一種紅細胞膜表面提取物的提取方法及應用的製作方法

2023-09-17 22:39:15 1

專利名稱：一種紅細胞膜表面提取物的提取方法及應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種紅細胞膜表面提取物的提取方法及應用，其可用於提高動物的免疫水平。
背景技術：
紅細胞表面表達有多種免疫相關抗原，包括CD58，CD59和補體C3b受體。CD58是一種細胞表面的糖蛋白，屬免疫球蛋白超家族成員，是CD2的天然配體。存在於紅細胞表面和可溶性的CD58(sCD58)可能通過下述途徑在機體免疫調節中發揮作用①非特異地直接與CD2+淋巴細胞結合，通過CD2-CD58旁路途徑激活而使其進一步增殖；②與T細胞CD2結合後，引起T細胞膜表面受體表達的改變，而影響T細胞TCR/CD3途徑的活化；③通過與可溶性CD2的結合，而使其失去與APC細胞膜表面CD58的結合力，抑制可溶性CD2對免疫的負調節作用。目前對紅細胞表面免疫相關抗原的應用缺乏相應的研究。

發明內容
本發明為了解決上述背景技術中的不足之處，提供一種紅細胞膜表面提取物的提取方法及應用，其對機體免疫具有雙向調節作用，能刺激外周血淋巴細胞增殖，提高機體對抗原的免疫應答水平，使血液中的抗體水平迅速升高，顯著縮短免疫後抗體達到有效保護水平的時間，並可抑制子宮局部的免疫排斥反應，有利於動物的妊娠維持。
為實現上述目的，本發明採用的技術方案為一種紅細胞膜表面提取物的提取方法，其特殊之處在於包括以下操作步驟無菌採集山羊或綿羊頸靜脈血，肝素抗凝，加入適量0.05M pH7.5的PBS液，1500r·min-1，離心15min，吸棄上清及壓積紅細胞(RBC)表層的灰黃層，加入PBS，重新混懸底層RBC，如上重複洗滌3～5次，取壓積RBC加入等體積0.25g·L-1胰蛋白酶，混勻，37℃水浴攪拌1h，1000r·min-1，離心15min，取上清，電磁攪拌下，逐滴加入1/8體積的50％三氯乙酸，3000r·min-1離心30min，取上清，用75g·L-1NaHCO3調至中性，裝透析袋，4℃透析48h，每4～8h換水一次，繼之用聚乙二醇(PEG)或蔗糖濃縮至原量1/10，過G50柱後分裝青黴素瓶，真空冷凍乾燥，-20℃保存待測。
一種紅細胞膜表面提取物的應用，其特殊之處在於所述紅細胞膜表面提取物與動物疫苗配合應用於提高動物抗病能力和對特異抗原的免疫應答能力及疫苗的免疫效力。
上述紅細胞膜表面提取物作為動物疫苗佐劑應用於提高動物抗病能力和對特異抗原的免疫應答能力及疫苗的免疫效力。
上述紅細胞膜表面提取物作為動物疫苗免疫增強劑應用於提高動物抗病能力和對特異抗原的免疫應答能力及疫苗的免疫效力。
一種紅細胞膜表面提取物的應用，其特殊之處在於所述紅細胞膜表面提取物應用於動物子宮局部，用於促進子宮局部Th2型細胞因子及IFN-τ(胚胎幹擾素)分泌，提高子宮局部的抗感染能力，與現有技術相比，本發明具有的優點和效果如下1、本發明對機體免疫具有雙向調節作用，能刺激外周血淋巴細胞增殖，提高機體對抗原的免疫應答水平，使血液中的抗體水平迅速升高，顯著縮短免疫後抗體達到有效保護水平的時間。
2、本發明能抑制子宮局部的免疫排斥反應，促進Th2型細胞因子分泌，有利於動物的妊娠維持。
3、本發明完整的RBC、RBC膜碎片、游離CD58，均可提高淋巴細胞的免疫應答水平，顯著提高雞群對新城疫IV系苗的反應性，在免疫接種的同時注射CD58組於免疫後第3d，其HI抗體效價即可達到正常免疫組HI效價的峰值，並於第5d達到最高峰，而正常組於第9d左右才達到峰值，說明CD58不僅使IV系苗免疫後的HI抗體上升，且使其達到峰值的時間顯著提前，另外對雞法氏囊炎疫苗免疫也有類似的效果。
4、本發明可顯著促進山羊和豬外周血淋巴細胞的活化以及IL-2的分泌。
5、本發明能優勢活化子宮局部γδT細胞及Th2型淋巴細胞、促進Th2型細胞因子(IL-4)分泌。
四

圖1為本發明中CD58的提取工藝流程圖。
圖2為CD58在子宮局部免疫細胞調節中的作用模式圖。
