一種pd-ecgf基因的原位雜交檢測試劑盒及其檢測方法和應用的製作方法
2023-11-30 14:21:06 1
專利名稱：一種pd-ecgf基因的原位雜交檢測試劑盒及其檢測方法和應用的製作方法
一種PD-ECGF基因的原位雜交檢測試劑盒及其檢測方法和
應用
技術領域：
本發明涉及一種試劑盒，具體地說關於一種PD-ECGF基因的原位雜交檢測試劑盒 及其檢測方法和應用
背景技術：
2005年美國衛生研究院、癌症研究院、疾控中心等多家單位做了一個年度報告， 「認為人類在抗癌大戰中是失敗」，也就是說癌症死亡率沒有降低，其列舉出造成抗癌大戰 失敗的幾個因素是1、腫瘤細胞異質性；2、腫瘤細胞耐藥性；3、抗癌藥物設計思路不完善 等。同時，該報告中亦提出應重新審視現有診治癌症的措施。本發明人在研究中發現，導致 癌症死亡率不降的另二個重要原因是1、不能做到真正的早期診斷；2、轉移的病理機制不 清楚。依照傳統的醫學影像及和其它生化(如蛋白標記物)指標來診斷癌症，認為佔位性 癌塊在2公分下是屬於早期癌症的診斷(更小些有時無症狀體徵)，這一臨床概念值得認 真討論。影像醫學的2公分以下癌塊屬早期這一界定科學性是不夠嚴謹的，從細胞學角度， 1公分的腫塊約有一億個腫瘤細胞，2公分的腫塊其三維空間的細胞疊加數遠不止2億個腫 瘤細胞，從癌變前期到單克隆癌細胞產生及形成2公分的癌塊，其病理演變過程相當長，可 能是一年或兩年、甚至三年以上，很難證實的是在這個過程中，腫塊是癌症唯一的發生地和 單獨的病灶。臨床上已證實一旦形成腫塊的同時，其他癌細胞通過不同途徑遷移到其他 部位克隆生長；一旦切除原發灶後，其他器官復發灶或多發癌塊灶先後形成或轉移。因此， 在臨床上以2公分以下的腫塊大小來界定早期與否，不夠嚴謹(有些病例，在發現原發病灶 時，同時發現轉移病灶，不在我們表述的內容中)，這時已經是晚期了，這是導致癌症死亡率 不降的真正原因。血小板衍生內皮細胞生長因子(platelet derived endothelial cell growth factor,PD-ECGF)最早從新鮮血小板溶解物中提取，其後證實與胸苷磷酸化酶(TP)是同一 種物質，其基因位於染色體22ql3"。PD-ECGF在肝癌組織中表達率達67. 8% 70. 5%，高 於癌周正常肝組織，且在 M高分期組肝癌中表達高於 !低分期組；伴有門靜脈癌栓的肝 細胞癌中，PD-ECGF表達水平高於不伴有門靜脈癌栓者，提示PD-ECGF可能與肝癌生長和侵 襲轉移中的血管生成有關，PD-ECGF水平可作為肝癌轉移復發的預測指標。Volm等用免疫 組化方法研究了 168例非小細胞肺癌組織中PD-ECGF、bFGF和VEGF的表達，發現3個指標 均陰性的患者中43%有淋巴結轉移，而3個指標均陽性的患者中77%發生淋巴結轉移，兩 組存在顯著差異。在mRNA水平、蛋白質表達和酶活性分析中都證實了 PD-ECGF在膀胱癌等 腫瘤的惡性進展中起著重要作用。PD-ECGFmRNA表達越高，局部浸潤範圍越廣，越容易出現 淋巴結或遠處轉移，預後越差。隨著分子生物技術日益完善，功能基因組學，癌症基因組學等研究的深入展開，至 今，我們已有可能在基因水平上做更精確的早期診斷，在癌變前期或癌細胞形成(單克隆 時)就能做到早期預測診斷。採用核酸原位雜交技術檢測PD-ECGF基因，對癌症的早期基因水平的轉移診斷有非常重要的臨床意義。PD-ECGF(血小板衍生內皮細胞生長因子)基 因，基因序列號NM_001014440，970bp，mRNA. 22ql3. 33〃，CDS :138... 899bp。原位雜交技術(in situ hybridization)是將分子生物學與細胞化學技術結合起 來，以標記的核酸分子為探針，在組織細胞原位檢測特異性核酸分子的技術。其原理是使含 有特異序列、經過標記的核酸單鏈(即探針)，在適宜條件下與組織細胞中的互補核酸單鏈 即靶核酸發生雜交，再以放射自顯影或免疫細胞化學方法對標記探針進行探測，從而在細 胞原位顯示特異的DNA或RNA分子。
