整合光敏肽及其應用的製作方法

2023-09-18 03:14:30 2

專利名稱：整合光敏肽及其應用的製作方法
技術領域：
本發明總體上涉及光學成像、可視化技術和光線治療。具體而言，本發明涉及光敏功能單元向生物活性靶向肽或假肽中的結構整合。

背景技術：
在整篇說明書中參考了圓括號內的出版物。與各份參考文獻相應的全部引文在具體實施方式
後列出。在此將這些出版物的公開內容通過引用全文納入本說明書中，以完整而清楚地描述本發明所屬領域的技術發展水平。
電磁光譜中可見區、近紅外(NIR)區或長波(UV-A，＞300nm)區的分子吸收、發射光或散射光適用於光學層析成像、光學相干斷層成像、螢光內窺鏡探查、光聲技術、聲致螢光技術、光散射技術、雷射輔助導航手術(LAGS)和光線治療。與螢光現象相關的高靈敏性與核醫學成像的高靈敏性相當，並可使器官和組織可視化而無電離輻射的副作用。在各種病變的診斷、預後和治療中，對診斷劑和治療劑(通常稱為「半抗原」、「效應物」或「功能單元」)——例如螢光團、光敏劑、放射性核素、順磁劑等——向體內特定部位的靶向給藥一直都具有相當的需求(Hassan et al.，Licha et al.，Shah et al.，Vasquez et al.，and Solban etal.)。被稱作「生物綴合物法(bioconjugate approach)」或「鉤環設計(pendant design)」的常規靶向法涉及這些試劑與靶向體內特定部位的生物活性載體的化學連接。在生物綴合物法中，所述兩個單元可獨立地存在和起作用，其中靶向和成像/治療功能可以是分隔開的。生物活性載體包括小分子藥物、激素、模擬肽(peptidomimetics)、酶抑制劑、受體結合劑、受體拮抗劑、受體激動劑、受體調節劑、DNA結合劑、轉錄因子、細胞周期系統(cell cycle machinery)抑制劑、轉導分子、蛋白質-蛋白質相互作用抑制劑、蛋白質-生物大分子相互作用抑制劑、大分子蛋白質、多糖、多核苷酸等。在過去幾十年已對生物綴合物法進行了廣泛的探索，並取得了一定的成功，特別是在使用中型和大型載體(分子量約＞1000道爾頓)的腫瘤檢測方面(Licha et al.和Shah et al.)。這是因為染料、藥物、金屬絡合物或其它效應分子與大分子載體如抗體、抗體片段或長鏈肽的連接不會明顯改變生物活性靶向性；即生物綴合物仍然能夠有效地結合受體。然而，這種方法確實有一些嚴重局限，因為高分子量的生物綴合物向腫瘤細胞的擴散是非常不利的，並且會被固體腫瘤中的淨正壓進一步複雜化(Jain et al.)。此外，很多染料在水性介質中趨向於形成導致螢光淬滅的團聚體。
因此，對同樣具有生物活性靶向能力的小光敏分子存在需求。然而，設計小分子生物綴合物的一個問題是，當診斷劑或治療劑與生物活性靶向載體的尺寸接近時，常常會觀測到該診斷劑或治療劑與靶向受體的結合大打折扣(Hunter et al.)。因此，替代使一個大如染料或光敏劑取代進入小分子藥物、肽、假肽或模擬肽中存在艱巨的挑戰。為克服這個問題，已經實施了一些方法(稱為「整合法」或「內部雙功能法(internalbifunctional approach)」)，其中將放射性核素金屬離子納入類固醇或嗎啡生物鹼框架中，使得原藥與其相應的放射性核素模擬物的分子拓撲結構非常相似(Rajagopalan，美國專利5,330,737；Rajagopalan，美國專利5,602,236；以及Horn et al.)。與上述生物綴合物法不同，整合單元的兩種個功能(例如，靶向和成像/治療)是不可分隔的。整合法所依據的原則是抗體、酶、和受體是多特異性的，且會與同天然抗原、底物或配體拓撲結構相似的任何分子結合。之前針對類固醇模擬物的研究證實，將金屬離子整合進入天然受體配體中對於診斷和治療上適用的放射性核素向靶組織的選擇性送遞而言是一種可行策略(Horn，et al.和Skaddan et al.)。該整合設計包括使一個功能單元通過單原子同配取代進入分子框架。然而，代替大功能單元如染料或光敏劑進入小分子藥物、肽、假肽或模仿肽中存在艱巨的挑戰。雖然核苷向螢光核苷的轉化此前已有報導(Miyata et.al.)，但是電子光譜(吸收、激發和發射)峰值保持在UV區域內。另外，這種轉化僅限於此單核苷應用。


發明內容
在本發明的各個方面中，提供一種肽或假肽的整合光敏類似物、其製備方法及其診斷和治療用途。
一方面，本發明涉及一種製備非光敏肽或假肽的整合光敏類似物的方法。所述方法包括用光敏官能團取代所述非光敏肽或假肽的非光敏官能團。
另一方面，本發明涉及一種對患者實施診斷程序的方法。所述方法包括對患者施用診斷有效量的非光敏肽或假肽的整合光敏類似物。
另一方面，本發明涉及一種對患者實施光線治療程序的方法。所述方法包括對患者施用治療有效量的非光敏肽或假肽的整合光敏類似物，並使用可導致所述分子光碎片化的波長的光線照射所述患者。
又一方面，本發明涉及非光敏肽或假肽的整合光敏類似物。
本發明的其他方面和特徵一部分將顯而易見，一部分將於下文指出。

