測量了響應所述分析物存在的信號變化。這允許對檢測在複合物形成時在探針中不產生明顯電荷變化的分析物，允許使用一系列低分子量分析物進行測定，這樣的分析物先前不能通過電化學檢測而處理。這樣的低分子量分子的典型分子量小於大約500道爾頓，並可包括但不限於核苷酸和核苷酸類似物、濫用藥物、治療藥和環境汙染物。
[0042]在某些實施方案中，對背景信號的抑制也極大地提高了分析物-特異性信號和背景信號之比。令人吃驚的是，分析物-特異性信號對背景信號的這種降低允許直接檢測核酸分析物，消除了在表徵或檢測之前對昂貴而耗時的樣品PCR擴增的需要。
[0043]在某些實施方案中，不僅通過分析物的電荷、而且通過探針的電荷來確定信號的指示和振幅。這允許設計「信號打開(signal-on)」測定，其中所測量信號量級的增加指示分析物的存在。相對於用信號關閉結構的測定而言，這樣的信號打開測定通常顯示出低的假陽性結果率。
[0044]圖2顯示了用於按照某些實施方案檢測分析物的說明性程序200。所述程序開始於步驟202。在步驟204，在附著到傳感器表面的探針和假配體之間形成可逆的第一複合物。假配體可與探針部分互補，並具有與探針相反的電荷。在步驟206，使可能含有分析物的樣品與傳感器表面上的第一複合物接觸。如果分析物存在於樣品中，則在步驟208，假配體被所述分析物置換並形成第二複合物。在某些實施方案中，所述假配體被所述分析物置換並在分析物和探針之間形成第二複合物。在某些實施方案中，所述假配體被所述分析物置換並在所述分析物和所述假配體之間形成第二複合物。在步驟210，檢測第二複合物的存在，其指示所述分析物存在於樣品中。所述程序結束於步驟212。可以理解，程序200的步驟僅僅是說明性的並且某些步驟可以同時進行和/或以另一合適順序進行，只要不偏離本發明的範圍。在某些實施方案中，程序200還包括傳遞檢測結果的步驟(未顯示)，例如，通過顯示指示器(例如，顯示文本、符號或顏色編碼的指示器)給程序的使用者。在某些實施方案中，傳遞結果的步驟包括將結果存儲在與程序200相連的本地或遠程存儲器中，或通過將信息發送給程序200的使用者。
[0045]圖3A顯示了用提供與電極表面上電荷量級變化成比例的信號的電催化報告系統來測試的說明性的實施方案。在例如低分子量分子310例如核苷酸和核苷酸類似物、濫用藥物、治療藥和環境汙染物存在下，為了測量傳感器表面上的電荷變化，[Ru(NH3)6]3+/[Fe(CN)6]3_催化報告系統300用於產生信號，其可通過差示脈衝伏安法(DPV)而監測。在該說明性的系統中，最初電子受體308 (其可以是任何合適的電子受體例如[Ru (NH3) 6]3+)，被靜電吸引到電極表面302，其量與攜帶磷酸的核酸304的量成比例。當在電化學讀出期間使用[Fe(CN) 6]3_時，Ru(III)通過[Fe (CN) 6] 3_形成氧還循環而得以化學再生，其明顯放大了信號。該說明性的實施方案沒有共價標記並且不需要預處理樣品。因為Ru(III)對DNA主鏈磷酸基團的靜電親和力，當僅有DNA適體探針304固定在傳感器302上時，預期將有高催化電流，然而在測試測定中，當中和劑306存在時，將會強烈衰減這些電流。該報告系統可與納米結構的微電極一起使用，可將所述微電極製作在晶片表面。
[0046]圖3B和3C顯示了用於實例性實施方案的說明性的傳感器。為了製作傳感器，光刻技術圖案化用於產生具有傳感器322陣列的微電子晶片320。用於該研究的晶片具有20個傳感器。使用鍍有金(Au)層326和S12層328的矽片324作為基底，將接觸墊和引線圖案化到單個晶片上。再將Si3N4覆蓋層用於鈍化晶片表面。為了提供用於電沉積的傳感器的生長的模板，再將光刻法用於在Si3N4中打開5 μ m孔隙330。再使用金電沉積以使分形顯微結構332生長，可通過沉積時間、電位、Au濃度、支持電解質和本領域已知方法的覆蓋方案調節其尺寸和形態學。因為納米結構顯著增加測定靈敏度，所以用Pd薄層覆蓋Au結構以形成精細納米結構的傳感器(圖3C)。可以理解，用於產生傳感器的材料、尺寸和工藝僅僅是說明性的，並可使用其它合適的材料、工藝或尺寸，只要不偏離本公開內容的範圍。
