一種左旋多巴結晶粉末及其製造方法與流程
2023-09-18 09:03:00
本發明涉及生物化工及分離純化領域，具體地說涉及一種左旋多巴結晶粉末及其製造方法。
背景技術：
：左旋多巴(3，4-dihydroxylphenylalanine，Levodopa)，又稱L-多巴，化學名稱為3，4-二羥基苯基丙氨酸，CAS：59-92-7；白色結晶性粉末，無臭無味；是生物體內一種重要的生物活性物質，是L-酪氨酸到兒茶酚或黑色素的生化代謝途徑過程中的重要中間產物。其結構式如下：左旋多巴及複方左旋多巴(如美多芭)治療常見老年病帕金森氏病己有40多年的歷史，至今仍是治療帕金森病最有效的藥物，且耐受性好，不但能改善運動遲緩，緩解主要症狀，而且能延長帕金森病患者的壽命。左旋多巴2007年在世界暢銷藥中排名100，2009年實現全球產量達到250噸，2010年銷售金額己超過15億美元。2015年全球產量接近1000噸，銷售額超過30多億美金。國內外科學家正在不斷努力提高左旋多巴的生產產量。據報導，左旋多巴的生產方法有天然植物提取法、化學合成法和微生物酶轉化法。傳統的製取方法是從植物貓豆中經科學提取的，中國專利CN103641730A公布了一種左旋多巴的製備方法，通過機械壓扁貓豆，用醋酸水浸提，浸提液用三氯醋酸去除蛋白，濃縮成膏，用水溶解，調節pH至等電點析出粗結晶，用熱酸水溶解，活性炭脫色，室溫重結晶。中國專利CN103664669A公布了一種製備高純度左旋多巴的工藝方法，以貓豆為原料，用酸水提取，提取液通過電滲析，對左旋多巴進行富集和分離。植物提取法由於受到原料來源的限制，產量小，遠不能滿足當前市場需求。左旋多巴的化學合成較多。目前，工業化生產左旋多巴原料藥的化學方法源於1987年，vanillin(香草醛)以及hydantoin(乙內醯脲)，需要經過8步的反應製得。但遇到一個主要的困難是合成出來的產品是D-型和L-型的混合物，將二者分開的過程控制難度大，同時存在生產成本高、環境汙染嚴重等問題。利用微生物生產左旋多巴，就是利用了代謝途徑中的某些酶，如酪氨酸酶、酪氨酸酚裂解酶、轉移酶將不同的底物轉變成左旋多巴，可獲得大量的左旋多巴，許多國家對其生產進行了大量的研究，採取了許多不同的合成方法。上世紀60年代末，國外一些學者開始致力於微生物酶法合成左旋多巴的研究。70年代初，日本學者Yamada等對微生物酶法合成左旋多巴進行了深入的研究，通過菌種選育和發酵條件的優化於1993年在味之素公司投入工業化生產。中國專利CN103122361A公布了通過構建重組工程菌株，提供一種以L-酪氨酸為底物合成左旋多巴的方法。中國專利CN104726513A公布了一種酶法製備左旋多巴的方法，以嗜麥芽假單胞菌(Pseudomonasmaltophilia)生產酪氨酸酶，以L-酪氨酸為原料轉化製備左旋多巴。然而，目前利用生物法製備左旋多巴實現工業化的報導並不多見。現有的生物法製備左旋多巴存在反應時間長，副產物較多，轉化率低，底物殘留濃度高，成品色澤較差，結晶度較低，雜質含量高等一系列問題。技術實現要素：發明目的：本發明的目的是提供一種高收率，適用於工業化生產的左旋多巴結晶粉的製造方法，本發明還有一個目的是提供前述方法生產獲得的高純度、高結晶度、高透光率的左旋多巴結晶粉末。技術方案：為了實現上述發明目的，本發明的一種左旋多巴結晶粉末的製造方法，通過酪氨酸酚裂解酶生物轉化獲得含有左旋多巴、酪氨酸酚裂解酶、殘留底物、蛋白、色素、鹽類的鹼性混合溶液，用酸液將混合溶液pH調至偏酸性，離心或過濾收集粗晶體，然後繼續調酸復溶、加入活性炭後升溫攪拌脫色，過濾清液再調鹼結晶、過濾後乾燥，獲得左旋多巴結晶粉末。本發明是基於酪氨酸酚裂解法反應獲得的混合溶液進行左旋多巴結晶粉末的分離和純化。所述酪氨酸酚裂解酶酶法是採用酪氨酸酚裂解酶在輔酶(5-磷酸吡哆醛)存在的條件下，與基礎底物攪拌混合，反應產生左旋多巴。