圖3為提取物對豬PBMChh活化的影響示意圖。
圖4為提取物對Et花環形成細胞的影響示意圖。
圖5為CD58對山羊PBMC活化的作用示意圖。
圖6為GCD58對山羊PBL的活化作用示意圖。
圖7為GCD58對CD4+T細胞及CD4-淋巴細胞活化作用比較圖。
圖8為GCD58對不同組分細胞活化作用的比較圖。
五具體實施例方式參見圖1，本發明的製備方法為無菌採集山羊或綿羊頸靜脈血，肝素抗凝，加入適量0.05M pH7.5的PBS液，1500r·min-1，離心15min，吸棄上清及壓積紅細胞(RBC)表層的灰黃層，加入PBS，重新混懸底層RBC，如上重複洗滌3～5次，取壓積RBC加入等體積0.25g·L-1胰蛋白酶，混勻，37℃水浴攪拌1h，1000r·min-1，離心15min，取上清，電磁攪拌下，逐滴加入1/8體積的50％三氯乙酸，3000r·min-1離心30min，取上清，用75g·L-1NaHCO3調至中性，裝透析袋，4℃透析48h，每4～8h換水一次，繼之用聚乙二醇(PEG)或蔗糖濃縮至原量1/10，過G50柱後分裝青黴素瓶，真空冷凍乾燥，-20℃保存待測。
紅細胞膜表面提取物的應用1.作為佐劑或免疫增強劑應用於動物疫苗，以提高動物抗病能力和對特異抗原的免疫應答能力，提高疫苗的免疫效力。
2.子宮局部應用，可促進子宮局部Th2型細胞因子及IFN-τ(胚胎幹擾素)分泌，提高子宮局部的抗感染能力，降低早期胚胎死亡和流產，提高動物妊娠率。
本發明建立了CD58的提取和生物活性測定方法，證明其在機體接受免疫原的早期對機體具有明顯的免疫促進作用，確定了其在雞新城疫免疫中的作用及其應用方法和劑量。同時證明，來源於豬和綿羊的CD58具有相同的免疫活性，均能明顯提高雞新城疫發病雞群的治癒率。
在理論上1.首次將紅細胞免疫與妊娠期子宮局部的免疫調節相聯繫，提出了RBC及CD58在妊娠期子宮局部免疫調節中作用(圖2)。
2.首次證明CD58對山羊外周血淋巴細胞具有活化作用，其優勢活化的細胞是CD4-淋巴細胞包括CD8+T細胞及γδT細胞。同時發現PHA-P與CD58兩者對CD4+T細胞及混合淋巴細胞的刺激具有相互協同作用，而對CD4-淋巴細胞則表現為PHA-P對CD58作用的抑制。
3.首次證明CD58對妊娠早期山羊子宮局部細胞因子具有調節作用。CD58極顯著抑制IL-2產生，明顯促進IL-4產生；對TGF-β2產生具有一定促進作用，而對TGF-β1無影響。
4.首次證明CD58與EPF具有抗原交叉性，為應用CD58進行動物超早期妊娠診斷奠定了基礎。
一、CD58的製備與免疫活性檢測1材料與方法1.1材料1.1.1試劑0.05M pH7.5的PBS；無Ca++、Mg++平衡鹽緩衝液(CMF)；RPMI 1640培養液；完全RPMI 1640培養液(CM)，MTT、SDS-DMF溶解緩衝液；瑞特氏染色液，臺盼蘭染色液；以上試劑的配製見附錄。
0.25g·L-1胰蛋白酶溶液稱取胰蛋白酶(Difco，1∶250)0.50g，溶於100mL CMF中，30～37℃電磁攪拌10～15min，使全溶，過濾除菌，分裝，低溫保存，臨用時依次作2倍和10倍稀釋，即分別為2.5g·L-1和0.25g·L-1應用液。50％三氯乙酸稱取三氯乙酸(分析純，上海化學試劑採供站)50g，去離子水溶解，定容於100mL容量瓶，分裝，室溫保存。
0.8％戊二醛用吸管準確量取戊二醛溶液(武漢有機合成化工廠)，按其百分含量，用生理鹽水稀釋至0.8％，分裝，室溫保存。
肝素鈉稱取肝素鈉(上海生化試劑分裝站)50mg，溶於100mL生理鹽水，10磅10min滅菌，4℃保存。
淋巴細胞分離液(上海華精)密度1.077±0.001g·L-1。
PHA-PDifco產品，華美公司分裝，用CMF配成5g·L-1濃度，-20℃保存。臨用前用RPMI 1640培養液稀釋成20mg·L-1，0.22μm微孔濾膜過濾。
1.1.2器材酶標儀DG5030型，南京，華東電子集團恆溫水浴搖床3540-1，LAB-Ling instruments Inc.
真空冷凍乾燥機Alpha-5，ehvisf.
