從光合細菌產氫發酵殘液中分離提取phb的方法
2023-08-22 10:56:16
專利名稱：從光合細菌產氫發酵殘液中分離提取phb的方法
技術領域：
本發明屬於農村能源利用技術領域，具體涉及一種從光合細菌產氫發酵殘液中分離提取PHB的方法。
背景技術：
聚β羥基丁酸(poly-β-hydroxy butyricacid，PHB)是許多微生物在碳、氮營養失衡的條件下，作為碳源和能源貯存物而合成的一種脂族聚酯大分子聚合物，在細胞的代謝活動中參與細胞的物質代謝和能量代謝。PHB因其不僅具有一般化學合成塑料的特性，還具有生物可完全降解性、生物相溶性等特點，使其成為可替代化工塑料製品、及消除「白色汙染」的新一代聚合塑料，而受到廣泛的的關注。此外，PHB還具有壓電性、光學活性及在生物合成過程中可利用再生原料的特性等，在醫學、藥學、農業、電子等領域也具有廣闊的應用前景。光合細菌在碳、氮源失衡的情況下為了維持胞內能量平衡，會利用固氮酶產氫釋放多餘的還原力產氫，這和光合細菌胞內合成PHB具有相似的代謝機理。因此光合細菌在產氫的同時往往伴隨有PHB的生成。目前，對於光合細菌生產PHB的研究多集中於直接利用光合細菌生產PHB。如，Khatipov等研究了不同碳氮源對光合細菌生成PHB的影響； Khatipov和Hysted等研究了光合細菌產氫過程中生成PHB的調控機理。目前尚未見到有從光合細菌產氫發酵殘液中分離提取PHB的相關報導。
發明內容
本發明目的在於提供從光合細菌產氫發酵殘液中分離提取PHB的方法，該方法環境友好且高效。為實現上述目的，本發明採取的技術方案如下
一種從光合細菌產氫發酵殘液中分離提取PHB的方法，其包括如下步驟 將光合細菌產氫發酵殘液過濾後，取濾渣(即菌體部分)進行多珠搖床處理，接著加熱至80 100°C，然後於5min內冷卻至室溫；固液分離後，固體用氯仿-乙醇混合液提取， 所得提取液與正己烷混合析出沉澱，沉澱經洗滌、乾燥後即得。為了使提取得到的PHB具有較高的純度，沉澱析出後可用氯仿再次溶解，然後添加正己烷使沉澱再次析出，如此重複2 4次。所述多珠搖床處理時間為8 20min ；所述固液分離為於3000 5000 r/min離心6 15min。所謂的「多珠搖床」即在三角瓶中放置數個玻璃珠，用以搖床晃動過程中通過玻璃珠的撞擊將細胞粉碎。較好的，固液分離後，固體用氯仿-乙醇混合液提取2 4次，提取溫度35 45°C，每次提取時間80 IOOmin ；混合液中氯仿和乙醇的體積比為2 :1。提取液可以蒸餾後回收再次利用，節約成本。本發明方法對光合細菌產氫發酵殘液中的聚β羥基丁酸(PHB)進行了分離提取，優化了 PHB的分離、提取條件，並對提取的PHB進行了分子量和純度鑑定。目的在於揭示光合產氫過程中耦合生成PHB的能力，也為光合細菌產氫發酵殘液的進一步處理及光合細菌產氫的綜合利用提供參考。本發明方法的優點1)採用機械破碎法(即多珠搖床處理)對PHB進行分離，避免了用次氯酸鈉破碎或有機溶劑破碎存在的原料後期處理麻煩及對環境的汙染問題。2)確定了最佳分離提取條件，使PHB的得率最大，節省了廢液回收的成本，降低了能耗，是一種經濟易行的分離方法。3)對提取及純化工藝進行優化，不同提取時間對PHB提取率影響較大， 但到達一定範圍後，變化不再明顯。不同的提取溫度對PHB的提取影響也較為顯著，但提取溫度過高會引起部分PHB降解，降低提取率。經試驗證實，PHB產量為細胞乾重的7 8%， PHB純度87 89%。4)採用氣相色譜分析PHB純度，採用本發明方法從光合細菌產氫發酵殘液中提取所得PHB樣品與PHB標準品的相對峰面積之比為0. 86 0. 90 :1，純度和標準品相當，符合工業化應用要求。
圖1為光合細菌胞內PHB的顯微鏡圖片(X 1000倍)；
圖2為採用實施例1所述方法提取所得PHB樣品的氣相色譜圖； 圖3為PHB標準品的氣相色譜圖。
具體實施例方式以下通過優選實施例對本發明作進一步詳細說明，但本發明的保護範圍並不局限於此。本發明所述的光合細菌產氫發酵殘液可以是按照本領域常規方法進行光合細菌產氫後的剩餘物料。下述實施例中所用的光合細菌產氫發酵殘液為按照中國專利 ZL200910064438. 5中實施例1公開的方法和裝置進行光合細菌制氫，裝置中光合產氫反應器3內的剩餘物料即為發酵殘液。實施例1