基礎底物為鄰苯二酚/丙酮酸銨或鄰苯二酚/丙酮酸/濃氨水。如式(I)所示，酪氨酸酚裂解酶在NH4+過量存在的條件下，可將一分子的鄰苯二酚和一分子的丙酮酸經一步反應生物合成左旋多巴。該反應的殘留物包括：多餘的丙酮酸、鄰苯二酚、銨鹽、酶蛋白等雜質，以及鄰苯二酚氧化物、殘餘酶蛋白溶液等色素。混合溶液第一次調酸pH調至5～5.5，接近左旋多巴的等電點，有利於降低左旋多巴的溶解度，配合過濾可有效去除大量的水溶性蛋白、色素、殘留底物和鹽類等雜質。過濾的方法包括但不限於離心過濾或板框壓濾，收集獲得較高純度、色素減少的粗晶體；第二次調酸pH調至0.95～1.05用於完全溶解左旋多巴粗晶體，且利於將粗晶體中少量酶蛋白加速變性和絮凝，結合活性炭吸附達到分離的目的；調鹼結晶pH調至3.0～5.5時，左旋多巴開始發生結晶，優選地，當pH控制在3.9～4.3，並控制前期結晶溫度在30～40℃之間，緩慢攪拌，生成的左旋多巴為小顆粒狀晶體，結晶度達到90％以上。進一步地，第一次調酸時料液溫度降至5～10℃，靜置後離心甩濾或板框壓濾，並用少量水均勻淋洗，棄置離心後清液並收集晶體。第二次調酸按質量體積百分比加入活性炭為總體積的0.3～2.0％，優選為0.5％，加入活性炭後升溫至50～55℃緩慢攪拌0.8～2小時，用板框過濾或壓濾缸壓濾濾除活性炭和少量變性的蛋白絮狀物。調鹼結晶按質量體積百分比加入25～30％的鹼液，所述鹼液包括氫氧化鈉溶液、氫氧化鉀溶液、氨水溶液中的任意一種或多種的組合。調鹼結晶時，物料的結晶溫度控制在30～40℃之間，調鹼至要求的pH時，緩慢攪拌1～2小時後，將料液溫度降至5～10℃時，靜置後離心甩濾，用純水淋洗後收集晶體。為了減輕左旋多巴在處理過程中的氧化程度，改善左旋多巴的成品色澤，調鹼結晶前加入的抗氧化劑在總料液中濃度為0.3～0.7g/L，所述抗氧化劑包括NaHSO3、Na2SO3、Na2S2O5或其鉀鹽、維生素C或其鈉鹽或鉀鹽中的任意一種或多種的組合。所述第一次調酸和第二次調酸加入的酸液包括鹽酸、硫酸、磷酸、硝酸、甲酸、醋酸中的任意一種或多種的組合。這裡需要說明的是，本發明酪氨酸酚裂解酶生物催化方法為公知技術，所使用的酪氨酸酚裂解酶可直接購買獲得，也可利用含有酪氨酸酚裂解酶的己知重組E.coli發酵表達獲得含酶的菌體發酵液，再經膜濃縮、機械破壁、離心除菌渣獲得濃縮酶液。本發明所述方法獲得的左旋多巴結晶粉末收率不低於85％。一種左旋多巴結晶粉末，通過如權利要求1所述方法獲得，總雜質按HPLC出峰面積百分比計不大於0.05％，無水結晶的結晶度為90％，晶粉末顆粒粒徑大小為120μm～250μm。有益效果：本發明的方法在實現工業化生產的基礎上，提高了左旋多巴結晶粉末的收率，精確控制反應酸鹼性和溫度，有效濾除了轉化過程中的殘留底物、蛋白和色素；採用真空微波乾燥技術，減少受傳統乾燥的鼓熱風、翻料等外力作用而造成的產品損耗，避免左旋多巴經高溫氧化破壞或分解後引起的產品外觀褐變，提高產品乾燥後的水分均一性；該方法獲得的結晶粉末品質明顯優於EP和USP要求，總雜質按HPLC出峰面積百分比計不大於總重的0.05％(EP為1.0％，USP為1.1％)，單雜質按HPLC出峰面積百分比計不大於總重的0.05％(EP和USP最高均為0.5％)，結晶粉末的結晶度在90％以上。附圖說明圖1是本發明實施例2的高效液相色譜分析結果；圖2是本發明實施例3的高效液相色譜分析結果；圖3為本發明實施例1轉化過程中左旋多巴和鄰苯二酚變化情況的HPLC圖譜(轉化進行至1小時40分鐘)；圖4為本發明實施例1轉化過程中左旋多巴和鄰苯二酚變化情況的HPLC圖譜(轉化進行至3小時)；圖5為本發明實施例1轉化過程中左旋多巴和鄰苯二酚變化情況的HPLC圖譜(轉化進行至4.5小時)。具體實施方式下面結合具體實施方式對本發明進行進一步說明。