發明內容本發明的目的是針對現有技術中的不足，提供一種PD-ECGF基因的原位雜交檢測 試劑盒的用途。本發明的再一的目的是，提供一種PD-ECGF基因的原位雜交檢測試劑盒。本發明的另一的目的是，提供一種PD-ECGF基因的原位雜交檢測方法。為實現上述目的，本發明採取的技術方案是一種PD-ECGF基因的原位雜交檢測試劑盒在製備檢測癌症早期轉移、復發疾病藥 物中的應用，所述的試劑盒包括雜交探針、標記物，所述的雜交探針序列如SEQ ID NO. 1所示。
所述的癌症是肝癌或膀胱癌。所述的雜交探針序列如SEQ ID NO. 1所示的RNA序列。所述的標記物選自放射性核素或非放射性標記物。所述的放射性核素選自3H、35S、125I或32P中的一種。所述的非放射性標記物選自生物素、地高辛、鹼性磷酸酶、辣根過氧化酶或螢光素 中的一種。所述的非放射性標記物優選自地高辛。所述的試劑盒還包括增效劑，所述的增效劑是鹼性磷酸酶抗體。為實現上述第二個目的，本發明採取的技術方案是一種PD-ECGF基因的原位雜交檢測試劑盒，包括雜交探針、標記物，其中所述的雜 交探針序列如SEQ ID NO. 1所示，所述的標記物選自放射性核素或非放射性標記物。為實現上述第三個目的，本發明採取的技術方案是一種PD-ECGF基因的原位雜交檢測方法，該方法包括以下步驟a、將試劑盒中的雜交探針與底物中待測RNA接觸，形成雜交複合體；b、檢測a步驟得到的雜交複合體。本發明的診斷試劑盒的組份是由雜交探針，雜交液，顯色劑，增效劑等組成。本試 劑盒的核酸雜交原理是分子生物學業內人士均熟知，具體操作步驟是標本處理、預雜交、雜 交、免疫組化染色、鏡下進行定量分析、結果報告，其中雜交的具體步驟包括儀器操作1).將待測標本放入反應槽中；2).儀器自動棄去液體，自動加消化液；3).儀器自動棄去液體，自動後固定；
4).儀器自動棄去液體，自動預雜交(42°C )；5).儀器自動棄去液體，自動清洗；6).儀器自動棄去液體，自動雜交(42°C )；7).儀器自動棄去液體，自動清洗；8).儀器自動棄去液體，自動與DIG抗體培養(室溫)；9).儀器自動棄去液體，自動清洗，顯色；10).取出封片鏡檢。本發明優點在於1、本發明提供的試劑盒具有靈敏度高、特異性強的特點。2、本發明的檢測方法操作方便、簡單，能在區級以上醫院普遍使用和推廣。3、本發明的診斷試劑盒與臨床上其它檢測癌胚蛋白標誌物，以及影像醫學檢查有 顯著不同。本發明可以在基因水平上檢測PD-ECGF基因異常表達，在影像醫學檢查未發現 佔位性癌病灶復發之前，癌症生化指標未產生異常之前，亦未形成腫瘤之前，能及早做到以 上基因表達異常的信息採集，給臨床癌症病患一個真正的早期診斷以及治療後轉移復發及 早預測。這樣才有可能實施癌症的早期診斷、早期預防、早期治療，有可能從源頭上徹底根 治癌症惡疾。
圖1是本發明實施例中肝癌轉移病人PD-ECGF基因表達圖片。圖2是本發明實施例中膀胱癌轉移病人PD-ECGF基因表達圖片。圖3是本發明實施例中正常人PD-ECGF基因表達圖片。
具體實施方式下面結合附圖對本發明具體實施方式