[0047]在某些實施方案中，使用幾英寸的矽片來製作晶片，所述矽片用熱生長的二氧化矽薄層鈍化。再沉積25nm Ti。隨後用電子束-輔助的金蒸發，將350 nm金層沉積在晶片上，並使用標準光刻法和剝離工藝而圖案化。再沉積5 nm Ti層。使用化學蒸汽沉積，沉積500 nm絕緣Si3N4層。再使用標準光刻法將5 mm孔隙壓印在電極上，並用標準光刻法暴露0.4 mm X 2 mm 的接合墊(bond pad)。
[0048]在某些實施方案中，為了製作測定測試位點，將晶片在丙酮中經超聲清洗5 min,在異丙醇和去離子(DI)水中漂洗，並用氮氣流乾燥。電沉積在室溫下進行；在製作的電極上的5 Mm孔隙用作工作電極並用暴露的接合墊接觸。使用含有50 mM HAuCl4溶液和0.5M HCl的沉積溶液，製作Au (金)傳感器。使用DC電位安培法，分別在O mV下進行100秒鐘，和在O mV下進行20秒鐘，形成100 Mm和20 Mm Au結構。用DI水洗滌並乾燥後，通過在5 mM H2PdCl4和0.5 M HClO4的溶液中在-250 mV下再電鍍10秒鐘(對於100微米結構)和5秒鐘(對於20微米結構)，將Au傳感器用Pd覆蓋以形成納米結構。
[0049]在某些實施方案中，使用用於製備測定的示例性的方案。在該方案中，使用二硫蘇糖醇(DTT)將硫醇化適體和硫醇化DNA探針脫保護，接著用HPLC純化。隨後將HPLC-純化的探針凍幹並貯存於_20°C。在黑暗的溼度室中，在室溫下將含有5 μΜ硫醇化探針、25 mMNaCl和50 mM MgCl2的磷酸鹽緩衝液(25 mM, pH 7)與傳感器一起孵育I小時，以將探針固定在測試表面上。然後晶片用含有25 mM NaCl的磷酸鹽緩衝液(25 mM)洗滌2次，5分鐘。再將傳感器與含有10 μΜ中和劑和25 mM NaCl的磷酸鹽緩衝液(25 mM)在室溫下孵育30分鐘，接著用相同緩衝液洗滌3次，5分鐘。為了展示檢測的目的，再將晶片用不同的分析物處理，然後洗滌。
[0050]在某些實施方案中，使用具有以Ag/AgCl參考電極和鉬絲輔助電極為特徵的三電極系統的 B1analytical Systems (West Lafayette, Indiana) Epsilon 恆電位儀,進行電化學實驗。在含有 25 mM NaClUO μΜ [Ru (NH3) 6] Cl3 和 4 mM K3[Fe (CN)6]的 25 mM 磷酸鹽緩衝液(pH 7)中測量電化學信號。在5mV電位階躍、50mV脈衝幅度、50 ms脈衝寬度和100 ms脈衝周期下，得到差示脈衝伏安法(DPV)信號。以減去背景的電流計算對應於中和劑被特異性靶置換的信號變化:Λ 1% = (I & - 1^/1^ X 100 (其中I & =中和劑置換之後的電流，=中和劑置換之前的電流)。在這些說明性的實施方案中，使用Aspex(Delmont, Pennsylvania) 3025 SEM 得到掃描電鏡圖像。
[0051]圖4顯示了用於按照某些實施方案檢測分析物的示例性的系統。檢測系統400具有檢測室402，其包括一個或多個電極。在圖4中，檢測室包括工作電極404、反電極406和參考電極408。然而，任何合適數量或類型的電極都可使用。檢測室402還具有用於流入樣品以接觸工作電極404的入口 410，和用於流出樣品的出口 412。如果樣品含有目標分析物時，所述分析物可在工作電極404表面上形成探針-分析物複合物414。在某些實施方案中，一旦樣品通過入口 410進入檢測室402，可分配一定量的時間，以利於探針-分析物複合物414的形成。在某些實施方案中，在為探針-分析物複合物414形成分配足夠時間之後，含有分析物的樣品可以通過出口流出。隨後洗滌溶液可以流入通過樣品室402，以除去樣品中可能存在的不想要的材料。