1.1.3動物山羊關中奶山羊，購自楊凌區周圍養殖農戶，均為當年青年母羊。
綿羊本校實驗動物房提供。
豬購自當地市場的仔豬，臨床檢查健康，飼養於本校實驗動物房。
1.2方法1.2.1紅細胞膜提取物(erythrocytic membrane extract，EME)的製備主要過程是無菌採集山羊或綿羊頸靜脈血，肝素抗凝，加入適量0.05M pH7.5的PBS液，1500r·min-1，離心15min，吸棄上清及壓積紅細胞(RBC)表層的灰黃層，加入PBS，重新混懸底層RBC，如上重複洗滌3～5次，取壓積RBC加入等體積0.25g·L-1胰蛋白酶，混勻，37℃水浴攪拌1h，1000r·min-1，離心15min，取上清，電磁攪拌下，逐滴加入1/8體積的50％三氯乙酸，3000r·min-1離心30min，取上清，用75g·L-1NaHCO3調至中性，裝透析袋，4℃透析48h，每4～8h換水一次，繼之用聚乙二醇(PEG)或蔗糖濃縮至原量1/10，過G50柱後分裝青黴素瓶，真空冷凍乾燥，-20℃保存待測。
1.2.2玫瑰花形成抑制實驗常規無菌分離豬外周血單個核細胞(peripheral blood monnuclearcells，PBMC)，以RPMI 1640培養液調濃度至1×106個·mL-1，加入12隻小試管，每管0.1mL，再依次分別加入不同濃度的提取物0.1mL，每一濃度做三個重複，另設一組加入培養液作為正常對照，混勻後於室溫(20～22℃)作用30min，加入5m LCMF混懸，1000r·min-1離心10min，吸棄上清，如此反覆2次，第3次用RPMI 1640培養液洗滌，洗後使每管恢復至約0.1mL，加入1％的SRBC懸液(CMF配製)0.1mL，37℃水浴5min，取出置4℃靜置過夜，加0.8％戊二醛1滴(約0.025mL)，輕輕捻轉試管，使管底細胞混懸，室溫作用10min後，推片，瑞特氏染色法染色鏡檢，計數花環形成率，按下式計算花環抑制率 1.2.3 PBL吸收實驗和CD2封閉實驗常規製備豬PBMC，以CM調濃度至1×106個·mL-1，分裝FCS包被的細胞培養扁方瓶(Nunc)，每瓶8mL，37℃、5％CO2、飽和溼度條件下孵育2～4h，取出，吸取懸浮細胞，即外周血淋巴細胞(PBL)，加入CMF混勻後，1000r·min-1離心15min，重複洗滌2次，吸棄上清，CMF調濃度至1×107個·mL-1，分裝小試管，1000r·min-1離心，棄上清，加入提取物溶液，混勻，室溫作用1h，離心取上清，進行花環抑制實驗。
取製備的PBL，CMF調濃度至2×107個·mL-1，45℃水浴1h，3000r·min-1離心30min，取上清(主要含CD2)[301]，等量加入裝有0.1mL濃度分別為8.0、4.0和2.0g·L-1RBC膜提取物的小試管中，4℃作用20min，同時設1管加入CMF作為對照，取出，各管加入PBMC懸液0.1mL，室溫作用30min，其間每10min混懸1次，結束後，加入CMF混懸，1000r·min-1離心10min，反覆洗滌3次，之後使各管恢復至0.1mL，加入1％SRBC懸液，以下，按花環形成實驗操作，結束後，推片染色鏡檢，計算花環形成率。
1.2.4 PBMC轉化實驗常規製備豬PBMC，以CM調濃度至2×106個·mL-1，按每孔100μL加於96孔細胞培養板，以單獨加入PHA-P作為陽性對照，CM作為陰性對照，設PHA-P+提取物，PHA-P+PBL吸收後提取物、提取物、PBL吸收後提取物等為實驗組，每組設3個復孔，另設3孔不含任何細胞的CM孔作為空白對照，含PHA-P各孔中PHA-P終含量為5mg·L-1不含PHA-P各孔加入CM，使各孔總量為200μL，於37 ℃，5％CO2，飽和溼度條件下培養66h，取出各孔加入MTT應用液25μL，繼續孵育至72h，取出，各孔加入SDS-DMF緩衝液100μL，37℃孵育過夜，於570nm下以空白對照孔調「0」值，按下式計算刺激指數(SI)；2結果與分析2.1 RBC膜提取物(EME)的花環抑制率，見表1。
表1RBC膜提取物的花環抑制率(％)RBC來源 N8g·L-14g·L-12g·L-1綿羊(SEME)480.58±4.653.74±5.238.57±5.6山羊(GEME)668.60±3.736.43±2.832.46±6.2從表1可見，兩種來源的RBC膜提取物均具有顯著的抑制Et花環形成的活性，綿羊來源較山羊來源的抑制活性高。這種抑制作用隨劑量的增加而增強。顯著性檢驗表明，綿羊與山羊來源的提取物間存在顯著差異(P＜0.05)。