作詳細說明。實施例1一種PD-ECGF基因的原位雜交檢測試劑盒，包括雜交探針、標記物、增效劑，其中， 所述的雜交探針序列如SEQ ID NO. 1所示。雜交探針用地高辛標記。試劑盒中的其它液體
和標本組成如下
消化液100 μ 1/管1管/盒無色透明液體
保護液100 μ 1/管1管/盒無色透明液體
預雜交液1300 μ 1/ 管2管/盒無色透明液體
正義雜交液10μ 1/管1管/盒無色透明液體
反義雜交液10μ 1/管1管/盒無色透明液體
封閉液1000 μ 1/ 管1管/盒無色透明液體
鹼性磷酸酶抗體ι μ 1/管1管/盒無色透明液體
顯色劑A175 μ 1/ 管1管/盒黃色液體
顯色劑B320 μ 1/ 管1管/盒無色透明液體
緩衝液I IOx90ml/ 瓶1瓶/盒淺黃色或無色透明液體
緩衝液II IOx80ml/ 瓶1瓶/盒淺黃色或無色透明液體
緩衝液III IOx 20m/瓶3瓶/盒 淺黃色或無色透明液體緩衝液IV IOx 90ml/瓶 1瓶/盒 淺黃色或無色透明液體固定液90ml/瓶 1瓶/盒 無色透明液體陽性對照標本6片/盒上述試劑成分說明(所有試劑購自SIGMA)1、消化液:20mg/ml 蛋白酶 K，IOOmg 蛋白酶 K，加 DEPC-H2O 5ml ；2、保護液0· 2g的glycine加入Iml的1 X緩衝液I ；3、預雜交液:1 X緩衝液II 7. 5ml50 X D 3ml10mg/ml yest t-RNA 750ulllmg/ml SALMON TESTES DNA 682ul0. 04M EDTA 3ml50% formamide 15ml4、封閉液0.03g的bloking(購買自羅氏公司)加入Iml IX緩衝液III;5、IOx 緩衝液 I (PH7. 1-7. 4)NaCl 80gNa2HPO4. 12H20 360gKCl 2gKH2P042g加三蒸水至11，並高壓滅菌；6、IOx 緩衝液 II (PH7. 0)NaCl 175. 3g檸檬酸鈉88. 2gHCl 幾滴加三蒸水至11，並高壓滅菌；7、緩衝液 III :(PH7. 9)Tris 121. IgNaCl 87. 66gHCl 60ml 左右加三蒸水至11，並高壓滅菌；8、緩衝液 IV:IM Tris-HCl (PH9. 5) =Tirs 121. Ig 加 HCl 3ml 左右，加水 900ml，調 PH 至 9. 5，加 水至11，並高壓滅菌；IM NaCl =NaCl 58. 44 加水至 11，並高壓滅菌；0. 5M MgCl2 101. 65g MgCl2. 6H20 加水至 11，並高壓滅菌；9、固定液多聚甲醛40g加IX緩衝液I至11，稍加熱(約50_60度)攪拌至溶 解；10、顯色劑 A =NBT Ig 加 70% DMFl 1. 44ml ；11、顯色劑 B =BCIP Ig 加 100% DMF30ml。
本發明的試劑盒可以多人份使用或一人份使用。實施例2一種PD-ECGF基因原位雜交檢測方法及其試劑盒應用一、標本處理1、用IOml的離心管，裝4. 5ml淋巴細胞分離液，再將3ml抗凝血緩慢加入含有淋 巴細胞分離液(血淋巴細胞分離液=1 1.5)的離心管中，2000r/min離心IOmin ；2、吸取中間層白細胞至另一離心管中，再在此管中加入約兩倍的IX緩衝液I，混 勻，1500g/min 離心 IOmin ；3、棄上清·沉澱加入約兩倍的1 X緩衝液I，混勻，1500g/min離心IOmin ；4、棄上清，並把試管口多餘的液體用擦手紙吸去。再將沉澱製成懸液，滴在玻片上 推片，自然乾燥。