具體實施例方式 本發明涉及非光敏肽或假肽的整合光敏肽或假肽類似物(下文稱為「整合光敏類似物」或簡稱「類似物」)的製備和使用方法，其中所述非光敏肽或假肽的非光敏官能團用具有相似尺寸和分子拓撲結構的光敏部分取代。本發明還涉及通過用光敏部分取代已知的非光敏肽或假肽序列中的非光敏官能團來合成整合光敏類似物的方法。可將所述整合光敏類似物給予患者，用作生物光學診斷造影劑和/或光線治療劑。在一個實施方案中，所述整合光敏類似物具有生物活性，其中它能靶向患者體內的特定組織、細胞、受體等。在一個實例中，所述類似物靶向患者體內的患病組織、細胞、受體等。
本發明的整合光敏類似物在350nm或更長的近紅外(NIR)或可見光譜中具有吸收、激發和發射最大波長。這對患者的診斷和治療是有益的，因為可見光和NIR光在用於生物光學診斷和治療程序時損傷組織的可能性較小。相反，波長低於350nm的紫外(UV)光可導致組織損傷。350nm或更長的較長波光還能更深地穿透組織，從而能夠對所關注的組織實施在低於350nm的波長下所不能實現的診斷和治療程序。在一個實施方案中，整合光敏類似物的吸收、激發、和發射最大波長在約400nm到約900nm之間。
將結構和功能部分整合進入一個分子類似物中的兩種常規方法包括(a)將一種已知的生物活性肽或假肽轉化為一種整合光敏類似物；和(b)將一種光敏實體轉化為一種具有生物活性的整合光敏類似物。在任一種方法中，所得分子都具有光敏性和生物功能的基本性質。根據結構和功能，可將本發明的整合光敏類似物稱為「整合螢光團」、「整合發色團」、「整合光敏劑」等。設計整合光敏類似物的常規方法主要包括(a)選擇一種需要的生物活性肽或假肽；(b)確定所述肽或假肽含有可取代部分(例如芳族、雜芳族或脂肪族部分)的區域；和(c)用相似尺寸的光敏官能團取代所述部分，或對所述部分進行改性使其具有光敏性。本發明所得的整合光敏類似物對診斷和治療應用二者都適用。
整合光敏類似物的合成和應用可以多種方式進行。在一個實施方案中，選擇具有已知或所需結構和功能的肽或假肽。例如，所選擇的光敏肽或假肽可靶向患者體內所關注的特定組織或細胞。確定肽或假肽分子結構中的非光敏官能團並用光敏官能團取代以製備整合光敏類似物。所得整合光敏類似物以治療有效量給藥至患者，以在所述患者體內檢測光敏肽或假肽。在所述類似物與其靶位點結合一段時間後，使患者全身或靶組織暴露于波長為350到1200nm的光線下。在一個實例中，隨後將患者全身或靶組織暴露于波長為400-900nm的光線下。然後檢測因整合光敏類似物的吸收和激發而從患者發出的光。由於整合光敏類似物的靶向性，通過評價自患者發出的光的位置和強度可做出診斷。
所述整合光敏類似物還可用於治療性地處理遭受病症折磨的患者，所述病症展現出所述類似物靶向的患病組織或細胞(例如，腫瘤、纖維化組織、白血病細胞等)。在對患者施用整合光敏類似物後，該類似物會靶向並結合至所關注的組織、細胞、受體或蛋白質上。將適用於使整合光敏類似物光碎片化/光激發為反應活性物(reactive species)的波長的光施加至結合類似物所在的患者部位。通過整合光敏類似物的光碎片化/光激發所產生的反應活性物破壞或殺死位於結合類似物附近的患病組織或細胞，從而有利地治療患者的病症。
整合光敏類似物的開發包括選擇一種靶向特定組織、器官、損傷、細胞等的合適的生物活性肽或假肽。這些包括但不局限於靶向以下的肽或假肽組織或器官，如大腦、心臟、肝、肺或腎；患病組織，如癌性腫瘤、白血病細胞、纖維化上皮細胞、囊性纖維化組織、子宮內膜異位組織等；與特定疾病相關的受體，如生腱蛋白(tenascin)C受體或ST受體；以及感染或發炎的組織。靶向與結腸癌有關的ST受體的肽的非限制性實例公開於美國專利5,518,888中，該專利通過引用的方式被全文納入本文。已發現其他肽或假肽如胺基酸序列ProLeuAlaGluIleAspGlyIleGluLeuThrTyr(SEQ ID NO1)可結合與囊性纖維化、腫瘤轉移和心肌活力相關的生腱蛋白C(Schneider et al.)。可用於診斷和治療病理性紊亂——如癌、動脈粥樣硬化、再狹窄、糖尿病性視網膜病、新生血管性青光眼、類風溼性關節炎、子宮內膜異位和其他與血管發生相關的病症——的生物活性肽或假肽公開於美國專利公布號20040053828中，該專利通過引用的方式被全文納入本文。生物活性肽或假肽的實例包括，但不局限於， AlaAsnIleLysLeuSerValGlnMetLysLeu(SEQ ID NO2)、 SerValGlnMetLysLeu(SEQ ID NO3)、 IleLysLeuSerValGInMetLysLeu(SEQ ID NO4)、和 AsnIleLysLeuSerValGInMetLysLeu(SEQ ID NO5)。
在靶向特定組織、器官、受體等方面也具有生物活性的肽和假肽的片段和/或衍生物，也可被改性為或合成為本發明的光敏分子。依照慣用表示法，此處用來定義肽和假肽的命名以這樣一種方式書寫在一個給定的胺基酸序列中，N端出現在左側，C端出現在右側。
在選擇一種生物活性靶向肽或假肽之後，確定位於所述肽或假肽上的非光敏部分，並用光敏部分取代。所述肽或假肽的任何部分或片段都可用光敏部分取代，只要該取代不會導致所得光敏肽或假肽的生物活性或生物活性靶向性大幅降低即可。例如，靶向特定組織、受體等的肽或假肽上的非光敏部分可使用光敏部分取代，只要所得的光敏肽或假肽也優先靶向所述特定組織、受體等即可。