2.2 PBL吸收對提取物Et花環抑制活性的影響(表2)表2 經提取物PBL吸收後的花環抑制率(％)提取物來源N8g·L-14g·L-12g·L-1綿羊 411.4±2.6 2.1±0.7 1.8±1.1山羊 64.71±2.4 1.3±0.9 1.1±0.9由表2可看出，提取物經PBL吸收後，其對Et花環的影響顯著減弱。分析表明4g·L-1與2g·L-1組與對照組的花環形成率無明顯差異(P＞0.10)。8g·L-1組存在抑制活性可能與吸收不完全有關。
2.3 CD2對提取物Et花環抑制活性的封閉作用(表3)表3 提取物經CD2封閉後的花環形成率(％)提取物來源 n 8g·L-14g·L-12g·L-1對照綿羊 8 38.16± 40.39±6.41 42.35± 42.31±山羊 8 38.69± 40.87±4.29 41.83± 3.62從表3可見，CD2提取液可中和RBC膜提取物對Et花環形成的抑制活性，8.0g·L-1組仍存在抑制活性，可能與中和不完全有關。
2.4 提取物對豬PBMC活化的影響(圖3)實驗所製備的提取物均對豬的PBMC具有刺激活化作用(P＜0.01)，同時表現出對PHA-P的協同刺激效應(P＜0.01或P＜0.05)，而提取物經PBL吸收後，上述促進作用和協同效應均消失。表明提取物中存在的活化成分能直接與PBL結合而被去除。
綿羊源和山羊源提取物的上述作用在程度上存在差異，提示二者在局部結構或與PBL親和力等方面的差異，也可能與有效成分的含量相關。
3 討論SRBC在一定條件下可與多種動物的T淋巴細胞結合，形成玫瑰花環。兩者結合形成花環的基礎是存在於T細胞表面的紅細胞受體SER(又稱CD2)與存在於SRBC表面的配體LFA-3(又稱CD58)之間的結合。自RBC表面提取的CD58或存在於體液中的天然游離CD58同樣具有與T細胞表面CD2結合的活性。可依劑量依賴的方式抑制Et玫瑰花環的形成。由於不同動物RBC表面CD58的活性存在交叉性，該實驗已被應用於CD58活性的鑑定。
豬RBC表面提取物濃度在10g·L-1時對豬PBMC Et花環形成的抑制率為47.4±12.8。對其提取方法經過進一步改良後，製備的豬RBC提取物在相同濃度下，對Et花環抑制率達到70％以上[278]。本實驗自綿羊和山羊製備的提取物在8g·L-1時，對Et花環的抑制率分別達到80.58％和68.6％。表明所製備的提取物具有較高的花環抑制活性。
CD2與CD58的特異結合是Et玫瑰花環形成的分子基礎。游離CD58可與T細胞表面CD2結合，從而阻斷SRBC與T細胞的結合而抑制花環形成。所製備的提取物中具有花環抑制活性成分能被PBL吸收，並被CD2提取液封閉，表明本實驗所製備的提取物中具花環抑制活性的成分為CD58，且具有較高的生物活性。
研究表明，人、綿羊、豬RBC表面CD58及其游離CD58均可通過CD2途徑激活淋巴細胞。本實驗證明，山羊RBC源提取物也具有類似的活性，吸收實驗進一步表明，其活性成分可與PBL直接結合併經此將其去除。有實驗認為，RBC對淋巴細胞的促進作用可能涉及CD59等粘附分子，但CD59單獨作用並不能引起淋巴細胞的活化，只是通過促進T細胞與靶細胞或抗原呈遞細胞間的粘附而發揮協同刺激效應。從本實驗結果分析，提取物中的活性成分為CD58。
4 小結實驗所製備的提取物具有較高的Et花環抑制活性和促淋巴細胞活化的活性，其活性成分為CD58。
二、CD58對雞新免疫的促進作用CD58，又稱淋巴細胞功能相關抗原-3(LFA-3)，是廣泛分布於體內多種細胞及血小板表面的一種糖蛋白。體外試驗證明，它可通過與淋巴細胞表面的CD2結合，引起淋巴細胞的增殖，並提高外周血中單核細胞(PBMC)在植物血凝素(PHA)誘導下白細胞介素-2(IL-2)的產量。同時，有人證明存在於綿羊紅細胞(SRBC)上的CD58，可引起體外培養的B細胞對特異性抗原的免疫反應性增強。但是，外源性CD58注入機體後，能否提高機體對特異性抗原的免疫應答水平，進而增強機體抵禦病原微生物的能力，至今未見報導。本研究以雞為模型，研究CD58對接種新城疫IV系疫苗後雞群免疫應答水平的影響，為進一步闡明CD58在免疫調控中的作用及其臨床應用提供試驗依據。