[0052]將圖4所示的檢測系統400摻有說明性的三-電極恆電位儀配置，然而應當知道，任何合適的組件配置都可使用。將反電極406連接到電阻器418上，再將後者連接到控制放大器416的輸出上。將檢測模塊420跨接在電阻器418的兩端，以提供電流測量。檢測模塊420可以經配製以提供響應任何輸入波形的實時電流測量。將參考電極408連接到控制放大器416的倒相輸入端。將信號發生器422連接到控制放大器416的非倒相輸入端。該配置在工作電極上維持恆定電位，同時允許精確測量電流。在某些實施方案中，檢測室402可含有多個電極，用於檢測多個分析物。例如，檢測室402可包括多個工作電極，各自具有不同類型的附著探針，用於與樣品中存在的不同靶標結合。在某些實施方案中，檢測系統400可以經配製以每次一個地單獨處理工作電極，同時利用共同的反電極和參考電極。
[0053]將控制和通信單元424操作性地結合到檢測模塊420和信號發生器422上。控制和通信單元424可以使輸入波形和輸出測量同步化，並且可接收輸入和輸出並存儲在存儲器中。在某些實施方案中，控制和通信單元424可以是與檢測系統400相連的分離的單元。例如，檢測系統400可以是一次性的盒子，其具有可以連接到外部控制和通信單元424的多個輸入端和輸出端。在某些實施方案中，可將所述控制和通信單元操作性連接到顯示單元上，其根據輸入顯示輸出。在某些實施方案中，控制和通信單元424可以發射輸入和輸出信息到用於存儲和顯示的遠程目的地。例如，控制和通信單元424可以是移動裝置或者能夠與移動裝置相連。在某些實施方案中，控制和通信單元424可為檢測系統400提供動力。使用任何合適的動力來源(包括電池或插電式AC電源)都可給系統400提供動力。
[0054]在某些實施方案中，可以測定組合物的形式提供檢測系統，用於藥物篩選。所述測定組合物可以具有包含附著到傳感器表面的探針分子的可逆的第一複合物，所述探針分子與互補或部分互補的假配體形成複合物。所述探針對藥物的親和力可大於對假配體的親和力。因此，所述假配體可被藥物置換，形成第二複合物。第一和第二複合物可分別具有第一和第二電荷狀態。在某些實施方案中，檢測系統可作為試劑盒提供，所述試劑盒包括具有傳感器表面和附著到所述傳感器表面的探針的裝置。所述試劑盒還可具有能夠與假配體形成可逆複合物的假配體。試劑盒中的假配體可以是已經與探針結合或者可以是單獨包括在試劑盒中，用於以後結合。
[0055]在不同的實施方案中，可在Prelude自動化肽合成儀(Protein Technologies,Inc.; Tucson, Arizona)上使用固相合成方法合成中和劑。在這些實施方案中，通過質譜法證實合成產物。
[0056]在某些實施方案中，為了檢查該測定法檢測小分子的能力，選擇ATP作為模型分析物或結合配體。說明性的ATP探針和適體序列見圖5。用於ATP檢測的中和劑測定600的說明性配置見圖6A。在些實施方案中，首先將硫醇化ATP-結合適體602固定到表面具有Pd的傳感器604上，然後引入部分互補的中和劑606。中和劑606的PNA部分608主要與適體602互補。然而，引入2個錯配610以便在ATP 612加入後允許容易釋放中和劑606。中和劑606的存在強烈減少了傳感器604表面的電荷，其將通過靶分子置換中和劑610而得以恢復。