實施例1酪氨酸酚裂解酶生物催化工藝向水中投放初始丙酮酸，用濃氨水控制pH在7.0～9.0；再依次投加抗氧化劑、螯合劑、銨鹽、5-磷酸吡哆醛，再次用濃氨水將pH控制在7.0～9.0，加入濃度為80～200g/L的重組酪氨酸酚裂解酶的酶液，通入氮氣，調整溫度至反應溫度，氨水調節pH至7.0～9.0，加入鄰苯二酚開始反應；初始基礎底物鄰苯二酚與丙酮酸及其鈉鹽投放摩爾比為1∶1～1.5。之後，每10min分別投加底物鄰苯二酚和丙酮酸(或丙酮酸銨，下文除特別說明外均只丙酮酸)為2g/L，鄰苯二酚的最終投加濃度為50～70g/L(以初始體積計算)、丙酮酸最終投加濃度為50～70g/L(以初始體積計算)，當底物鄰苯二酚殘留≥5g/L時，停止投料，繼續攪拌0.5h～1h後反應結束，獲得左旋多巴轉化液。反應轉化率≥95％，轉化液中左旋多巴含量可達100～120g/L。轉化步驟中，還需要添加0.2mol/L～0.3mol/L的銨鹽，包括但不限於甲酸銨、乙酸銨、氯化銨、硫酸銨中的任意一種或多種組合。投入丙酮酸或其銨鹽後，還投入底物質量1％～5％的抗氧化劑，抗氧化劑包括但不限於NaHSO3、Na2SO3、Na2S2O5、維生素C及其鈉鹽的任意一種或多種的組合。投入丙酮酸和抗氧化劑後，還投入0.5g/L～1.5g/L的螯合劑，螯合劑包括但不限於酒石酸及其鉀鈉鹽、乙二胺四乙酸(EDTA)及其二鈉鹽的任意一種。如圖3至圖5所示，催化反應進行了4.5小時，體系中左旋多巴含量逐漸增加，鄰苯二酚濃度始終≤5g/L；反應結束時，鄰苯二酚的剩餘含量只有0.71g/L。實施例2650L轉化體系取實施例1獲得的左旋多巴轉化液，加入濃鹽酸調pH至5.1，得到總體積為650L，濃度為110g/L的左旋多巴混合液，溫度降至6℃，靜置4小時後，用離心機甩濾，並用少量飲用水淋洗，離心機物料出口未見明顯液體流出即可收集左旋多巴粗品。收集的左旋多巴粗品總重為97.5kg，按乾燥品計算左旋多巴含量為67.5kg，粗品離心得到的左旋多巴收率為94.4％。將離心得到的97.5kg左旋多巴粗品投入搪瓷反應釜中，加入570L飲用水，控制溫度30～35℃。開啟攪拌，加入濃鹽酸，調pH至0.97，濃鹽酸用量為48kg，此時總體積約為650L。向反應釜中按質量體積百分比加入總體積0.5％的活性炭，約3.25kg。開始升溫至50℃，並保持溫度1小時。保溫結束後，此物料經壓濾缸除去活性炭，清液經過精密過濾器後進入到精烘包車間內的搪瓷反應釜中。開啟攪拌，向反應釜中加入濃度為150g/L的亞硫酸鈉溶液2.2L，此時反應釜中的亞硫酸鈉的濃度為0.5g/L。控制物料溫度30℃左右，開啟攪拌，按質量體積百分比緩慢加入25％的NaOH溶液，將pH調至4.0，緩慢攪拌1～2小時後，將料液溫度降至8℃時，停止攪拌，靜置結晶5小時。用籃式離心機離心收集晶體。離心時，用純化水噴淋2次，每次用量為6L水，最後用水泡洗一次，用量為10L水。甩幹後收集晶體總重量為75kg，裝入一層聚乙烯袋，待烘乾。對離心後的晶體物料進行真空微波乾燥，乾燥物料厚度5±0.5cm，乾燥溫度45℃，微波功率控制在7土0.5kW，真空度-0.099～-0.092Mpa，乾燥時長20～30min。乾燥後總重量為62kg，故重結晶收率為91.8％，總收率為86.7％。經檢測，烘乾得到的產品均符合EP和USP要求：總雜質按HPLC出峰面積百分比計不大於0.05％，結晶粉末的結晶度在90％以上，顆粒粒徑為120μm～250μm。按EP要求，各指標分別為：外觀為白色結晶性粉末，鑑別IR與對照品IR圖譜一致，樣品含量測定主峰保留時間與對照品峰保留時間一致，溶液顏色沒有深於BY6標準比色溶液，乾燥失重為0.22％，pH為5.8，殘渣≤0.1％，重金屬≤10mg/kg，有關物質合格，光學純度為99.8％，含量用滴定法檢測為99.6％。