1 材料與方法試驗雛雞購自陝西省農業學校孵化室的羅曼雛雞，出殼後即移入消毒房舍內，隔離飼養至22日齡時隨機抽樣，測定抗雞新城疫母源抗體效價，HI抗體效價＜21疫苗和抗原新城疫(ND)IV疫苗 陝西維康生物發展有限公司出品，批號9811；法氏囊病(IBD)中等毒力疫苗，南京藥械廠出品，批號98-2；ND抗原、IBD抗原，西北農林科技大學畜牧微生物實驗室提供，ND、IBD陽性血清由農業部家畜生殖內分泌與胚胎工程開放性重點實驗室提供。
CD58的提取及活性鑑定無菌採集綿羊(西北農業大學實驗動物房提供)靜脈血，肝素抗凝，1000r/min離心5min，棄去上層液，以Hank’s液洗滌3次，加入等體積0.25％的胰酶應用液，置37℃緩慢攪拌1h，1000r/min離心10min；取上清，邊振蕩邊加入適量三氯乙酸，再離心，上清以7.5％的NaHCO3調pH至7.0～7.2，裝透析袋，4℃透析48h，濃縮後以Et花環抑制試驗鑑定活性，分裝，低溫保存，應用中以抑制率50％作為一個活性單位。
CD58對雞HI抗體效價的影響將試驗雞隨機分成7組，每組10隻，分別標記為A1～5，B和E組。對A1～5和B組胸肌接種雞新城疫IV疫苗(1羽份/只)，A1～5組在接種的同時，分別胸肌注射CD58 2.0，1.5，1.0，0.5和0.25個活性單位；B組注射等量生理鹽水，E組只注射生理鹽水，不作IV系苗免疫作為空白對照。注射後分別於第1，3，5，9和14d採血，以B微量法測定其HI抗體效價，對結果進行統計分析。
CD58對IBD免疫的影響另取22日齡雞60隻隨機平均地分為C組、D組及對照組，按疫苗說明書中的用量，三組雞均以滴口方式進行IBD疫苗免疫，同時C組雞每隻肌注綿羊源CD58 1.0單位。D組雞CD58用量減半，以滅菌鹽水補足肌注量0.25mL。對照組每隻雞肌注0.5mL滅菌鹽水。
CD58對Et花環形成細胞的影響在測定HI抗體效價的同時，以常規方法測定Et花環形成率。
2.結果與分析2.1 CD58對雞HI抗體效價的影響每組在測定後，取其平均值，結果見表4表4 不同劑量CD58對雞HI抗體效價的影響不同時間的HI抗體效價(log2)組別Ti Xi1d 3d 5d 9d 14dA1 0 5.27.26.15.9313.1A2 0.86.38.57.27.0717.6143.5A3 0 5.27.36.36.2345.269.0A4 1 4.26.35.45.2178.235.6A5 1 3.46 5 5 140.628.1B 0.81 2.45.45.493.5 18.7從表4可見，A1～5各組與B組相比，均可使HI抗體效價升高，經t檢驗分析，A2組與B組差異極顯著(P＜0.01)，說明CD58能顯著提高雞群對新城疫IV系苗的反應性，即CD58能顯著增強機體對特異抗原的免疫反應性，這與Gabriel等(1988)的體外試驗結果一致。
比較A1～5各組可看出，HI抗體效價的變化與CD58呈現一定的劑量依賴性，劑量過高可消減其免疫增強作用。
將A2組與B組的HI效價變化進行比較可見，在免疫接種的同時注射CD58，於前5d內可使其HI抗體效價迅速上升，而正常免疫組(B組)在這一階段HI抗體上升較緩慢；另外，CD58注射組於免疫後第3d，其HI抗體效價即可達到正常免疫組HI效價的峰值，並於第5d達到最高峰，而正常組於第9d左右才達到峰值，說明CD58不僅使IV系苗免疫後的HI抗體上升，且使其達到峰值的時間顯著提前。
2.2綿羊源CD58協同IBD中等毒力疫苗免疫雞後的抗體變化免疫前雞IBD-AGP抗體測定表明，除極個別雞原血清抗體陽性外，絕大部分均表現為陰性。免疫後，試驗組雞抗體出現早，且效價明顯高於對照組(P＜0.01，或P＜0.05＝。結果見表5。
表5 CD58對雞群IBD免疫的影響(X±s)組別AGP抗體效價4d 7d 10d 15dC2.5±0.55**3.6±1.2*5.0±1**5.1±1.3*D2.1±0.85**3.4±0.78**4.6±1.1*4.9±1.1*E0.85±0.42 2.1±1.69 3.6±0.544.0±1.25*與對照組相比差異顯著(P＜0.05)，**與對照組相比差異極顯著(P＜0.01).
