β-類興奮劑的液質聯用測定方法

2023-12-05 08:46:21 2

專利名稱：：β-類興奮劑的液質聯用測定方法
技術領域：
：本發明涉及一種e-類興奮劑的液質聯用測定方法，特別是檢測飼料中P-類興奮劑的方法。
背景技術：
：鹽酸克倫特羅和萊克多巴胺都屬於P-類興奮劑，類興奮劑是一類人工合成藥物，主要用於防治人、獸支氣管哮喘和支氣管痙攣。e-類興奮劑能促進動物體內蛋白質沉積，抑制脂肪沉積，具有營養"再分配效應"。因此，有人用來作為飼料添加劑，提高豬酮體的瘦肉率。但是，它容易在動物臟器中積聚殘留，並可通過食物鏈進入人體，導致一系列的藥物殘留問題，如急性中毒有心悸，面、頸、四肢肌肉顫抖，手抖甚至不能站立，頭暈、全身無力、心動過速、室性早搏、心電圖示S-T段壓低與T波倒置；原有交感神經功能亢進的患者，如有高血壓、冠心病者上述症狀更易發生；糖尿病人可引起酮中毒，與糖皮質激素合用可引起低血鉀，從而導致心律失常，嚴重的可能危及生命。P-類興奮劑主要有鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、特布他林等。其中我國最早使用的是鹽酸克倫特羅，俗稱"瘦肉精"，但是在發生了一系列的"瘦肉精"中毒事件以後，為了保障人民的身體健康和生命安全，我國將鹽酸克倫特羅列入了禁用藥品目錄。然而人們為了追求畜牧業更快的發展和最佳的經濟效益，就使用鹽酸克倫特羅的替代品萊克多巴胺，動物在食用含萊克多巴胺的飼料後，會造成肌肉及組織中不同程度的殘留，導致消費者出現不同程度的中毒現象。目前，分別檢測鹽酸克倫特羅和萊克多巴胺的方法有高效液相色譜法、氣相色譜-質譜聯用法、酶聯免疫法等。但是，高效液相色譜法檢測靈敏度低，難以達到規定的最低檢測限；氣相色譜-質譜聯用法需要對樣品進行衍生化，實驗過程複雜；酶聯免疫法僅針對尿樣中的e-類興奮劑進行檢測，應用具有一定的局限性
發明內容本發明的目的是提供一種快速、準確的P-類興奮劑的液質聯用測定方法。本發明包括下列步驟A、樣品提取在樣品中加入2045ml提取溶劑，採用微波萃取法提取樣品中的目標物，微波萃取溫度在8010(TC，壓力為4.06.0atm，時間為812min，然後以轉速5000r/min離心25min，用2mol/LNaOH調pH至1112，得一次上清液；再用37ml乙酸乙酯萃取，重複萃取條件一次，得二次上清液，合併兩次上清液；提取溶劑為水和乙腈，水和乙腈的體積比為70:30;B、樣品淨化將A步驟合併後的上清液於6(TC旋轉蒸乾，用2ml濃度2%甲酸溶解，過OasisMCX小柱，先用2ml濃度100%的甲醇洗脫，棄去；再用2ml濃度8X的氨水溶液洗脫，棄去，氨水溶液中的甲醇與水的比例為30:70;最後用2ml體積百分含量為8%的氨水甲醇溶液洗脫，收集，氮氣吹乾，用流動相定容至lml，過0.22to微孔濾膜，上機；C、液相色譜檢測條件是色譜柱為ACQUITYUPLCTMC18柱，規格為2.lramX50ramX1.7陶，流動相為4mmol/L乙酸胺-乙腈，乙酸胺與乙腈的體積比為80:20，流速為3ml/min，進樣量為51^1，柱溫為室溫；D、質譜檢測條件是採用電噴霧離子源，負離子多反應檢測掃描；霧化器壓力為30psi;乾燥氣流速為7.5L/min;掃描範圍為190300m/z，加熱溫度35°C。本發明用微波萃取進行樣品前處理，具有理想的回收率和準確度，在超高壓液相色譜測定方法中所用流動相具有一定的ra緩衝能力，因此PH不易變化，從而保證了分析結果的重複性和重現性，同時由於超高壓液相色譜的柱效高，因而靈敏度高，檢測速度快，節省檢測時間。本發明能夠快速、準確地對飼料中3-類興奮劑進行定量測定，具有通用性，可較好地滿足實際工作的需要。本發明液質聯用方法是在現有高效液相色譜技術基礎上發展起來的，是以高效液相色譜為分離手段、質譜為檢測器的一門綜合性分析技術，具有液相色譜的高分離能力和質譜的高靈敏度、極強的定性專屬特異性的特點。但是由於液質聯用技術起步比較晚，之前進行的獸藥殘留檢測工作一般都用高效液相色譜進行分析，本發明第一次用液質聯用技術對e-類興奮劑的殘留進行了定性定量分析，通過反覆試驗，得到了最優的液相色譜測定條件和質譜條件。本發明採用的微波萃取法與超聲法、震蕩法、渦旋法相比具有提取效率高、速度快等優點，結果見表l;所用的提取溶劑與其他提取溶劑相比有較好的回收率，結果見表2。