[0057]在圖6B中，DPV圖620顯示了在中和之前622，在中和之後624，和在ATP引入之後626，在傳感器上獲得的信號。對於ATP檢測，將傳感器與含有25 mM NaCl和不同濃度的ATP的磷酸鹽緩衝液(25 mM)在室溫下一起孵育10分鐘。對未結合的固定化適體的掃描揭示出高催化電流，與Ru(III)強烈靜電吸引到適體的DNA主鏈是一致的。當所述中和劑分子與適體雜交時，所觀察的電流減少〉80%。令人吃驚的是，減少峰值也變為更多負電位。這可能是因為當中和劑存在時減緩了電子傳遞動力學。當分析物ATP結合到適體探針時，適體的結構變化引起中和劑釋放，導致催化電流的增力口。如圖6C的濃度圖630所示，在ATP結合之前和在ATP結合之後所觀察到的電流變化與溶液中的ATP濃度直接相關。水平虛線632顯示在ATP不存在時所產生的信號。
[0058]為了評價傳感器反應的時間依賴性，在某些實施方案中，將ATP引入[Ru(NH3)6]3+/[Fe(CN) 6]3_催化溶液中並實時測量信號變化。圖6D顯示了說明性的時間圖640，其含有指示以下的數據:在ATP存在642時的信號變化發生在I min內，並且在ATP不存在644時的信號變化甚至在20 min後仍不明顯。這些結果清楚表明傳感器反應是快速的，並且探針-中和劑複合物是穩定的。
[0059]圖7A顯示了古柯鹼測定700的說明性的實施方案，其使用如上所述地用於ATP的類似方法進行，其中適體702固定在傳感器704上並且對於古柯鹼分子712具有特異性。圖7B的DPV圖720顯示了古柯鹼-結合適體的起始高電流在中和劑雜交722之後降低。用於古柯鹼測定700的適體702和中和劑706的說明性的序列見圖5。在該實施方案中，中和劑706具有與適體702互補的部分708，和2個錯配710，其在古柯鹼712加入後允許容易釋放中和劑706。當用古柯鹼712攻擊適體-中和劑複合物時，所得的適體702的結構變化釋放了中和劑706並產生高催化電流724。對於該說明性實施方案的古柯鹼檢測，將傳感器704與含有25 mM NaCl和不同濃度古柯鹼的磷酸鹽緩衝液(25 mM)在室溫下一起孵育2分鐘。圖7C的濃度圖730顯示了在y軸上觀察到的電流(以百分點計)隨X軸上的古柯鹼濃度(以yg/mL計)的變化。水平虛線732顯示在古柯鹼不存在時所產生的信號。在古柯鹼結合之前和在古柯鹼結合之後所觀察到的電流變化與溶液中的古柯鹼濃度直接相關。對於Iμ g/mL古柯鹼的信號變化與古柯鹼不存在時或非-靶分析物存在時相比高出〉60%。這種靈敏度水平相當於商業性試驗並且豐富了藥物篩選。
[0060]用小分子分析物已建立了高水平性能，評價測定性能以確定它是否提供對於核酸分析物而言的臨床相關的(飛摩爾或更好的)靈敏度，因為其它開發通用檢測系統的嘗試尚未用這類分析物成功得到良好的靈敏度。
[0061]圖8A說明了用於核酸靶812的示例性測定的示意圖800。將硫醇化-DNA探針802固定到傳感器804上。未結合的DNA探針802的催化電流822開始是高的，而當加入中和劑806時被明顯抑制824，如圖8B的DPV圖820所示。當暴露給I pM互補的寡核苷酸20-聚體靶之後，電流826增加>300%。DNA探針802、DNA探針中和劑806和DNA靶812的序列見圖5。中和劑806具有與DNA探針802互補的部分808，和2個錯配810，其在DNA靶812加入後允許容易釋放中和劑806。
[0062]在某些實施方案中，研究了核酸測定的濃度依賴性，使用20-聚體合成的靶DNA和非互補的靶，其用於評價背景水平並評價特異性。非互補的靶的說明性的序列見圖5。對於該合成的靶DNA，將傳感器與含有25 mM NaClUO mM MgCl2和不同濃度的靶的磷酸鹽緩衝液(25 mM)在室溫下一起孵育30分鐘。為了鑑定示例性測定的檢測限，靶DNA的濃度在1pM和10 aM之間變動，如圖8C的濃度圖830所示。信號在跨越5個數量級的範圍內隨靶濃度的增加而增加。水平虛線832指示100 nM非互補靶的平均電流。10 aM DNA靶的信號變化(儘管大於100 nM非互補靶的信號變化)對於統計顯著性而言並不足夠高，表明對於20-聚體靶的這測定的檢測限在100-10 aM之間。