(有條件的醫院可以用製片機製片。)3ml血，可以做4張片子；5、用40ml 4%固定液，在玻璃缸中，固定30min，再用IX緩衝液I洗5min。每缸 可以放16片；6、標本可保存在_20°C，或繼續做實驗。二、將試劑盒中試劑配製成使用濃度1、將IOX緩衝液I用三蒸水按1 10稀釋成IX緩衝液I ；2、將20X緩衝液II用三蒸水按1 10稀釋成2X緩衝液II ；按1 100稀釋成0. 2X緩衝液II ；按1 200稀釋成0. 1 X緩衝液II ；3、將IOX緩衝液III用三蒸水按1 10稀釋成1 X緩衝液III ；4、10 X緩衝液IV用三蒸水按1 10稀釋成X緩衝液IV (取1#，2#，3#各10ml， 加水至IOOml既可)。三、實驗步驟1、取每位待檢者標本兩張，(另外兩張留作複查用)及陽性對照標本兩張(每次 實驗做一對陽性對照)；2、在玻璃缸裡加消化液(消化液IOOul加IX緩衝液199.9ml，即為使用濃 度)20ml。37°C水浴預熱10分鐘。放進16張玻片，37°C處理12min，再用1 X緩衝液I洗 5min ；3、用0. 2%的保護液(保護液Iml加IX緩衝液I99ml即為使用濃度)洗IOmin, 三蒸水洗5min，以上過程都在玻璃缸進行。玻片自然乾燥；4、將玻片放入保溼盒內，加預雜交液20ul/片.蓋上蓋玻片，蓋緊保溼盒，放在 42°C恆溫水浴箱中3h以上；5、取出玻片，棄去蓋玻片，將玻片放入玻璃缸內，用70%，90%，95%的乙醇各洗 2min,自然乾燥；6、將玻片放入保溼盒內，每位病人標本兩張，一張加正義雜交液20ul/片，另一張 加反義雜交液20ul/片，蓋上蓋玻片，蓋緊保溼盒，放在42°C恆溫水浴箱中16-24h ；7、取出玻片，棄去蓋玻片，將玻片放入玻璃缸內在42°C恆溫水浴箱中用2X緩衝液II洗兩次，每次15min在42°C恆溫水浴箱中用0. 2X緩衝液II洗一次，每次15min在42°C恆溫水浴箱中用0. 1 X緩衝液II洗兩次，每次15min ；
8、用IX緩衝液III洗30s，取出玻片，自然乾燥；9、將玻片放入保溼盒內，加0.5% 1封閉液(Iml封閉液加5mllX緩衝液 III) IOOul/片，蓋緊保溼盒，在室溫下作用30min ；10、取出玻片，用IX緩衝液III洗30s，自然乾燥；11、將玻片放入保溼盒內，加鹼性磷酸酶抗體(加入1.8ml 1 X緩衝液III) IOOul/ 片，蓋緊保溼盒在室溫下作用30min ；12、取出玻片，用IX緩衝液III洗3次，每次15min;13、IX緩衝液IV洗2min，加顯色劑(顯色劑A73. 3ul，顯色劑B157. 5ul加到30ml 1 X緩衝液IV中，混勻)，室溫避光12h以上；14、用三蒸水洗5min，自然乾燥，(用甘油加10%的IX緩衝液I混勻)封片鏡檢。四、結果判斷在光鏡下計數100-300個細胞，計算染上紫色細胞的百分比。陽性對照標本加反義雜交液的應該80%以上染上紫色。所有加正義雜交液的陰性內對照應無色。地高辛標記的cDNA、RNA和寡核苷酸探針，不但探針的具有生物素標記優點，還克 服了生物素標記的探針在原位雜交過程中受組織內源性生物素幹憂等缺點)，將該雜交探 針與人體血液白細胞的待測RNA核酸進行雜交，再用免疫組化的方法顯色，在光鏡下觀察 mRNA的存在和定位，根據染色的細胞數，判斷目的基因的表達量。本發明方法是目前常用的核酸原位雜交技術，該方法通過檢測底物細胞中的 PD-ECGF基因表達量，用來確定癌症是否發生和/或轉移。臨床研究表明，PD-ECGF基因具有廣譜性，因為PD-ECGF基因在正常人中表達低或 零表達。