一種重組阿魏酸酯酶的製備方法
2023-09-17 13:43:55 6
一種重組阿魏酸酯酶的製備方法
【專利摘要】本發明公開了一種重組阿魏酸酯酶的製備方法，利用阿魏酸酯酶O42807，密碼子優化後人工合成其基因fae、構建pAO815-fae表達載體、構建pPIC9K-fae表達載體以及將pPIC9K-fae表達載體轉化至畢赤酵母GS115中表達，得到重組阿魏酸酯酶，SDS-PAGE分析顯示其發酵上清液為單一條帶，表觀分子量為42kDa，酶活為4.7U/mL，比酶活力為31.4U/mg，最適反應溫度為50℃，最適pH為5.0～5.5。本發明獲得了1株高效表達的重組阿魏酸酯酶轉化子，與阿魏酸酯酶O42807相比其表達效率和表達量大大提高。
【專利說明】-種重組阿魏酸酯酶的製備方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種重組阿魏酸酯酶的製備方法。
【背景技術】
[0002] 植物細胞壁中，酚酸類物質（如阿魏酸、咖啡酸、對香豆酸等）通過酯鍵與多糖 (如阿拉伯木聚糖、果糖）的阿拉伯糖基或半乳糖基相連，或者通過醚鍵與木質素相連，形 成緻密的網狀結構。阿魏酸酯酶（EC 3. 1. 1.73, Ferul ic acid esterases, FAE)又名肉桂 酸酯酶，它能水解阿魏酸酯、低聚糖阿魏酸酯和多糖阿魏酸酯中的酯鍵，釋放出阿魏酸等功 能性物質。阿魏酸酯酶可以輔助木聚糖酶、木質素酶破壞這種緻密的網狀結構，使細胞壁結 構變得疏鬆，從而促進木質纖維素完全降解。在工業和農業中阿魏酸酯酶均有重要作用。
[0003] 至今已經從細菌和真菌中分離得到40多種阿魏酸酯酶，但目前報導的阿魏酸酯 酶的酶活及表達量都達不到工業需要。其次，阿魏酸酯酶的分離提取過程相對複雜，難以滿 足工業化生產。隨著分子生物學的發展，已經有多個阿魏酸酯酶編碼基因被克隆，利用現代 生物學技術來改良微生物，使獲得高產阿魏酸酯酶菌株成為可能。畢赤酵母表達系統比大 腸桿菌體系有更完備的基因表達調控機制及對表達產物的加工修飾能力，並具有原核細胞 系統生長速度快、便於基因操作和可工業化大規模培養等優點。畢赤酵母可高密度的發酵 培養，其菌體量可達130g/L幹細胞重，其在生產單細胞蛋白動物飼料方面發揮重要作用。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的在於克服現有技術的不足之處，提供了一種重組阿魏酸酯酶的製備 方法，構建了分泌型重組質粒pPIC9K-fae，獲得了 1株高效表達的重組阿魏酸酯酶轉化子， 與阿魏酸酯酶042807相比其表達效率和表達量大大提高。
[0005] 本發明解決其技術問題所採用的技術方案之一是：
[0006] -種重組阿魏酸酯酶的製備方法，包括：
[0007] 1)獲得目的基因fae :根據阿魏酸酯酶的胺基酸序列，以畢赤酵母標準密碼子優 化設計阿魏酸酯酶的基因序列，並在基因序列的兩端分別引入Hindlll和EcoR I酶切位點， 化學合成如SEQ ID NO. 1所示的基因序列，命名為fae ;
[0008] 2)構建pA0815_fae表達載體：用Hind III和EcoR I雙酶切合成的基因序列fae， 連接到經同樣雙酶切的PA0815上並轉化至E. coli DH5 a感受態細胞，得到重組質粒命名 為 pA0815_fae ;
[0009] 3)構建pPIC9K_fae表達載體：以重組質粒pA0815_fae為模板進行PCR擴增，PCR 產物用SnaB I和Not I雙酶切，連接到經同樣雙酶切的pPIC9K上並轉化至E. coli DH5 a 感受態細胞，得到重組質粒命名為pPIC9K_fae ;
[0010] 4) fae在畢赤酵母中表達：用Bgl II線性化pPIC9K_fae，電轉化畢赤酵母GS115， 塗布於MD平板，篩選MD平板上生長良好的菌落點種至含G418的YH)搖瓶中，篩選抗G418 的重組子，命名為GS115/pPIC9K-fae ;根據畢赤酵母操作表達手冊進行GS115/pPIC9K-fae 的誘導表達，得到重組阿魏酸酯酶。