在一個實施方案中，所述非光敏部分是一個位於肽或假肽上的芳族或雜芳族部分，其被光敏芳族或雜芳族部分取代。在一個實施例中，所述非光敏芳族或雜芳族官能團為羥苯基基團、吲哚基基團或苯基基團。在另一個實例中，肽或假肽含有一個或多個在其支鏈上含有非光敏芳族或雜芳族部分的胺基酸殘基，如酪氨酸(Tyr/Y)、色氨酸(Trp，W)、苯丙氨酸(Phe/F)或組氨酸(His/H)，其被光敏部分取代。在另一個實例中，所述非光敏芳族或雜芳族部分被其環結構與所述非光敏部分的原子數相同的芳族或雜芳族部分取代。在又一個實例中，所述非芳族或雜芳族部分被吡嗪、薁或氮雜薁(azaazulene)部分取代。
在另一個實施方案中，所述肽或假肽內的非芳族或非雜芳族胺基酸殘基的非光敏支鏈部分被光敏部分取代。在一個實例中，所述非芳族或非雜芳族部分被吡嗪、薁或氮雜薁部分取代。
在一個實施方案中，所述光敏部分包含一個具有下式的吡嗪部分
其中R1到R3獨立地選自氫、烷基、芳基、-OR4、-SR5、-NR6R7、-CN、-CO2R8、-NO2、-COR9、-CNR10R11、-SOR12和-SO2R13；W為N或-CR16；X選自-(CH2)n-、-N(R17)CO(CH2)n-、-CON(R18)(CH2)n-、-N(R19)SO2(CH2)n-、-NHCONH(CH2)n-、-O(CH2)n-、-CO2(CH2)n-、-S(CH2)n-、-SO(CH2)n-、-SO2(CH2)n-和-SO2N(R20)(CH2)n-；R4到R20獨立地選自由氫、C1-C6烷基、C1到C6羥基烷基、C1到C6烷氧基烷基；且n在0到10之間變化。
在另一個實施方案中，所述光敏部分包含具有下式的薁部分
其中X選自-(CH2)n-、-N(R17)CO(CH2)n-、-CON(R18)(CH2)n-、-N(R19)SO2(CH2)n-、-NHCONH(CH2)n-、-O(CH2)n-、-CO2(CH2)n-、-S(CH2)n-、-SO(CH2)n-、-SO2(CH2)n-和-SO2N(R20)(CH2)n-；R4和R17到R20獨立地選自氫、C1-C6烷基、C1到C6羥基烷基、C1到C6烷氧基烷基；n在0到10之間變化。
在另一個實施方案中，所述光敏部分包含具有下式的氮雜薁部分
其中X選自-(CH2)n-、-N(R17)CO(CH2)n-、-CON(R18)(CH2)n-、-N(R19)SO2(CH2)n-、-NHCONH(CH2)n-、-O(CH2)n-、-CO2(CH2)n-、-S(CH2)n-、-SO(CH2)n-、-SO2(CH2)n-和-SO2N(R20)(CH2)n-；R4和R17到R20獨立地選自氫、C1-C6烷基、C1到C6羥基烷基、C1到C6烷氧基烷基；n在0到10之間變化。
在另一個實施方案中，所述整合光敏類似物為一種與式(A)相對應的化合物
其中R21包含一個光敏官能團，R22選自氫、一個α-胺基酸殘基以及兩個或多個α-胺基酸殘基的序列，並且R23選自-OH、一個α-胺基酸殘基以及兩個或多個α-胺基酸殘基的序列。
在一個實例中，式(A)化合物包含酪氨酸殘基、色氨酸殘基、苯丙氨酸殘基或組氨酸殘基的光敏類似物，結構如下
其中R21包含一個支鏈光敏官能團。
本發明光敏部分的非限制性實例包括但不局限於烯烴、苯、萘、萘醌、芴、蒽、蒽醌、菲、並四苯、並四苯二酮、吡啶、喹啉、喹嗪、喹喔啉、奎尼丁、蝶啶、異喹啉、吲哚、異吲哚、吡咯、咪唑、噁唑、噻唑、吡唑、吡嗪、嘌呤、苯並咪唑、呋喃、苯並呋喃、二苯並呋喃、咔唑、吖啶、吖啶酮、菲啶、噻吩、苯並噻吩、二苯並噻吩、呫噸、呫噸酮、黃酮、蒽環類物(anthacylines)；薁和氮雜薁、吲哚菁、苯並卟啉、方酸、咕啉、香豆素和菁。通過將胺基酸或肽官能團添加到這些光敏部分，使所得光敏類似物具有生物活性或生物靶向性，從而可將所述光敏部分可以化學轉化為生物活性光敏類似物(例如受體結合劑)。
本發明的光敏部分還包括用於光線治療程序的反應活性物(即中間體)。光線治療的部分包括但不局限於自由基、卡賓、氮賓、單線態氧等。可納入肽或假肽中以合成光線治療類似物的I型光反應部分的實例包括但不局限於疊氮化物、偶氮化合物、重氮化合物、亞磺酸酯(sulfenate)、噻二唑、過氧化物和照射下形成的自由基或活性中間體。可納入肽或假肽中以合成光線治療類似物的II型光反應部分的實例包括但不局限於酞菁、卟啉、擴展卟啉(extended porphyrin)和苯並卟啉。這可通過將酞菁、卟啉、擴展卟啉和/或苯並卟啉系統化學轉化成生物活性物質(例如受體結合劑)來實現。這可通過將官能團添加到所述部分使所得肽或假肽具有生物活性或生物靶向性來完成。
在一個實施方案中，本發明的生物活性肽或假肽既包含光敏部分，也包含光反應部分。
在製備整合光敏類似物之後，將所述類似物給藥至個體。給定一段適當的時間以使所述類似物結合到所述患者體內的靶組織或細胞等上。應理解，本發明的化合物和組合物的給藥由主治醫師在穩妥的醫學判斷範圍內確定。任何特定患者的具體有效劑量水平取決於多種因素，包括治療的病症、該病症的嚴重程度、所用具體化合物的活性、所用的具體組合物、患者的年齡、體重、一般健康狀況、性別、飲食。整合光敏類似物的檢測可通過本領域已知的、使用侵入式或非侵入式探針如內窺鏡、導管、耳夾、手帶(hand band)、頭帶(head band)、表面線圈(surface coil)、指探針(finger probe)等的光學螢光、吸收或光散射法實現(Muller et al.)。成像可使用本領域已知的平面成像、光學層析成像、光學相干斷層成像、內窺鏡探查、光聲技術、聲致螢光技術、共聚焦顯微鏡技術或光散射設備實現。