[0063]還評價了大腸桿菌總RNA形式的複雜異質樣品測定的某些實施方案的性能。設計了 RNA聚合酶盧mRNA (rpoB)(在細菌中高度表達且在物種間不保守的一種轉錄物)的DNA探針。DNA探針和中和劑的說明性序列見圖5。如圖8D的濃度圖840所示，該說明性測定所產生的信號對異質混合物大腸桿菌總RNA濃度的濃度依賴性，其中水平虛線842顯示在大腸桿菌RNA不存在時觀察到的信號。在大腸桿菌總RNA的情況下，將傳感器與含有不同濃度靶的無菌和無RNase的PBS在室溫下一起孵育30分鐘。成功檢測到10 pg/μ?大腸桿菌總RNA，表明用過量的非互補材料，該說明性測定可以達到高靈敏度水平。
[0064]還提供和測試了使用未經處理的細菌裂解物的測定的某些實施方案。在測試這些實施方案中，將含有已知量的大腸桿菌懸液放入裂解室，強大電場在此裂解細菌，產生未經處理的細菌裂解物。然後該裂解物無需進一步純化或擴增就可使用。用於細菌裂解物探針和細菌裂解物中和劑的說明性序列見圖5。圖SE的濃度圖850說明了測定信號對用於產生未經處理的裂解物的大腸桿菌量的依賴性，並且顯示了信號隨最初懸液中的大腸桿菌細菌濃度的增加而增加。在這些研究中，將傳感器與大腸桿菌裂解物在無菌和無RNase的PBS中在室溫下一起孵育30分鐘。圖8E中的水平虛線852代表來自150 cfu/^L腐生葡萄球菌{Staphylococcus saprophyticus)的裂解物的平均信號,所述裂解物的組分與探針是非互補的。對大腸桿菌細菌的檢測限令人吃驚地為0.15 cfu/^L。該靈敏度檢測限在對未經處理樣品的直接分析中是空前的，並且對於臨床樣品中存在的細菌的檢測而言是臨床相關的。在這些說明性的實施方案中的測定動力學允許以高靈敏度和特異性，快速檢測細菌的存在，從樣品獲取到結果只需要不到30分鐘。
[0065]表徵了某些實施方案，以證實對於不同實施方案而言的本文所述的測定形式能夠檢測蛋白生物標記，使用凝血酶作為模型系統。凝血酶結合適體是良好表徵的序列，已知它摺疊成G-四重結構並在外部位點I (exosite I)結合凝血酶。凝血酶結合適體和凝血酶適體中和劑的說明性的序列見圖5。圖9A顯示了按照某些實施方案的說明性的蛋白檢測方法900。將硫醇化凝血酶-結合適體902沉積在傳感器表面904，隨後與凝血酶適體中和劑906結合，後者至少部分地中和傳感器表面904附近的電荷。中和劑906具有與適體902互補的部分908，和2個錯配910，其在凝血酶912加入後允許容易釋放中和劑906。凝血酶912與凝血酶結合適體902的結合(其形成適體-凝血酶複合物914)，置換了凝血酶適體中和劑906並恢復了電荷，導致傳感器反應的可檢測變化。
[0066]在圖9B中，DPV圖920顯示了單獨的適體922、適體-中和劑複合物924和適體-凝血酶複合物926的電催化電流。當中和劑結合到凝血酶適體之後，明顯抑制了電催化電流。當用100 PM凝血酶處理時，觀察到催化電流的大的增加。相反地，圖9C的DPV圖930顯示了當用100 nM BSA (一種非特異性蛋白)處理時，信號變化是微不足道的，表明該測定對凝血酶是特異性的。如圖9D的濃度圖940所示，觀察到的信號與凝血酶濃度成正比，並且顯示出低至10 fM凝血酶都是明顯可檢測的。水平虛線942顯示了凝血酶不存在時所產生的信號。
[0067]圖10顯示了核酸測定1000的說明性的實施方案，其中分析物通過與假配體而非探針形成複合物而置換該假配體。在該實施方案中，中和劑1006對分析物1012比對探針1002具有更大親和力，這導致分析物1012和中和劑1006之間形成複合物1014。在測定1000中，中和劑1006對分析物1012具有特異性並摻有與探針1002錯配的一個或多個鹼基對1010、和與探針1002互補的部分1008。在該實施方案中，通過因與溶液中的完美匹配的靶1012雜交而從探針1002上除去錯配的中和劑1006，在中和劑1006雜交到探針1002之後觀察到的信號增加。這導致當分析物-探針複合物不存在時，根據中和劑1006的除去和附著到電極檢測表面1004的探針1002的電荷恢復，在電極檢測表面1004上的電荷得以恢復。應當知道，儘管該實施方案是在核酸檢測的情況下描述的，但所述實施方案並不限於此，而是可用於檢測各種各樣的分析物。