[0011] 一實施例中：所述步驟1)中，根據阿魏酸酯酶042807成熟肽的胺基酸序列， 以畢赤酵母標準密碼子優化設計阿魏酸酯酶的基因序列，並在基因序列的兩端分別引入 把11(1111和￡(3〇1?1酶切位點，化學合成如3￡0 10勵.1所示的基因序列，命名為€&6。
[0012] 一實施例中：所述步驟3)中PCR擴增條件為：
[0013] 上遊引物：如SEQIDN0. 3所示；
[0014] 下遊引物：如SEQ ID NO. 4所示；
[0015] 反應條件：93?95°C變性29?31s，54?56°C退火29?31s，71?73°C延伸 0.9?1. lmin，重複所述變性-退火-延伸共29?31個循環後，71?73°C延伸9. 9? 10.lmin〇
[0016] 本發明解決其技術問題所採用的技術方案之二是：
[0017] 一種重組阿魏酸酯酶，所述重組阿魏酸酯酶的基因序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0018] 本技術方案與【背景技術】相比，它具有如下優點：
[0019] 本發明的一種重組阿魏酸酯酶的製備方法成功構建了分泌型重組質粒 pPIC9K-fae，獲得了 1株高效表達的重組阿魏酸酯酶轉化子，與阿魏酸酯酶042807相比其 表達效率和表達量大大提高；得到的重組阿魏酸酯酶SDS-PAGE分析顯示其為單一條帶，表 觀分子量為42kDa，酶活為4. 7U/mL，比酶活力為31. 4U/mg，最適反應溫度為50°C，最適pH 為 5. 0 ?5. 5。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0020] 下面結合附圖和實施例對本發明作進一步說明。
[0021] 圖1所示為表達載體pA0815_fae示意圖。
[0022] 圖2所示為表達載體pPIC9K_fae示意圖。
[0023] 圖3所示為GS115/pPIC9K_fae轉化子PCR電泳圖譜。
[0024] 泳道1 :以pPIC9K_fae質粒為模板；泳道2 :以無菌水為對照；泳道3 :DNAMarker ; 泳道4?8 :以GS115/pPIC9K-fae轉化子為模板；泳道9 :以質粒pPIC9K轉化菌株GS115/9K 為模板。
[0025] 圖4所示為SDS-PAGE分析產物的表達。
[0026] 泳道1 :GS115/pPIC9K發酵上清液；泳道2 :蛋白Marker ;泳道3?10 :重組子 GS115/pPIC9K-fae 經誘導培養 0、12、24、48、72、96、120、144h 的發酵上清液。
[0027] 圖5所示為GS115/pPIC9k_fae表達量的測定。
[0028] 圖6所示為溫度對重組阿魏酸酯酶活性的影響。
[0029] 圖7所示為pH對重組阿魏酸酯酶活性的影響
【具體實施方式】
[0030] 下面通過實施例具體說明本發明的內容：
[0031] 實施例1 :重組阿魏酸酯酶的製備
[0032] 1)獲得目的基因fae :UniProt資料庫中篩選高酶活的阿魏酸酯酶042807的氨基 酸序列，該阿魏酸酯酶042807是De Vries RP等從黑麴黴（Aspergillus niger)CBS120. 49 中分離得到的，屬於胞外酶；阿魏酸酯酶042807的胺基酸序列如SEQ ID NO. 2所示，根據 042087的成熟肽序列（如SEQ ID NO. 2所示，22?281為成熟肽序列）以畢赤酵母標準密 碼子優化設計阿魏酸酯酶的基因序列，並在基因序列的兩端分別引入HindIII和EcoRI酶 切位點，化學合成如SEQ ID NO. 1所示的基因序列，命名為fae ;