按USP要求，各項指標分別為：外觀為白色結晶性粉末，鑑別IR與對照品IR圖譜一致，樣品含量測定主峰保留時間與對照品峰保留時間一致，乾燥失重為0.22％，旋光度為-163°，殘渣≤0.1％，重金屬≤10mg/kg，含量用高效液相色譜法檢測為99.3％，雜質檢測符合要求。實施例36500L轉化體系取實施例1獲得的左旋多巴轉化液，加入質量體積比為50％的濃硫酸調pH至5.4，得到總體積為6500L，濃度為104g/L的左旋多巴混合液，溫度降至9℃，靜置4小時後，用板式過濾機壓濾，並用少量純化水頂洗，清液出口未見明顯液體流出即可收集左旋多巴粗品。收集的左旋多巴粗品總重為858kg，按乾燥品計算左旋多巴含量為643.6kg，板式過濾機得到的左旋多巴收率為95.2％。將板式過濾機得到的858kg左旋多巴粗品投入搪瓷反應釜中，加入5700L飲用水，控制溫度30～35℃。開啟攪拌，加入濃鹽酸，調pH至1.03，濃鹽酸用量為465kg，此時總體積約為6500L。向反應釜中按質量體積百分比加入總體積0.5％的活性炭，約32.5kg。開始升溫至55℃，並保持溫度1.5小時。保溫結束後，此物料經壓濾缸除去活性炭，清液經過精密過濾器後進入到精烘包車間內的搪瓷反應釜中。開啟攪拌，向反應釜中壓入濃度為150g/L的亞硫酸氫鈉溶液24L，此時反應釜中的亞硫酸氫鈉的濃度約為0.5g/L。控制物料溫度40℃左右，開啟攪拌，按質量體積百分比緩慢加入30％的KOH溶液，將pH調至4.2，緩慢攪拌1～2小時後，將料液溫度降至8℃時，停止攪拌，靜置結晶5小時。用籃式離心機離心收集晶體。離心時，用純化水噴淋2次，每次用量為6L水，最後用水泡洗一次，用量為10L水。甩幹後收集晶體總重量為689kg，裝入一層聚乙烯袋，待烘乾。對離心後的晶體物料進行真空微波乾燥，乾燥物料厚度5±0.5cm，乾燥溫度45℃，微波功率控制在7±0.5kW，真空度-0.099～-0.092Mpa，乾燥時長20～30min。乾燥後總重量為590kg，故重結晶收率為91.7％，總收率為87.3％。經檢測，烘乾得到的產品均符合EP和USP要求：總雜質按HPLC出峰面積百分比計不大於0.05％，結晶粉末的結晶度在90％以上，顆粒粒徑為120μm～250μm。按EP要求，各指標分別為：外觀為白色結晶性粉末，鑑別IR與對照品IR圖譜一致，樣品含量測定主峰保留時間與對照品峰保留時間一致，溶液顏色沒有深於BY6標準比色溶液，乾燥失重為0.16％，pH為5.3，殘渣≤0.1％，重金屬≤10mg/kg，有關物質合格，光學純度為99.7％，含量用滴定法檢測為99.5％。按USP要求，各項指標分別為：外觀為白色結晶性粉末，鑑別IR與對照品IR圖譜一致，樣品含量測定主峰保留時間與對照品峰保留時間一致，乾燥失重為0.16％，旋光度為-164°，殘渣≤0.1％，重金屬≤10mg/kg，含量用高效液相色譜法檢測為99.2％，雜質檢測符合要求。試驗例HPLC分析上述實施例2和實施例3產品的雜質，其結果如圖1、圖2所示。表1實施例2左旋多巴無水結晶粉末HPLC分析結果保留時間面積％面積高度積分類型14.46748850.02727BV26.1543102496399.972655425BB325.23727580.01412BB表2實施例3左旋多巴無水結晶粉末HPLC分析結果保留時間面積％面積高度積分類型15.15831651562999.982658925BV222.69475750.02808BB表1、表2分別對應說明書附圖圖1、圖2的HPLC圖譜。本發明根據現有的生產製備工藝，所使用的原料均易溶於水，故生產過程中無需用到有機溶劑。得到的產品中雜質含量遠遠低於其它工藝生產得到的產品，純度均高於99.95％。以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出：對於本
技術領域：
的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護範圍。當前第1頁1 2 3