與上述的診斷程序相似，整合光敏類似物也可給藥至患者以用於治療。在整合光敏類似物給藥至患者後，給定一段適當的時間以使類似物結合到患者體內的靶組織或細胞等上。患者可任選用上述任方法成像以確定類似物在患者體內結合的位置。在確定類似物與一個或多個靶位點結合後，使用具有足以使整合光敏類似物光碎片化的波長和強度的光線照射患者。通常，光碎片化可導致類似物的均裂，從而導致自由基中間體的產生。然後，所產生的自由基破壞已結合整合光敏類似物的靶向位點的患病組織或細胞，從而有效地治療患者病症。
在一個實施方案中，所述非光敏肽為一種由式1表示的ST(熱敏感細菌腸毒素)受體結合序列(Waldman，美國專利5,518,888)
式1的非光敏肽序列，即 AsnThrPheTyrCysCysAspLeuCysCysTyrProAlaGluAlaGlyCysAsn(SEQ ID NO6)，包含支鏈中含非光敏羥苯基部分的酪氨酸殘基。所述酪氨酸殘基的羥苯基部分被吡嗪、薁或氮雜薁的光敏部分取代，分別得到 AsnThrPheTyrCysCysAspLeuCysCysXaaProAlaGluAlaGlyCysAsn(SEQ ID NO7)(式2)、 AsnThrPheTyrCysCysAspLeuCysCysXaaProAlaGluAlaGlyCysAsn(SEQ ID NO8)(式3)或 AsnThrPheTyrCysCysAspLeuCysCysXaaProAlaGluAlaGlyCysAsn(SEQ ID NO9)(式4)。所得的類似物式2-4具有光敏性，其中R1到R3獨立地為給電子基團或吸電子基團，如氫、烷基、芳基、-OR6、-SR7、-NR8R9、-CN、-CO2R10、-NO2、-COR11、-CNR12R13、-SOR14、-SO2R15等。W為-N或-CR16。X為一種選自-(CH2)n-、-N(R17)CO(CH2)n-、-CON(R18)(CH2)n-、-N(R19)SO2(CH2)n-、-NHCONH(CH2)n-、-O(CH2)n-、-CO2(CH2)n-、-S(CH2)n-、-SO(CH2)n-、-SO2(CH2)n-和-SO2N(R20)(CH2)n-的間隔基團；n在0到10之間變化。R4到R20獨立地選自氫、C1-C6烷基、C1到C6羥基烷基、和C1到C6烷氧基烷基。本實施方案中的整合光敏肽適用於對結腸癌的診斷、預後和光線治療。
在另一個實施方案中，所述非光敏肽為一種由式5表示的生腱蛋白C結合序列(Edelberg et al.和Schneider et al.)
式5的非光敏肽序列，即 ProLeuAlaGluIleAspGlyIleGluLeuThrTyr(SEQ ID NO 10)，包含支鏈中含非光敏羥苯基部分的酪氨酸殘基。所述非光敏羥苯基部分被吡嗪、薁或氮雜薁的光敏部分取代，分別得到 ProLeuAlaGluIleAspGlyIleGluLeuThrXaa(SEQ ID NO 11)(式6)、 ProLeuAlaGluIleAspGlyIleGluLeuThrXaa(SEQ ID NO 12)(式7)或 ProLeuAlaGluIleAspGlyIleGluLeuThrXaa(SEQ ID NO 13)(式8)。所得的類似物式6-8具有光敏性，其中R1到R3獨立地為給電子基或吸電子基，如氫、烷基、芳基、-OR6、-SR7、-NR8R9、-CN、-CO2R10、-NO2、-COR11、-CNR12R13、-SOR14、-SO2R15等。W為-N或-CR16。X為一種選自-(CH2)n-、-N(R17)CO(CH2)n-、-CON(R18)(CH2)n-、-N(R19)SO2(CH2)n-、-NHCONH(CH2)n-、-O(CH2)n-、-CO2(CH2)n-、-S(CH2)n-、-SO(CH2)n-、-SO2(CH2)n-和-SO2N(R20)(CH2)n-的間隔基團；n在0到10之間變化。R4到R20獨立地選自氫、C1-C6烷基、C1到C6羥基烷基和C1到C6烷氧基烷基。本實施方案中的整合光敏肽適用於評估心肌活力和囊性纖維化。
在另一個實施方案中，所述非光敏肽靶向子宮內膜異位組織，並具有由式9表示的序列(Nothick和Mayo et al.)
式9的非光敏肽序列，即 AlaAsnIleLysLeuSerValGlnMetLysLeu(SEQ ID NO 14)，包含支鏈中含非光敏脂肪基團的穀氨醯胺殘基。所述非光敏的脂肪基團被吡嗪、薁或氮雜薁光敏部分取代，分別得到 AlaAsnIleLysLeuSerValXaaMetLysLeu(SEQ ID NO 15)(式10)、 AlaAsnIleLysLeuSerValXaaMetLysLeu(SEQ ID NO 16)(式11)或 AlaAsnIleLysLeuSerValXaaMetLysLeu(SEQ ID NO 17)(式12)。所得的類似物式10-12具有光敏性，其中R1到R3獨立地為給電子基或吸電子基，如氫、烷基、芳基、-OR6、-SR7、-NR8R9、-CN、-CO2R10、-NO2、-COR11、-CNR12R13、-SOR14、-SO2R15等。W為-N或-CR16。X為一種選自-(CH2)n-、-N(R17)CO(CH2)n-、-CON(R18)(CH2)n-、-N(R19)SO2(CH2)n-、-NHCONH(CH2)n-、-O(CH2)n-、-CO2(CH2)n-、-S(CH2)n-、-SO(CH2)n-、-SO2(CH2)n-、和-SO2N(R20)(CH2)n-的間隔基團；n在0到10之間變化。R4到R20獨立地選自氫、C1-C6烷基、C1到C6羥基烷基、和C1到C6烷氧基烷基。本實施方案中的整合光敏肽適用於子宮內膜異位診斷、預後和光線治療。