[0068]因此，公開了可用於廣泛生物分子的靈敏的生物傳感器的具體實施方案和應用。然而，本領域技術人員顯而易見的是，除了已經描述的之外，還可以進行許多更多的修改，只要不偏離本文的發明構思。因此，本發明的主題不受除所附權利要求書的精神之外的限制。此外，在解釋說明書和權利要求書兩者中，所有術語都應以符合上下文的最廣泛可能方式來解釋。具體地講，如本文所用的術語「包括」、「包含」、「含有」和「具有」，應當解釋為以非排他性方式涉及元件、組分或步驟，表明所涉及的涉及元件、組分或步驟可以存在，或可被利用，或與未明確指出的其他元件、組分或步驟組合。如本文所用的術語「多個(種)」，是指不止一個(種)，可包括兩個或更多個步驟、元件或組分的任何定義或未定義的子集。此外，當通過引用結合到本文中的參考文獻中的術語的定義或使用，與本文所提供的該術語的定義不一致或有矛盾時，採用本文所提供的該術語的定義，而參考文獻中的該術語的定義不適用。
[0069]本說明書和權利要求書的構成其部分的申請可用作任何後續申請的優先權基礎。這類後續申請的權利要求可以涉及本文所述的任何特徵或特徵組合。它們可以採用產品、方法或用途權利要求的形式並且可包括例如但不限於所附權利要求的一項或多項。
【權利要求】
1.檢測分析物的方法，包括: 使樣品與可逆的第一複合物接觸，所述第一複合物包含附著到傳感器表面的探針和具有與所述探針相反的電荷的假配體；和 檢測由所述分析物從所述探針上置換所述假配體而形成的第二複合物的存在，如果所述分析物存在於所述樣品中的話，其中第二複合物的存在表明所述分析物的存在。
2.權利要求1的方法，其中第一複合物具有第一電荷狀態，第二複合物具有第二電荷狀態，和其中對第二複合物的存在的檢測包括測定第一電荷狀態和第二電荷狀態之間的差巳
3.權利要求1或2的方法，其中第二電荷狀態具有比第一電荷狀態更大的總體量級。
4.權利要求1-3中任一項的方法，其中對第二複合物的存在的檢測包括測量由第二複合物的形成所致的電流振幅的變化。
5.權利要求4的方法，其中所述電流振幅高於預定閾值的增加表明所述分析物的存在。
6.權利要求4或5的方法，其中所述電流振幅的變化量級表明所述樣品中的所述分析物的濃度。
7.權利要求1-3中任一項的方法，其中檢測包括測量由第二複合物的形成所致的電壓變化。
8.權利要求1-7中任一項的方法，其中所述探針對所述假配體的親和力小於所述探針對所述分析物的親和力。
9.權利要求1-7中任一項的方法，其中所述探針對所述假配體的親和力大於所述探針對所述分析物的親和力。
10.權利要求1-9中任一項的方法，其中通過控制溫度而調整第一複合物和第二複合物的相對穩定性。
11.權利要求1-10中任一項的方法，其中通過緩衝液的組成而調整第一複合物和第二複合物的相對穩定性。
12.權利要求1-11中任一項的方法，其中所述分析物是核酸。
13.權利要求1-11中任一項的方法，其中所述分析物是蛋白質或蛋白質片段。
14.權利要求1-11中任一項的方法，其中所述分析物選自核苷酸、核苷酸類似物、濫用藥物、治療藥和環境汙染物。
15.權利要求1-11中任一項的方法，其中所述分析物的分子量小於大約500道爾頓。
16.權利要求1-15中任一項的方法，其中所述探針包含核酸。
17.權利要求1-16中任一項的方法，其中所述假配體包含PNA。
18.權利要求17的方法，其中所述PNA包含一個或多個附著的陽離子官能團。
19.權利要求17或18的方法，其中所述PNA包含與探針核酸序列錯配的一個或多個喊基對。
20.權利要求1的方法，進一步包括在所述假配體和所述分析物之間形成第二複合物。