[0033] 2)構建pA0815_fae表達載體：用HindIII和EcoRI分別雙酶切合成的基因序列 fae和質粒pA0815,膠回收雙酶切片段後用T4DNA連接酶連接並轉化至E. coli DH5a感受 態細胞，轉化具體條件如下：取200 iiL的E. coli DH5 a感受態細胞與10 yL連接產物（即 上述雙酶切片段）混勻，冰浴30min ;於42°C下熱激45s，迅速冰浴靜置5min ;加入800iiL LB液體培養基，於37°C搖床上低速搖動lh，6000rpm離心2min，去部分上清，留下約200 ii L 上清；重懸細胞沉澱並塗布含100 U g/mL Amp的LB平板，37°C倒置培養14?16h，篩選出 的陽性克隆子（長出的菌落）由Sangon(生工生物工程（上海）股份有限公司）測序，測 序正確的重組質粒命名為pA0815_fae (如圖1所示）；
[0034] 3)構建pPIC9K_fae表達載體：以重組質粒pA0815_fae為模板，採用上遊引物5' -TACGTAGCCTCTACTCAGGGGATCAGT-3'（如SEQ ID N0. 3所示）及下遊引物5'-AATATGCGGCCGC TTACCAAGTACAAGCCCCG-3'（如 SEQ ID NO. 4 所示）進行擴增，PCR 反應條件：94°C變性 30s， 55°C退火30s，72°C延伸lmin，重複所述變性-退火-延伸共30個循環後，72°C延伸10min。 PCR產物經膠回收用SnaB I和Not I雙酶切，連接到經同樣雙酶切的pPIC9K上並轉化至 E. coli DH5 a感受態細胞，轉化具體條件同2)，篩選出的陽性克隆子由Sangon測序，測序 正確的重組質粒命名為pPIC9K_fae (如圖2所示）；
[0035] 4) fae在畢赤酵母中表達：用BglII線性化pPIC9K_fae，所述線性化具體條件為： 利用Bgl II將pPIC9K-fae於37°C水浴4h進行單酶切線性化，酶切體系為：10XTango Buffer 2 ii L、pPIC9K-fae 10 ii L、無菌水7 ii L、Bgl II 1 ii L。線性化後電轉化至畢赤酵 母GS115,所述電轉化具體條件為：取80 y L畢赤酵母GS115感受態細胞與線性化的DNA輕 輕混勻，轉移到冰上預冷的0. 2cm的電轉杯中；冰上放置5min，1. 5KV?1. 7KV、200 Q電擊 5ms，立即加入lmL預冷的1M的山梨醇，轉入2mL EP管中28?30°C靜置培養1?2h;力口 入lmL YH)液體培養基30°C、200rpm搖4h ;塗布於MD平板上篩選重組子，取MD平板上生 長良好的菌落用牙籤點種至含G418的YH)搖瓶中，篩選抗G418的重組子，命名為GS115/ pPIC9K_fae ;根據Invitrogen公司畢赤酵母操作表達手冊進行GS115/pPIC9K_fae的誘導 表達，得到重組阿魏酸酯酶。
[0036] 實施例 2 :GS115/pPIC9K_fae 的鑑定
[0037] 提取實施例1中得到的GS115/pPIC9K_fae的基因組DNA，利用通用引物5' A0X和 3' A0X進行PCR鑑定，結果如圖3所示，GS115/pPIC9K-fae構建成功。
[0038] 實施例3 :GS115/pPIC9K_fae表達量的測定
[0039] 重組酵母GS115/pPIC9K_fae的誘導表達參考Invitrogen公司畢赤酵母操作表達 手冊，甲醇誘導每隔12h或24h，取發酵上清液進行SDS-PAGE分析，以測定重組阿魏酸酯酶 表達量。如圖4所示，在42kDa得到一條清晰條帶，而且幾乎沒有雜條帶，初步說明fae得 到成功表達。利用Bradford法測定重組阿魏酸酯酶蛋白含量，HPLC法測定酶活，測定結果 如圖5所示,酶活為4. 7U/mL,比酶活力為31. 4U/mg,。
[0040] 實施例4 :重組阿魏酸酯酶粗酶酶學性質的研究