在另一個實施方案中，所述非光敏肽靶向白血病細胞，並具有由式13表示的序列
式13的非光敏肽序列SerPhePheTyrLeuArgSer(SEQ ID NO18)，包含支鏈中含非光敏羥苯基基團的酪氨酸殘基。所述非光敏的羥苯基基團被吡嗪、薁或氮雜薁的光敏部分取代，分別得到 SerPhePheXaaLeuArgSer(SEQ ID NO19)(式14)、 SerPhePheXaaLeuArgSer(SEQ ID NO20)(式15)或 SerPhePheXaaLeuArgSer(SEQ ID NO21)(式16)。所得的類似物式14-16具有光敏性，其中R1到R3獨立地為給電子基或吸電子基，如氫、烷基、芳基、-OR6、-SR7、-NR8R9、-CN、-CO2R10、-NO2、-COR11、-CNR12R13、-SOR14、-SO2R15等。W為-N或-CR16。X為一種選自-(CH2)n-、-N(R17)CO(CH2)n-、-CON(R18)(CH2)n-、-N(R19)SO2(CH2)n-、-NHCONH(CH2)n-、-O(CH2)n-、-CO2(CH2)n-、-S(CH2)n-、-SO(CH2)n-、-SO2(CH2)n-和-SO2N(R20)(CH2)n-的間隔基團；n在0到10之間變化。R4到R20獨立地選自氫、C1-C6烷基、C1到C6羥基烷基、和C1到C6烷氧基烷基。本實施方案中的整合光敏肽適用於對白血病的診斷、預後和光線治療。
光敏衍生物的合成 吡嗪、薁或氮雜薁衍生物，以及由它們衍生的整合光敏類似物通常可通過本領域已知的Strecker法或其他胺基酸合成法來製備(Wentroup et al.、Nozoe et al.和Schneider et al.)。本發明的整合光敏類似物的合成可通過本領域已知的液相或自動固相肽合成法實現(Bodansky et al.)。以下實施例中詳述的固相法一般使用於市售的多肽合成儀(例如，Applied Biosystems Model 432A SYNERGY多肽合成儀)中使用的芴基甲氧羰基(Fmoc)保護的胺基酸。如有必要，每一個肽柱體(cartridge)可包含與具有另外支鏈保護基的Fmoc-胺基酸相連的Wang樹脂。
製劑 可對本發明的整合光敏劑進行配製以用於腸內給藥(口服給藥或直腸給藥)、胃腸外給藥、局部給藥、透皮給藥或皮下給藥。局部給藥、透皮給藥和表皮給藥的製劑還可包括氣霧劑、霜劑、凝膠劑、乳劑、溶液劑或懸浮劑。進入或透過皮膚的給藥可基於已知的方法和試劑進行強化，所述試劑如經皮滲透增強劑，例如，「氮酮」、N-烷基環醯胺、二甲亞碸、長鏈脂肪酸(C10)等(Gennaro)。
製備可藥用製劑的方法可按照本領域已知的方法實現(Gennaro)。製劑可使用任一整合光敏劑，與可藥用的緩衝劑、表面活性劑、賦形劑、觸變劑、調味劑、穩定劑或經皮滲透增強劑一起製備。如果發明化合物具有水溶性，可使用生理鹽水溶液劑給藥。如果化合物不具有水溶性，可將所述化合物溶於生物相容油(例如豆油、魚油、維生素E、亞麻油、植物油、甘油酯、長鏈脂肪酸酯等)中，並於含有表面活性化合物(例如，植物或動物磷脂、卵磷脂、長鏈脂肪酸鹽和醇、聚乙二醇酯和醚等)的水中乳化，然後作為局部霜劑、懸浮劑、水/油乳劑或水/油微乳劑給藥。
整合光敏劑還可封裝進膠團、脂質體、納米顆粒、殼交聯納米顆粒、樹枝狀聚合物、樹枝狀結晶、微膠囊或其他組織化微粒中，並通過前述任一途徑給藥。整合光敏劑也可與納米顆粒、殼交聯納米顆粒、樹枝狀聚合物或樹枝狀結晶化學綴合，以同時產生整合光子效應和多價生物效應。這些製劑可增強所述試劑在體內的穩定性。封裝法包括清潔劑透析、冷凍乾燥、成膜或注射(Janoff et al.)。製造脂質體和在其中封裝各種分子的方法為本領域所公知(Braun-Falco et al.和Lasic et al.)。
劑量 含有本發明整合光敏類似物的組合物可以單劑量或多劑量給藥以達到有效診斷或治療的目地。給藥後，整合光敏類似物於靶組織處聚集，並且將選定的靶位點暴露在具有足夠能量和強度以作出診斷和/或治療的光線之下。所述劑量可根據所用的特定整合光敏類似物、檢查的器官或組織、臨床程序中所用的器材、達到的治療效果等在寬的範圍內變化。所述化合物的劑量可在約0.1mg/kg體重到約500mg/kg體重之間變化，通常為約0.5mg/kg體重到約2mg/kg體重。對於胃腸外給藥而言，無菌液或懸浮液含有濃度範圍為約1nM到約0.5M的整合光敏劑。在另一個實例中，無菌液或懸浮液含有濃度範圍為約1μM到約0.5mM的整合光敏劑。
儘管本發明可有利地以小分子的形式應用，但所述方法也可用於任何生物活性分子，大小均可。本發明適用於各種生物醫學光學應用，包括但不局限於平面成像、光學層析成像、光學相干斷層成像、內窺鏡探查、光聲技術、聲致螢光技術、光散射技術、雷射輔助導航手術(LAGS)、共聚焦顯微鏡技術、動態器官功能監測和光線治療。
縮寫和定義 為幫助理解本發明，一些術語定義如下 本文使用的二十個遺傳編碼α-胺基酸的胺基酸符號均為常規符號，縮寫如下