對Et花環形成細胞的影響整個試驗期間，E組的花環形成率保持平穩，其平均值為18.87％±0.61％，應用CD58組(A2組)的Et花環形成率高於B組，且變化趨勢一致，經分析表明A2組與B組差異不顯著P＞0.05)。如圖4。
討論體外試驗證明，無論存在於完整的紅細胞(RBC)膜表面或RBC膜碎片中的CD58，還是游離的CD58，均可通過與淋巴細胞膜上的CD3分子結合而提高淋巴細胞的免疫應答水平。肖俊傑等(1992)認為，體內的CD58與T細胞膜的CD2結合，可協助抗原刺激下的T細胞的活化作用，上述結論僅局限於體外試驗或針對體外試驗的假說。本試驗以雞為模型，證實了CD58在體內對特異免疫的增強作用，為上述假說提供了有力的佐證。
本試驗中應用的CD58來自SRBC，證明CD58分子Et花環形成串變化曲線的作用位點不具有種間差異性，這與作者所做的體外試驗結果一致，因而CD58作為一種免疫佐劑，具有廣譜和來源廣泛的優點，為其應用研究提供了試驗依據。
一般認為，新城疫HI抗體效價≥24時雞群即具有可靠的保護作用，應用CD58與IV系苗同期免疫注射，第3d雞群HI抗體效價即超過此值，比正常免疫雞群達到此值的時間(第5d)顯著提前，且能使該苗的HI效價顯著提高。目前在新城疫的紫急預防中多採用I系苗，由於I系苗屬弱強毒苗，常引起雞群死亡或生產能力下降。本試驗證明CD58配合應用IV系弱毒苗，可起到同樣的免疫效果。因而CD58在雞群首免及緊急預防接種中作為佐劑具有實際意義。
三、CD58對山羊PBL的活化作用CD58對外周血淋巴細胞(PBL)的促增殖作用，在人[1]豬[2]等已得到證明，在羊則未見報導。與人、豬不同，山羊外周血中的T淋巴細胞中約60％為γσTCR+T細胞[3]，對其進行研究不但對於揭示山羊RBC及體液中游離CD58在機體免疫反應及免疫調節中的作用，且對於研究γσT細胞的活化機制均具有重要意義。
1 材料方法1.1 材料動物關中奶山羊，購自楊凌區養殖農戶，主要為當年青年母羊。臨床檢查健康，飼養於西北農林科技大學實驗動物房。
主要試劑CD58為綿羊和山羊RBC膜提取物的凍幹品，-20℃保存。文中分別簡稱為SCD58和GCD58；Percoll(瑞典Pharamacia密度1.13g·mL-1)按下式計算[4]，用Hank’s液稀釋，配製濃度為1.04～1.05g·mL-1的Percoll分離液，再用密度瓶精確調整後，過濾除菌，4℃保存。
密度(g·mL-1)＝(％·Hank’s液×0.001151)+1.00961.2 細胞懸液的製備1.2.1 山羊PBMC和PBL懸液 常規密度梯度離心法分離PBMC，臺盼蘭染色計數，調整活細胞濃度至1×106個·mL-1。製備的PBMC懸液經粘附法和Percoll等密度梯度離心去除單核細胞，所得即PBL，以CM調整活細胞濃度至1×106個·mL-1，留取部分用於細胞活化實驗，其餘用於下一步分離。
1.2.2 CD4+T細胞及CD4-淋巴細胞懸液 參照文獻[4]及試劑說明，應用免疫磁珠法(MACs)，以CD20單抗包被的磁珠懸液，陰性選擇去除PBL中的B細胞，再以CD4單抗包被的磁珠懸液進行淋巴細胞再次分離，獲取CD4-淋巴細胞和CD4+T淋巴細胞，分別洗滌後調整活細胞濃度至1×106個·mL-1，所得細胞活率均≥95％。
淋巴細胞活化實驗將製備的細胞懸液加於96孔細胞培養板，每孔100μL，分別設A1PHA-P+SCD58，A2SCD58，A3PHA-P+GCD58，A4GCD58 4組作為實驗組，以PHA-P組作為對照，另設細胞對照和培養液對照組，實驗組依CD58濃度(B)作4個稀釋梯度各加50μL，每一梯度濃度作3個復孔，含PHA-P組加0.02g·L-1PHA-P 50μL使終含量為0.05mg·L-1。其餘孔以完全培養液補足200μL。於37℃，5％CO2，飽和溼度條件下培養66h，取出，各孔加MTT應用液25μL，振蕩混勻，繼續孵育至72h，各孔加入SDS-DMF溶解緩衝液100μL，37℃過夜，於570nm以培養液對照孔調「O」，測定OD值，計算刺激指數(SI)。
2、結果與分析2.1 CD58對山羊PBMC活化的作用絲裂原PHA-P可顯著刺激山羊PBMC活化，其SI值極顯著地高於PBMC+CM組(P＜0.01)。該體系中加入SCD58或GCD58均可引起SI值的提高，且其作用與相應提取物的劑量有關，在一定範圍內，隨劑量的增加活化率增高，而在高劑量，則SI值下降(圖5)。單獨加入SCD58或GCD58也可引起PBMC的活化，且其作用規律與PHA-P+CD58一致。