如果PD-ECGF基因高表達，說明癌症已經復發、轉移、擴散，從而獲得癌症的基因水 平的診斷信息。當檢測到PD-ECGF基因的表達高於正常對照時，則可預測受試者為癌症早 期轉移或癌症轉移易感者，這些癌症包括肝癌或膀胱癌。本發明實施例採樣為肝癌轉移病人5名，膀胱癌轉移病人5名，正常對照組5名。 抽所有待檢人的外周血3-5毫升(分離白細胞)做原位雜交。結果表示，所有癌症轉移病 人PD-ECGF基因有過度表達，細胞染色；正常對照組PD-ECGF基因不表達，細胞無染色。具 體結果請見圖1，圖2和圖3。實施例3用PD-ECGF基因試劑盒檢測膀胱癌轉移疾病與用CA125基因試劑盒檢測膀胱癌轉 移疾病之間平行實驗。為了科學評價上述基因各自在膀胱癌轉移疾病的特異性、敏感性、準確性。我們用 平行試驗的方法，同時檢測上述基因的mRNA，檢測技術採用核酸原位雜交技術，用同一例膀 胱癌轉移疾病患者的外周血，同時檢測PD-ECGF基因和CA125基因，NM-024690，(進行核酸 原位雜交、免疫組化染色、鏡下記數、結果報告等均採用實施例1和實施例2的原位雜交技 術的相同方法和步驟及試劑)。發現PD-ECGF基因在膀胱癌轉移疾病病人中表達量比CA125 基因在同一疾病病人的表達量要高。結果表明，PD-ECGF基因對膀胱癌轉移疾病診斷的特 異性、敏感性、準確性比CA125基因更好，原位雜交基因表達圖顯示，PD-ECGF基因的表達量 是70%，CA125基因的表達量是47%。本發明的試劑盒作於膀胱癌等轉移疾病診斷的指標有非常重要的臨床意義。SEQUENCE LISTING芮屈生物技術(上海)有限公司 一種PD-ECGF基因的原位雜交檢測試劑盒及其檢測方法和應用/1PatentIn version 3. 31970DNA 智人(Homo sapiens)1
0150]gaagcgggaaagggccacaatggggtctgggaggtgggcggggcggagcggggatgtcca600151]gccacgtcgctttgttttcccacgctaggagctaccacaacaggtgctgcgagccgtaag1200152]cgccccccacccgcgctatgggctcggacgCCtgggtgggCCtttggCggccacaccggc1800153]CCCgCggCCCcatcgcggcgcactacggaggccccgggcccaaatacaagctgccgccca2400154]acaccggctacgccctgcatgacccgtcgcggccgcgcgcccccgccttcaccttcggcg3000155]cgcgcttccccacgcagcagacgacgtgcggccccgggccaggccacctggtgcccgctc3600156]gcatgaccgtgcgcggcaccgacggcgcccccgcctactccatctacggccgcccacgcc4200157]gctcagcgcccttcctcactccgggacctggcaggtacttcccggagcgagcggggaacg4800158]cgacgtaccccagtgcgcctcggcacaccattgctccccgaaactggggtgtccaggcgg5400159]aacagcagagcccaggtcccgcggcctatacggtgccctcgctcttgggtccgcgcgtca6000160]tcggcaaagtctccgccccaacttgctccatctacggccgcagagcggctggcagtttct6600161]tcgaggacctcagcaagaccccgggcccctgcgcctatcaggtcgtgagtccaggggtct7200162]acaagtcccgggccccccagttcacgattctggcgcggacttcgctcccccaagacaaca7800163]ctcggaagccagggcccgcggcctacaacgtggatcagcaccggaagccccgcggctgga8400164]gtttcgggatccggcactcggactacctggccccgctggtgaccgacgcggacaactgac9000165]ccgccaggcgggagcggccccacacgtgtttgcttaaagtctgcgagtccgcatcgtgtc9600166]cgcctctctc970
權利要求
一種PD ECGF基因的原位雜交檢測試劑盒在製備檢測癌症早期轉移、復發疾病藥物中的應用，所述的試劑盒包括雜交探針、標記物，所述的雜交探針序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根據權利要求1所述的應用，其特徵在於所述的癌症是肝癌或膀胱癌。
3.根據權利要求1所述的應用，其特徵在於所述的雜交探針序列如SEQID NO. 1所 示的RNA序列。
4.根據權利要求1-3任一所述的應用，其特徵在於所述的標記物選自放射性核素或 非放射性標記物。
5.根據權利要求4所述的應用，其特徵在於所述的放射性核素選自3H、35S、125I或32P 中的一種。
6.根據權利要求4所述的應用，其特徵在於所述的非放射性標記物選自生物素、地高 辛、鹼性磷酸酶、辣根過氧化酶或螢光素中的一種。
7.根據權利要求6所述的應用，其特徵在於所述的非放射性標記物優選自地高辛。
8.根據權利要求1-3任一所述的應用，其特徵在於所述的試劑盒還包括增效劑，所述 的增效劑是鹼性磷酸酶抗體。
9.一種PD-ECGF基因的原位雜交檢測試劑盒，包括雜交探針、標記物，其特徵在於，所 述的雜交探針序列如SEQ ID NO. 1所示，所述的標記物選自放射性核素或非放射性標記物。
10.一種PD-ECGF基因的原位雜交檢測方法，其特徵在於，該方法包括以下步驟a、將權利要求9所述試劑盒中的雜交探針與底物中待測RNA接觸，形成雜交複合體；b、檢測a步驟得到的雜交複合體。
11.根據權利要求10所述的檢測方法，其特徵在於a步驟中形成雜交複合體的條件 為核酸雜交的溫度為42°C;核酸雜交的時間為16-24小時，所述的底物選用血液細胞標本 或組織細胞標本。
全文摘要
本發明涉及一種PD-ECGF血小板衍生內皮細胞生長因子(plateletderived endothelial cell growth factor，PD-ECGF)基因的原位雜交檢測試劑盒，包括雜交探針、標記物，所述的雜交探針序列如SEQ ID NO.1所示。本發明還提供了一種PD-ECGF基因原位雜交檢測方法。另外，本發明還提供了試劑盒在製備檢測癌症早期轉移、復發疾病藥物中的應用。本發明優點在於本發明提供的試劑盒具有靈敏度高、特異性強的特點。本發明的檢測方法操作方便、簡單，能在區級以上醫院普遍使用和推廣。
文檔編號C12Q1/68GK101993919SQ20091005615
公開日2011年3月30日 申請日期2009年8月10日 優先權日2009年8月10日 公開號200910056155.發明者張雲福, 裘建英 申請人:芮屈生物技術(上海)有限公司