除非另有注釋，否則當肽序列以一系列單字母和/或三字母縮寫出現時，根據常規做法，序列按照從氨基到羧基的方向呈現。
「診斷有效量」意指所討論的物質的用量，對於大部分患者而言，如果在給藥患者的體內存在，應為能夠檢測細胞靶向組織的物質的合適量。術語「有效量」也意味著所給予的物質的量僅對用藥對象產生輕微副作用或無副作用，或鑑於該物質所作用的疾病的嚴重程度，所述副作用從醫學和藥學的角度來看可以忍受。
「整合非光敏官能團」是指在350-1200nm範圍內不顯現激發峰和發射峰的生物活性分子內的官能團。
「光敏官能團」或「光敏部分」是指在350-1200nm波長範圍內顯現吸收、激發、發射最大值的任何官能團或部分。這樣的官能團或部分包括但不局限於螢光團、發色團、光敏劑和光反應部分，其中「螢光團」、「發色團」、「光敏劑」、和「光反應部分」具有本領域通常理解的含義。
「光反應部分」是指分子的一部分，當用350到1200nm波長的光激發時，其能進行光化學反應以產生能造成組織損傷的反應活性物。
「假肽」是一種改性肽序列，其中肽鍵或胺基酸支鏈被局部改性。
「治療有效量」是指在用各藥劑進行治療期間各藥劑能達到改善病情嚴重程度和發生頻率的目的、同時避免通常與備選治療有關的不良副作用的量。
「治療」是指任一方法、行為、應用、治療等，其中提供給包括人在內的受試者以醫療援助，以達到直接地或者間接地改善該受試者的病症或減慢所述受試者體內病理狀態進程的目的。
當介紹本發明及其實施方案的要素時，詞語「a(一)」、「an(一個)」和「the(該)」意欲表示一個或多個要素。術語「包括」、「包含」和「含有」意欲為包含在內，並意指除所列要素外可還有其它要素。
下面的實施例對本發明的具體實施方案進行了說明。對技術人員顯而易見的是，各種變化方案和修改方案都是可行的，並且意欲包括在本發明描述的範圍內。
實施例1 式2-4的整合光敏ST受體結合肽的製備 為合成與ST受體結合的整合光敏類似物，第一柱體包含與Fmoc-Asn羧基端綴合的Wang樹脂。胺基酸柱體2-7分別包含Fmoc-Cys(Acm)、Fmoc-Gly、Fmoc-Ala、Fmoc-Glu(γ-O-t-Bu)、Fmoc-Ala和Fmoc-Pro；且柱體9-18分別包含Fmoc-Cys(Acm)、Fmoc-Cys(Acm)、Fmoc-Leu、Fmoc-Asp(β-O-t-Bu)、Fmoc-Cys(Acm)、Fmoc-Cys(Acm)、Fmoc-Tyr(O-t-Bu)、Fmoc-Phe、Fmoc-Thr(O-t-Bu)和Fmoc-Asn。第八柱體包含光敏Fmoc-保護的胺基酸殘基。將所述胺基酸柱體置於多肽合成儀上，從C-端位置到N-端位置合成肽。偶合反應在2-(1H-苯並三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)/N-羥基-苯並三唑(HOBt)的存在下進行。用20％的哌啶二甲基甲醯胺溶液脫除Fmoc保護基，並用含三氟乙酸∶水∶苯酚∶茴香硫醚(85∶5∶5∶5)的裂解混合物將產物與固體支持物分離。裂解反應通常約6小時反應完全。所得肽用叔丁基甲基醚沉澱，用HPLC純化，並冷凍乾燥。
實施例2 式6-8的整合光敏生腱蛋白C結合肽的製備 為合成光敏生腱蛋白C結合肽，胺基酸柱體2-12分別包含Fmoc-Thr(O-t-Bu)、Fmoc-Leu、Fmoc-Glu(γ-O-t-Bu)、Fmoc-Ile、Fmoc-Gly、Fmoc-Asp(β-O-t-Bu)、Fmoc-Ile、Fmoc-Glu(γ-O-t-Bu)、Fmoc-Ala、Fmoc-Leu、Fmoc-Pro。第一柱體包含與光敏Fmoc保護胺基酸殘基綴合的Wang樹脂。按與實施例1描述的相同方式進行肽的合成、裂解和純化。
實施例3 式10-12的整合光敏子宮內膜異位肽的製備 為合成光敏子宮內膜異位肽，第一柱體包含與Fmoc-Leu羧基端綴合的Wang樹脂。胺基酸柱體2和3分別包含Fmoc-Lys(ε-t-Boc)和Fmoc-Met；柱體5-11分別包含Fmoc-Val、Fmoc-Ser(O-t-Bu)、Fmoc-Leu、Fmoc-Lys(ε-t-Boc)、Fmoc-Ile、Fmoc-Asn和Fmoc-Ala。第四柱體包含光敏Fmoc-保護的胺基酸殘基。按實施例1描述的相同方式進行肽的合成、裂解和純化。
實施例4 式14-16的整合光敏白血病細胞結合肽的製備 為合成光敏白血病細胞結合肽，第一柱體包含與Fmoc-Ser(O-t-Bu)羧基端綴合的Wang樹脂。胺基酸柱體2和3分別包含Fmoc-Arg(O-t-Bu)和Fmoc-Leu；柱體5-7分別包含Fmoc-Phe、Fmoc-Phe和Fmoc-Ser(O-t-Bu)。第四柱體包含光敏Fmoc-保護的胺基酸殘基。按實施例1描述的相同方式進行肽的合成、裂解和純化。
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序列表
馬林克羅特公司
整合光敏肽及其應用
H-MI-00104
21
PatentIn version 3.4
1
12
PRT
人工序列