21.權利要求1的方法，進一步包括在所述探針和所述分析物之間形成第二複合物。
22.用於檢測分析物的裝置，包括: 具有傳感器表面的傳感器，所述傳感器表面具有附著其上的探針； 使樣品與可逆的第一複合物接觸的入口，所述第一複合物包含所述探針和具有與所述探針相反的電荷的假配體；和 用於檢測由所述分析物從所述探針上置換所述假配體而形成的第二複合物的存在的檢測單元，如果所述分析物存在於所述樣品中的話，其中第二複合物的存在表明所述分析物的存在。
23.權利要求22的裝置，其中對第二複合物存在的檢測包括檢測在所述傳感器表面上或其附近的電荷增加。
24.權利要求22或23的裝置，進一步包括多個傳感器表面，其中至少2個所述傳感器表面包含不同探針。
25.權利要求22-24中任一項的裝置，其中在所述樣品與第一複合物接觸之前，形成第一複合物。
26.權利要求22-25中任一項的裝置，其中所述傳感器經配製以提供依賴於所述傳感器表面電荷的反應。
27.權利要求22-26中任一項的裝置，其中所述傳感器選自納米結構的電化學檢測電極、場效應電晶體、微懸臂梁和電化學傳感器。
28.權利要求22-27中任一項的裝置，其中所述分析物是核酸。
29.權利要求22-27中任一項的裝置，其中所述分析物是蛋白質或蛋白質片段。
30.權利要求22-27中任一項的裝置，其中所述分析物的分子量小於大約500道爾頓。
31.權利要求22-30中任一項的裝置，其中所述探針包含核酸。
32.權利要求22-31中任一項的裝置，其中所述假配體包含PNA。
33.權利要求32的裝置，其中所述PNA包含附著的陽離子官能團。
34.權利要求32或33的裝置，其中所述PNA包含與探針核酸序列錯配的一個或多個喊基對。
35.用於檢測分析物的系統，包括: 具有傳感器表面的傳感器，所述傳感器表面具有附著其上的探針； 使樣品與可逆的第一複合物接觸的入口，所述第一複合物包含所述探針和具有與所述探針相反的電荷的假配體； 用於檢測由所述分析物與所述假配體或所述探針中的至少一個形成的第二複合物的存在的檢測單元，如果所述分析物存在於所述樣品中的話，其中第二複合物的存在表明所述分析物的存在；和 與所述檢測單元相連的通信單元，用於將檢測結果傳遞給使用者。
36.權利要求35的系統，其中所述檢測單元經配製以通過測量所述傳感器表面上的電荷差異而檢測第二複合物的存在。
37.權利要求35或36的系統，進一步包括多個傳感器表面，其中至少2個所述傳感器表面包含不同探針。
38.權利要求35-37中任一項的系統，其中在所述樣品與第一複合物接觸之前，形成第一複合物。
39.權利要求35-38中任一項的系統，其中所述傳感器經配製以提供依賴於所述傳感器表面上的電荷的反應。
40.權利要求35-39中任一項的系統，其中所述傳感器選自納米結構的電化學檢測電極、場效應電晶體、微懸臂梁和電化學傳感器。
41.權利要求35-40中任一項的系統，其中所述分析物是核酸。
42.權利要求35-40中任一項的系統，其中所述分析物是蛋白質或蛋白質片段。
43.權利要求35-40中任一項的系統,其中所述分析物的分子量小於大約500道爾頓。
44.權利要求35-43中任一項的系統，其中所述探針包含核酸。
45.權利要求35-44中任一項的系統，其中所述假配體包含PNA。
46.權利要求45的系統，其中所述PNA包含附著的陽離子官能團。
47.權利要求45或46的系統,其中所述PNA包含與探針核酸序列錯配的一個或多個喊基對。
48.用於藥物篩選的測定組合物，包含可逆的第一複合物，所述第一複合物包含附著到傳感器表面的探針分子和與所述探針分子具有互補性的假配體，所述第一複合物具有第一電荷狀態，其中所述探針對假配體的親和力小於所述探針對藥物的親和力，從而允許所述藥物從第一複合物上置換所述假配體，形成第二複合物，並且其中第二複合物具有第二電荷狀態。