[0041] 1)最適反應溫度的測定：取250i! L實施例1中得到的重組阿魏酸酯酶酶液保溫 5min後，加入250iiL阿魏酸甲酯溶液（由pH5. 0檸檬酸-磷酸氫二鈉緩衝溶液配置），在 40?70°C中反應lOmin，測定重組阿魏酸酯酶的酶活；以所測的最高酶活為100%，計算相 對酶活並繪製相對酶活-pH值曲線；如圖6所示，50°C之前重組阿魏酸酯酶的酶活較高，相 對酶活都在80%以上；重組阿魏酸酯酶的最適作用溫度為50°C。超過50°C後重組阿魏酸 酯酶的酶活下降較快。
[0042] 2)最適反應pH值的測定：取250 ii L實施例1中得到的重組阿魏酸酯酶酶液50°C 保溫5min後，加入250 ii L的阿魏酸甲酯溶液（0. 2mol/L的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩衝溶液調 節pH在4. 0?7. 0之間），50°C下反應lOmin，測定殘留酶活；以所測的最高酶活為100%， 計算相對酶活並繪製相對酶活-pH值曲線；如圖7所示，pH為5. 0?5. 5,重組阿魏酸酯酶 的酶活最大。
[0043] 以上所述，僅為本發明較佳實施例而已，故不能依此限定本發明實施的範圍，即依 本發明專利範圍及說明書內容所作的等效變化與修飾，皆應仍屬本發明涵蓋的範圍內。
【權利要求】
1. 一種重組阿魏酸酯酶的製備方法，其特徵在於：包括： 1) 獲得目的基因 fae :根據阿魏酸酯酶的胺基酸序列，以畢赤酵母標準密碼子優化設 計阿魏酸酯酶的基因序列，並在基因序列的兩端分別引入Hind III和EcoR I酶切位點，化 學合成如SEQ ID NO. 1所示的基因序列，命名為fae ; 2) 構建pA0815_fae表達載體：用Hind III和EcoR I雙酶切合成的基因序列fae，連 接到經同樣雙酶切的PA0815上並轉化至E. coli DH5 a感受態細胞，得到重組質粒命名為 pA0815-fae； 3) 構建pPIC9K-fae表達載體：以重組質粒pA0815-fae為模板進行PCR擴增，PCR產 物用SnaB I和Not I雙酶切，連接到經同樣雙酶切的pPIC9K上並轉化至E. coliDH5 a 感受態細胞，得到重組質粒命名為pPIC9K_fae ; 4. fae在畢赤酵母中表達：用Bgl II線性化pPIC9K_fae，電轉化畢赤酵母GS115,塗布 於MD平板，篩選MD平板上生長良好的菌落點種至含G418的YTO搖瓶中，篩選抗G418的重 組子，命名為GS115/pPIC9K-fae ;根據畢赤酵母操作表達手冊進行GS115/pPIC9K-fae的誘 導表達，得到重組阿魏酸酯酶。
2. 根據權利要求1所述的一種重組阿魏酸酯酶的製備方法，其特徵在於：所述步驟1) 中，根據阿魏酸酯酶042807成熟肽的胺基酸序列，以畢赤酵母標準密碼子優化設計阿魏酸 酯酶的基因序列，並在基因序列的兩端分別引入Hind III和EcoR I酶切位點，化學合成如 SEQ ID NO. 1所示的基因序列，命名為fae。
3. 根據權利要求1所述的一種重組阿魏酸酯酶的製備方法，其特徵在於：所述步驟3) 中PCR擴增條件為： 上遊引物：如SEQ ID N0. 3所示； 下遊引物：如SEQ ID NO. 4所示； 反應條件：93?95°C變性29?31s，54?56°C退火29?31s，71?73°C延伸0? 9? 1. lmin，重複所述變性-退火-延伸共29?31個循環後，71?73°C延伸9. 9?10. lmin。
4. 一種重組阿魏酸酯酶，其特徵在於：所述重組阿魏酸酯酶的基因序列如SEQ ID NO. 1 所示。
【文檔編號】C12N9/18GK104450644SQ201410724759
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月3日 優先權日:2014年12月3日
【發明者】李夏蘭, 張光亞, 陳雲華, 陳培欽, 葛慧華 申請人:華僑大學