分析表明，刺激因素A(PHA-P+CD58)及CD58的劑量(B)均對PBMC的活化有極顯著的影響(P＜0.01)，刺激因素與CD58的劑量間交互效應極顯著(P＜0.01)(表6)。CD58對PHA-P刺激的PBMC活化具有顯著(P＜0.01或P＜0.05)的協同效應，SCD58的協同作用顯著高於GCD58(P＜0.05)，單獨加入GCD58或SCD58兩者之間無顯著差異(P＞0.05)。刺激劑量以1.25g·L-1的作用最強，其引起的PBMC活化的SI極顯著地高於其它劑量組(P＜0.01)。各水平組合平均數間的多重比較表明，PHA-P與1.25g·L-1提取物共同作用刺激效應最強。
表6 CD58對PBMC刺激的方差分析變異原因平方和 自由度 均方 FA 2.0795 30.6932 51.105**B 2.2241 30.7414 54.66**A×B2.0811 90.2312 17.048**誤差1.0851 80 0.0136總和7.4698 952.2 GCD58對山羊PBL的活化作用GCD58對山羊PBL的刺激效應與對PBMC的刺激作用類似(圖6)。但刺激因素(A)與劑量(B)間的交互作用不顯著(P＞0.05)(表7)，含PHA-P組顯著高於單獨CD58作用組(P＜0.01)，提取物的劑量以1.25g·L-1的作用最強(P＜0.01或P＜0.05)，其餘3個劑量間差異不顯著(P＞0.05)。
表7 GCD58對PBL刺激的方差分析變異原因 平方和 自由度 均方 FA0.13251 10.133 16.07**B0.19493 30.065 7.878**A×B 0.01086 30.004 0.439誤差 0.329940 0.008總和 0.6682472.3 GCD58對CD4+T細胞及CD4-淋巴細胞活化作用比較GCD58的刺激作用，在CD4+T細胞及CD4-淋巴細胞兩種表型細胞間存在極顯著的差異(P＜0.01)。GCD58單獨作用或與PHA-P共同作用對CD4-淋巴細胞的活化效率均顯著高於其對CD4+T淋巴細胞的活化(P＜0.01)，對於CD4-淋巴細胞，GCD58的刺激作用極顯著地高於PHA-P+GCD58的刺激(P＜0.01)，而對於CD4+T細胞，PHA-P+GCD58的刺激作用則高於GCD58(P＜0.05)(圖7)。但單獨PHA-P則對兩類細胞均只表現微弱的刺激活性(分別為1.04±0.03和1.06±0.05)。上述結果表明，CD58活化的細胞主要是CD4-淋巴細胞。
2.4 1.25g·L-1提取物對不同組分細胞活化作用的比較(圖8)提取物劑量在1.25g·L-1時，無論單獨應用或與PHA-P共同作用，對各組分淋巴細胞的活化作用均最強。該條件下，GCD58刺激的CD4-淋巴細胞活化率最高，其次依次為PBMC和PBL，而CD4+淋巴細胞活化率最低。PHA-P對CD58刺激的PBMC活化具有顯著的促進作用(P＜0.01)，對其刺激的PBL活化無顯著影響(P＞0.05)，在CD4-淋巴細胞則表現為抑制。同時，去除單核細胞後的各細胞組分對PHA-P的刺激反應顯著降低(P＜0.01)。
3 討論3.1 CD58對外周血淋巴細胞的活化作用完整、新鮮的RBC可刺激人、小鼠和豬PBMC的活化。應用蒸餾水崩解後的RBC膜碎片、自RBC膜表面提取的CD58及體液中游離CD58均具有類似作用[5]。本實驗證明，無論自綿羊或山羊RBC表面提取的CD58均可引起山羊PBMC的活化。這種作用在一定範圍內與劑量具有依賴關係，劑量過高則作用減弱，同時證明，山羊源和綿羊源CD58單獨應用時，其作用間無顯著差異。
單核細胞是可溶性抗原及PHA刺激的人類淋巴細胞體外反應及單向混合淋巴細胞反應(MLR)的重要因素之一[303]。本實驗表明，PHA刺激山羊外周血淋巴細胞活化具有單核細胞依賴性，而去除PBMC中的單核細胞後的PBL仍可被CD58刺激活化(P＜0.01)(圖2)，表明在CD58刺激的山羊PBL活化中，單核細胞並非是必需因素。但單核細胞對CD58的刺激具有輔佐功能(圖4)。