人工合成肽
1
Pro Leu Ala Glu Ile Asp Gly Ile Glu Leu Thr Tyr
1 5 10
2
11
PRT
人工序列

人工合成肽
2
Ala Asn Ile Lys Leu Ser Val Gln Met Lys Leu
1 5 10
3
6
PRT
人工序列

人工合成肽
3
Ser Val Gln Met Lys Leu
1 5
4
9
PRT
人工序列

人工合成肽
4
Ile Lys Leu Ser Val Gln Met Lys Leu
1 5
5
10
PRT
人工序列

人工合成肽
5
Asn Ile Lys Leu Ser Val Gln Met Lys Leu
1 5 10
6
18
PRT
人工序列

人工合成肽
6
Asn Thr Phe Tyr Cys Cys Asp Leu Cys Cys Tyr Pro Ala Glu Ala Gly
1 5 10 15
Cys Asn
7
18
PRT
人工序列

含有吡嗪支鏈的改性胺基酸殘基

MISC_FEATURE
(11)..(11)
Xaa＝吡嗪
7
Asn Thr Phe Tyr Cys Cys Asp Leu Cys Cys Xaa Pro Ala Glu Ala Gly
1 5 10 15
Cys Asn
8
18
PRT
人工序列

含有薁支鏈的改性胺基酸殘基

MISC_FEATURE
(11)..(11)
Xaa＝薁
8
Asn Thr Phe Tyr Cys Cys Asp Leu Cys Cys Xaa Pro Ala Glu Ala Gly
1 5 10 15
Cys Asn
9
18
PRT
人工序列

含有氮雜薁支鏈的改性胺基酸殘基

MISC_FEATURE
(11)..(11)
Xaa＝氮雜薁
9
Asn Thr Phe Tyr Cys Cys Asp Leu Cys Cys Xaa Pro Ala Glu Ala Gly
1 5 10 15
Cys Asn
10
12
PRT
人工序列

人工合成肽
10
Pro Leu Ala Glu Ile Asp Gly Ile Glu Leu Thr Tyr
1 5 10
11
12
PRT
人工序列

含有吡嗪支鏈的改性胺基酸殘基

MISC_FEATURE
(12)..(12)
Xaa＝吡嗪
11
Pro Leu Ala Glu Ile Asp Gly Ile Glu Leu Thr Xaa
1 5 10
12
12
PRT
人工序列

含有薁支鏈的改性胺基酸殘基

MISC_FEATURE
(12)..(12)
Xaa＝薁
12
Pro Leu Ala Glu Ile Asp Gly Ile Glu Leu Thr Xaa
1 5 10
13
12
PRT
人工序列

含有氮雜薁支鏈的改性胺基酸殘基

MISC_FEATURE
(12)..(12)
Xaa＝氮雜薁
13
Pro Leu Ala Glu Ile Asp Gly Ile Glu Leu Thr Xaa
1 5 10
14
11
PRT
人工序列

人工合成肽
14
Ala Asn Ile Lys Leu Ser Val Gln Met Lys Leu
1 5 10
15
11
PRT
人工序列

含有吡嗪支鏈的改性胺基酸殘基

MISC_FEATURE
(8)..(8)
Xaa＝吡嗪
15
Ala Asn Ile Lys Leu Ser Val Xaa Met Lys Leu
1 5 10
16
11
PRT
人工序列

含有薁支鏈的改性胺基酸殘基

MISC_FEATURE
(8)..(8)
Xaa＝薁
16
Ala Asn Ile Lys Leu Ser Val Xaa Met Lys Leu
1 5 10
17
11
PRT
人工序列

含有氮雜薁支鏈的改性胺基酸殘基

MISC_FEATURE
(8)..(8)
Xaa＝氮雜薁
17
Ala Asn Ile Lys Leu Ser Val Xaa Met Lys Leu
1 5 10
18
7
PRT
人工序列