49.權利要求48的測定組合物，其中第二電荷狀態具有比第一電荷狀態更大的總體量級。
50.權利要求48或49的測定組合物，其中所述探針包含核酸。
51.權利要求48-50中任一項的測定組合物，其中所述假配體包含PNA。
52.權利要求51的測定組合物，其中所述PNA包含一個或多個附著的陽離子官能團。
53.權利要求51或52的測定組合物，其中所述PNA包含與探針核酸序列錯配的一個或多個鹼基對。
54.權利要求48-53中任一項的測定組合物，其中所述藥物是治療藥。
55.權利要求48-53中任一項的測定組合物，其中所述藥物是濫用藥物。
56.包含裝置的試劑盒，所述裝置具有探針附著其上的傳感器表面，其中所述試劑盒進一步包含能夠與所述探針形成可逆的複合物並具有與所述探針相反的電荷的假配體。
57.權利要求56的試劑盒，進一步包含用於檢測所述傳感器表面上的電荷差異的檢測單元。
58.權利要求56或57的試劑盒，其中在所述樣品與第一複合物接觸之前，形成第一複合物。
59.權利要求56-58中任一項的試劑盒，其中所述傳感器經配製以提供依賴於所述傳感器表面上的電荷的反應。
60.權利要求56-59中任一項的試劑盒，其中所述傳感器選自納米結構的電化學檢測電極、場效應電晶體、微懸臂梁和電化學傳感器。
61.權利要求56-60中任一項的試劑盒，其中所述分析物是核酸。
62.權利要求56-60中任一項的試劑盒，其中所述分析物是蛋白質或蛋白質片段。
63.權利要求56-60中任一項的試劑盒，其中所述分析物的分子量小於大約500道爾頓。
64.權利要求56-63中任一項的試劑盒，其中所述探針包含核酸。
65.權利要求56-64中任一項的試劑盒，其中所述假配體包含PNA。
66.權利要求65的試劑盒，其中所述PNA包含附著的陽離子官能團。
67.權利要求65或66的試劑盒，其中所述PNA包含與探針核酸序列錯配的一個或多個鹼基對。
68.用於檢測分析物的傳感器，包括: 包括多個電極的傳感器表面； 附著到所述多個電極的至少一個上的探針；和 能夠與所述探針形成可逆的第一複合物的假配體，使得當與第一複合物接觸時，分析物置換所述假配體。
69.權利要求68的傳感器，其中當所述假配體被置換時，形成第二複合物。
70.權利要求69的傳感器，進一步包括檢測單元，其經配製通過測量所述傳感器表面上的電荷差異而檢測第二複合物的存在。
71.權利要求68-70中任一項的傳感器，其中不同探針附著到所述多個電極的每一個上。
72.權利要求68-71中任一項的傳感器，其中在與含有所述分析物的樣品接觸之前，形成第一複合物。
73.權利要求68-72中任一項的傳感器，其中所述傳感器經配製以提供依賴於所述傳感器表面上的電荷的反應。
74.權利要求68-73中任一項的傳感器，其中所述傳感器選自納米結構的電化學檢測電極、場效應電晶體、微懸臂梁和電化學傳感器。
75.權利要求68-74中任一項的傳感器,其中所述分析物是核酸。
76.權利要求68-74中任一項的傳感器，其中所述分析物是蛋白質或蛋白質片段。
77.權利要求68-74中任一項的傳感器,其中所述分析物的分子量小於大約500道爾頓。
78.權利要求68-77中任一項的傳感器，其中所述探針包含核酸。
79.權利要求68-77中任一項的傳感器，其中所述假配體包含PNA。
80.權利要求79的傳感器，其中所述PNA包含附著的陽離子官能團。
81.權利要求79或80的傳感器，其中所述PNA包含與探針核酸序列錯配的一個或多個鹼基對。
【文檔編號】C12Q1/68GK104271762SQ201280067868
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2012年11月21日 優先權日:2011年11月23日
【發明者】薩納·O·凱利, 亞歷山大·扎拉戈扎, 愛德華·哈特利·薩金特, 傑戈塔莫伊·達斯, 克裡斯廷·錫德奎斯特 申請人:多倫多大學董事局