一種從光合細菌產氫發酵殘液中分離提取PHB的方法，其包括如下步驟取IOOml光合細菌產氫發酵殘液(菌體濃度820mg/L)，過濾後，濾渣經多珠搖床處理lOmin，接著加熱至 850C，然後置於_5°C的冰箱裡:3min使溫度迅速冷卻至室溫；接著於4000 r/min離心8min， 固體於35°C用IOOml氯仿-乙醇混合液(混合液中氯仿和乙醇的體積比為2 :1)提取3次， 每次提取95min，合併三次所得提取液，然後與150ml正己烷混合，沉澱析出，析出的沉澱分別用蒸餾水和乙醇各洗滌1次，80°C烘乾得到6. Img白色粉末狀PHB (純度86. 4%，提取率為細胞乾重的7. 4%)。實施例2
一種從光合細菌產氫發酵殘液中分離提取PHB的方法，其包括如下步驟取200ml光合細菌產氫發酵殘液(菌體濃度760mg/L)，過濾後，濾渣經多珠搖床處理18min，接著加熱至95°C，然後置於_5°C的冰箱裡5min，使溫度迅速冷卻至室溫；接著於5000 r/min離心 12min，固體於45°C用200ml氯仿-乙醇混合液(混合液中氯仿和乙醇的體積比為2 :1)提取3次，每次提取85min，合併三次所得提取液，然後與300ml正己烷混合，沉澱析出，析出的沉澱分別用蒸餾水和乙醇各洗滌2次，70°C烘乾得到11. 9mg白色粉末狀PHB (純度89. 5%，提取率為細胞乾重的7. 8%)。一、PHB的定性觀察
採用蘇丹黑染色製片，用顯微鏡對實施例1所得PHB進行鏡檢。如圖1所示，光合細菌細產氫發酵後，菌體細胞中廣泛分布著PHB黑色顆粒，說明光合細菌產氫過程中，伴隨有 PHB的生成，但PHB顆粒所佔細胞體積不大，產量不高，證明在光合細菌產氫過程中，只有部分能量用於合成PHB。另外，從圖1中也可以看出，光合細菌產氫發酵殘液中，菌體數量偏低，而且多數細胞已經衰亡老化，細胞破碎，細胞結構不完整。顯微鏡觀察過程中，細胞也沒有活動能力，說明光合細菌產氫後菌體衰亡較為嚴重，利於PHB的提取。二、PHB 的鑑定 1)分子量測定
採用黏度法於30°C測定PHB的分子量，[η] =KMa0測得PHB的黏度範圍在1. 28 1. 45，計算得PHB的分子量在0. 22 0. 25Χ 106g/moL。2)純度測定
PHB純度採用氣相色譜法測定，稱取5mg實施例1提取所得PHB樣品，加入ImL氯仿和 ImL酸化甲醇(酸化甲醇中含3V%的濃硫酸和0. 02V%作為內標物的苯甲酸)，然後於沸水浴中酯化池，快速冷卻至室溫，加ImL蒸餾水充分震蕩，5000 r/min離心15min，混合液分為兩相，取下層的有機相，用無水硫酸鈉乾燥後進行氣相色譜分析。氣相色譜條件3. 5 PEGA，柱長2m，載體為氮氣，流速40mL/min，進樣器溫度為200°C，柱溫80°C維持3min，然後以15°C / min升高至200°C，維持30min，採用FID檢測，檢測器溫度280°C。結果如圖2所示。由圖2可以看出，從光合細菌產氫發酵殘液中提取所得PHB樣品的保留時間為 10. 984min,與標準品的保留時間10. 853min (見圖3，購自美國Aldrich公司產品，熔點 172°C，相對分子量為2. 7 X IO5)基本一致，因此可確定為同一物質聚β羥基丁酸。樣品與標準品的相對峰面積之比為0. 89 :1，說明樣品純度和標準品相接近，符合工業化應用的要求。
權利要求
1.一種從光合細菌產氫發酵殘液中分離提取PHB的方法，其特徵在於，包括如下步驟 將光合細菌產氫發酵殘液過濾後，取濾渣進行多珠搖床處理，接著加熱至80 100°C，然後於5min內冷卻至室溫；固液分離後，固體用氯仿-乙醇混合液提取，所得提取液與正己烷混合析出沉澱，沉澱經洗滌、乾燥後即得。
2.如權利要求1所述從光合細菌產氫發酵殘液中分離提取PHB的方法，其特徵在於，所述多珠搖床處理時間為8 20min。
3.如權利要求1或2所述從光合細菌產氫發酵殘液中分離提取PHB的方法，其特徵在於，所述固液分離為於3000 5000 r/min離心6 15min。
4.如權利要求3所述從光合細菌產氫發酵殘液中分離提取PHB的方法，其特徵在於， 固液分離後，固體用氯仿-乙醇混合液提取2 4次，提取溫度35 45°C，每次提取時間 80 IOOmin ；混合液中氯仿和乙醇的體積比為2:1。
全文摘要
本發明涉及一種從光合細菌產氫發酵殘液中分離提取PHB的方法，其包括如下步驟將光合細菌產氫發酵殘液過濾後，取濾渣進行多珠搖床處理，接著加熱至80～100℃，然後於5min內冷卻至室溫；固液分離後，固體用氯仿–乙醇混合液提取，所得提取液與正己烷混合析出沉澱，沉澱經洗滌、乾燥後即得。該方法環境友好且高效，PHB產量為細胞乾重的7～8%，PHB純度87～89%。
文檔編號C08G63/90GK102558529SQ20111044718
公開日2012年7月11日 申請日期2011年12月28日 優先權日2011年12月28日
發明者周雪花, 張全國, 張志萍, 王毅 申請人:河南農業大學