人工合成肽
18
Ser Phe Phe Tyr Leu Arg Ser
1 5
19
7
PRT
人工序列

含有吡嗪支鏈的改性胺基酸殘基

MISC_FEATURE
(4)..(4)
Xaa＝吡嗪
19
Ser Phe Phe Xaa Leu Arg Ser
1 5
20
7
PRT
人工序列

含有薁支鏈的改性胺基酸殘基

MISC_FEATURE
(4)..(4)
Xaa＝薁
20
Ser Phe Phe Xaa Leu Arg Ser
1 5
21
7
PRT
人工序列

含有氮雜薁支鏈的改性胺基酸殘基

MISC_FEATURE
(4)..(4)
Xaa＝氮雜薁
21
Ser Phe Phe Xaa Leu Arg Ser
1 權利要求
1.一種產生非光敏肽或假肽的整合光敏類似物的方法，所述方法包括用光敏官能團取代所述非光敏肽或假肽的非光敏官能團。
2.權利要求1的方法，其中所述光敏官能團選自烯烴、苯、萘、萘醌、芴、蒽、蒽醌、菲、並四苯、並四苯二酮、吡啶、喹啉、喹嗪、喹喔啉、奎尼丁、蝶啶、異喹啉、吲哚、異吲哚、吡咯、咪唑、噁唑、噻唑、吡唑、吡嗪、嘌呤、苯並咪唑、呋喃、苯並呋喃、二苯並呋喃、咔唑、吖啶、吖啶酮、菲啶、噻吩、苯並噻吩、二苯並噻吩、呫噸、呫噸酮、黃酮、蒽環類物；薁和氮雜薁、吲哚菁、苯並卟啉、方酸、咕啉、香豆素和菁。
3.權利要求1的方法，其中所述光敏官能團是一種選自以下的光反應部分疊氮化物、偶氮化合物、重氮化合物、亞磺酸酯、噻二唑、過氧化物、酞菁、卟啉、擴展卟啉、苯並卟啉和形成這些基團的自由基或反應中間體。
4.上述權利要求任一項的方法，其中所述非光敏官能團是芳族或雜芳族。
5.上述權利要求任一項的方法，其中所述非光敏官能團是羥苯基、吲哚基或苯基。
6.上述權利要求任一項的方法，其中所述非光敏官能團是酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸或組氨酸殘基的支鏈部分。
7.權利要求1的方法，其中所述光敏官能團選自下式的部分，其中
R1到R3獨立地為氫、烷基、芳基、-OR4、-SR5、-NR6R7、-CN、-CO2R8、-NO2、-COR9、-CNR10R11、-SOR12或-SO2R13；
W為N或-CR16；
X為-(CH2)n-、-N(R17)CO(CH2)n-、-CON(R18)(CH2)n-、-N(R19)SO2(CH2)n-、-NHCONH(CH2)n-、-O(CH2)n-、-CO2(CH2)n-、-S(CH2)n-、-SO(CH2)n-、-SO2(CH2)n-或-SO2N(R20)(CH2)n-；
R4到R20獨立地為氫、C1-C6烷基、C1到C6羥基烷基、和C1到C6烷氧基烷基；並且
n在0到10之間變化。
8.權利要求1的方法，其中所述整合光敏類似物具有下式，其中
R21是光敏官能團；
R22是氫、α-胺基酸殘基、或兩個或多個α-胺基酸殘基的序列；並且
R23是-OH、α-胺基酸殘基、和兩個或多個α-胺基酸殘基的序列。
9.權利要求8的方法，其中
是酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸或組氨酸殘基的光敏類似物。
10.權利要求8的方法，其中所述整合光敏類似物包括靶向患病組織、細胞或受體的肽或假肽靶向基團。
11.權利要求10的方法，其中所述患病的組織或細胞選自癌組織、白血病細胞、纖維化上皮細胞、囊性纖維化組織和子宮內膜異位組織。
12.權利要求10的方法，其中所述肽或假肽靶向基團包含ST受體靶向基團。
13.權利要求10的方法，其中所述肽或假肽靶向基團為選自SEQID NO 7、SEQ ID NO 8和SEQ ID NO 9的序列。
14.權利要求10的方法，其中所述肽或假肽靶向基團包含生腱蛋白C靶向基團。
15.權利要求10的方法，其中所述肽或假肽靶向基團為選自SEQID NO 11、SEQ ID NO 12和SEQ ID NO 13的序列。
16.權利要求10的方法，其中所述肽或假肽靶向基團包含子宮內膜異位靶向基團。
17.權利要求10的方法，其中所述肽或假肽靶向基團為選自SEQID NO 15、SEQ ID NO 16和SEQ ID NO 17的序列。
18.權利要求10的方法，其中所述肽或假肽靶向基團包含白血病細胞靶向基團。
19.權利要求10的方法，其中所述肽或假肽靶向基團為選自SEQID NO 19、SEQ ID NO 20和SEQ ID NO 21的序列。
20.上述權利要求任一項的整合光敏類似物，用於醫學診斷程序。
21.權利要求20的類似物，其中所述診斷程序包括使患者暴露于波長為約350nm到約1200nm的光線下。
22.權利要求20的類似物，其中所述診斷程序包括使患者暴露于波長為約400nm到約900nm的光線下。
23.權利要求20-22中任一項的類似物，其中所述診斷程序包括觀測從患者發射出的光線。
24.上述權利要求任一項的整合光敏類似物，用於醫學光線治療程序。
25.權利要求24的類似物，其中所述光線治療是一種對選自癌組織、白血病細胞、纖維化上皮細胞、囊性纖維化組織和子宮內膜異位組織的患病組織或細胞的治療療法。
全文摘要
本發明涉及將已知結構和功能的生物活性化合物轉化成光敏分子，以保留原生物活性的一般方法。通過將光敏性和生物功能兩個基本性質整合進單個分子實體中產生的分子下文統稱為「整合光敏類似物」或「整合光敏肽或假肽」。設計整合光敏類似物的一般方法主要包括(a)選擇需要的生物活性肽或假肽；(b)確定所述分子含有芳族或雜芳族基序的區域；和(c)用尺寸相似的光敏官能團取代所述基序，或對所述基序進行改性使其具有光敏性。其他方面包括光敏類似物化合物及其光線診斷和光線治療應用。
文檔編號A61K41/00GK101626786SQ200880006840
公開日2010年1月13日 申請日期2008年2月26日 優先權日2007年3月1日
發明者R·拉傑戈帕蘭, W·L·紐曼, R·B·多肖 申請人:馬林克羅特公司