體內不同類型淋巴細胞的優勢活化，決定著免疫反應的類型，因而對CD58刺激的淋巴細胞表型的分析，是進一步分析其作用機制的基礎。有研究認為，CD58可優勢刺激CD8+T淋巴細胞的增殖[1]。本實驗觀察到CD58對山羊外周血中CD4-淋巴細胞的刺激作用顯著高於對CD4+T淋巴細胞的活化作用(P＜0.01)。表明CD58作為一種T細胞活化的刺激分子，主要刺激CD4-淋巴細胞的活化，提示在山羊機體免疫調控中，CD58可優勢刺激包括γδT細胞在內的CD4-淋巴細胞增殖，從而發揮其免疫調節功能。
3.2 CD58對PHA-P刺激的輔佐作用RBC在葡萄球菌腸毒素B(SEB)刺激的淋巴細胞活化中，具有替代單核細胞的輔佐作用，但其輔佐機制與單核細胞不同，他們在同一實驗中，同樣觀察到單獨應用RBC及其膜碎片對去除單核細胞的淋巴細胞的激活作用。本實驗中也得到了類似結果，證明CD58能顯著提高PHA-P誘導的PBMC的增殖，提示CD58在淋巴細胞活化過程中，對PHA-P刺激具有輔佐功能。
本試驗還觀察到，對於CD4-淋巴細胞，PHA-P與CD58共同作用效果極顯著地低於單獨應用CD58誘導的活化(P＜0.01)，即表現出PHA-P對CD58刺激的抑制作用。對CD2分子的研究證明，CD2分子的不同表位在引發細胞活化機制中有著不同的功能，在促細胞活化機制的觸發中需有2個或多個位點參與[1]。Lin.J[6]等進一步證明，抗CD2單抗對人外周血T細胞表面CD2和CD3的表達有重要調節作用，同時伴有其它一系列受體的變化。推測PHA-P與CD58共同作用引起的活化抑制，可能在於兩者活化淋巴細胞的機制不同，兩種刺激因子作用於CD4-T細胞後，分別引起其表面抗原分子表達或構象的改變，使相應的活化受體親和力降低或隱藏，或使抑制受體表露或上述兩者同時出現而造成細胞活化的抑制。但在CD4+T細胞及混合淋巴細胞(PBL及PBMC)其作用則相反，提示T淋巴細胞接受刺激後，表面受體的變化及活化可能同時受其它細胞作用的調節，這種調節作用在不同表型細胞間存在某種差異。
權利要求
1.一種紅細胞膜表面提取物的提取方法，其特徵在於包括以下操作步驟無菌採集山羊或綿羊頸靜脈血，肝素抗凝，加入適量0.05M pH7.5的PBS液，1500r·min-1，離心15min，吸棄上清及壓積紅細胞(RBC)表層的灰黃層，加入PBS，重新混懸底層RBC，如上重複洗滌3～5次，取壓積RBC加入等體積0.25g·L-1胰蛋白酶，混勻，37℃水浴攪拌1h，1000r·min-1，離心15min，取上清，電磁攪拌下，逐滴加入1/8體積的50％三氯乙酸，3000r·min-1離心30min，取上清， 用75g·L-1NaHCO3調至中性，裝透析袋，4℃透析48h，每4～8h換水一次，繼之用聚乙二醇(PEG)或蔗糖濃縮至原量1/10，過G50柱後分裝青黴素瓶，真空冷凍乾燥，-20℃保存待測。
2.一種紅細胞膜表面提取物的應用，其特徵在於所述紅細胞膜表面提取物與動物疫苗配合應用於提高動物抗病能力和對特異抗原的免疫應答能力及疫苗的免疫效力。
3.根據權利要求2所述的一種紅細胞膜表面提取物的應用，其特徵在於所述紅細胞膜表面提取物作為動物疫苗佐劑應用於提高動物抗病能力和對特異抗原的免疫應答能力及疫苗的免疫效力。
4.根據權利要求2所述的一種紅細胞膜表面提取物的應用，其特徵在於所述紅細胞膜表面提取物作為動物疫苗免疫增強劑應用於提高動物抗病能力和對特異抗原的免疫應答能力及疫苗的免疫效力。
5.一種紅細胞膜表面提取物的應用，其特徵在於所述紅細胞膜表面提取物應用於動物子宮局部，用於促進子宮局部Th2型細胞因子及IFN-τ(胚胎幹擾素)分泌，提高子宮局部的抗感染能力。
全文摘要
本發明涉及一種紅細胞膜表面提取物的提取方法及應用，其對機體免疫具有雙向調節作用，提高機體對抗原的免疫應答水平，使血液中的抗體水平迅速升高，並可抑制子宮局部的免疫排斥反應，有利於動物的妊娠維持。本發明作為佐劑或免疫增強劑應用於動物疫苗，以提高動物抗病能力和對特異抗原的免疫應答能力，提高疫苗的免疫效力，還可應用於子宮局部，可促進子宮局部Th2型細胞因子及IFN－τ分泌，提高子宮局部的抗感染能力，降低早期胚胎死亡和流產，提高動物妊娠率。
文檔編號A61P37/02GK1528792SQ200310105810
公開日2004年9月15日 申請日期2003年10月10日 優先權日2003年10月10日
發明者靳亞平, 王愛華, 王建辰, 李引乾, 馬勇江, 沈文正 申請人:西北農林科技大學