tableseeoriginaldocumentpage5津騰針筒式微孔濾膜0.22um有機系濾膜(上海安譜科學儀器有限公司)2)實驗試劑萊克多巴胺(Sigma公司)鹽酸克倫特羅(Sigma公司)乙酸乙酯(天津市科盟化工工貿有限公司)甲醇(色譜純)(德國Merck公司)乙腈(色譜純)(德國Merck公司)超純水(廣州屈臣氏食品飲料有限公司)甲酸(萊陽化工實驗廠)2.實驗設計如下1)在本實施例中，用鹽酸克倫特羅和萊克多巴胺的混合標準品摸索並確定最佳的色譜條件和質譜條件。2)用已確定的方法測定待測飼料，確定其是否含有鹽酸克倫特羅和萊克多巴胺。3)在待測飼料樣品中添加鹽酸克倫特羅和萊克多巴胺的標準品，測定方法的回收率、精密度以及最低檢測限。3.實驗方法如下1)加標樣品製備-準確稱取5.Og粉碎好的飼料於聚四氟乙烯微波萃取罐中，分別加入濃度為1.0mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg鹽酸克倫特羅和萊克多巴胺混合標準工作液，開口靜置過夜，待工作液中溶劑完全揮發，然後按照樣品處理步驟進行提取和淨化。2)樣品提取在製備好的樣品中，加入30ml提取溶劑(21ml乙腈+9ml水)，進行微波萃取，將上清液移至雞心瓶中，轉速5000r/min離心3min，然後用2mol/LNaOH調pH至11-12，再用5ral乙酸乙酯萃取，上清液移至另一雞心瓶中，重複一次，合併上清液。微波萃取條件溫度90°C;壓力5.Oatin;時間lOmin。3)樣品淨化將上清液於6(TC旋轉蒸乾，用2ml濃度2%甲酸溶解，過OasisMCX小柱後(OasisMCX小柱先用2ml甲醇活化，再用2ml水平衡)，用2ml甲醇洗脫，棄去；再用2ml濃度8%的氨水溶液(氨水溶液中的甲醇與水的比例為30:70)洗脫，棄去；最後用2ml體積百分含量為8%氨水甲醇溶液洗脫，收集，氮氣吹乾，用流動相定容至lml，過0.22Mm微孔濾膜，上機。4)液相色譜條件a)色譜柱ACQUITYUPLCC18(2.1mmX50畫X1.7Wn)柱；b)流動相4,1/1乙酸胺:乙腈二80:20;c)流速3ml/min;d)進樣量5W;e)柱溫室溫。5)質譜條件a)離子源電噴霧離子源；b)掃描方式負離子掃描；C)霧化氣壓力30psi;d)乾燥器流速7.5L/min;e)掃描範圍為190300m/z;f)加熱溫度35°C。4.實驗結果1)標準溶液的配製分別精密稱取50mg的鹽酸克倫特羅和萊克多巴胺標準品，用甲醇溶解並定容至100mL,配成2種濃度為500ug/ml的標準儲備溶液，再稀釋50倍即為10ug/ml的標準工作液，分別在4'C下保存。2)方法的標準曲線方程和相關係數將2種3-類興奮劑的標準工作液混合，取五個濃度分別為0.25ug/ml、0.5ug/ml、1.0ug/ml、2.0ug/ml、4.Oug/ml的混合液注入超高壓液相色譜-質譜/質譜聯用儀，2種0-類興奮劑的線性方程及相關係數見表4。表4兩種藥物的標準曲線方程和相關係數藥物名稱線性方程相關係數鹽酸克倫特羅Y=0.5386x+0.04370.9998萊克多巴胺Y二O.1252x+0.04500.9996Y-色譜峰面積；X-濃度3)方法的回收率和精密度對添加了1.0呢/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg鹽酸克倫特羅和萊克多巴胺混合標準溶液的飼料進行重複性試驗。每個濃度取3份平行樣，根據測定結果計算回收率和精密度，結果見表5。表5兩種藥物的回收率和精密度(n=6)組分tableseeoriginaldocumentpage84)方法的檢出限根據儀器響應值與噪音的比值為3來計算方法的檢出限，則鹽酸克倫特羅和萊克多巴胺的檢出限分別為8Pg/kg和5Pg/kg。<實施例2〉1.實驗儀器與試劑如下1)實驗儀器同實施例1;2)實驗試劑同實施例1;2.實驗方法如下1)加標樣品製備準確稱取5.Og粉碎好的飼料於聚四氟乙烯微波萃取罐中，分別加入濃度為LOmg/kg、2.0mg/kg、4.Omg/kg鹽酸克倫特羅和萊克多巴胺混合標準工作液，開口靜置過夜，待工作液中溶劑完全揮發，然後按照樣品處理步驟進行提取和淨化。2)樣品提取在製備好的樣品中，加入20ml提取溶劑(14ml乙腈+6tiil水)，進行微波萃取，將上清液移至雞心瓶中，轉速5000r/min離心2min，然後用2mol/LNaOH調pH至11-12，再用3ml乙酸乙酯萃取，上清液移至另一雞心瓶中，重複一次，合併上清液。微波萃取條件溫度8(TC;壓力4.Oatm;時間8min。83)樣品淨化將上清液於6(TC旋轉蒸乾，用2ml濃度2%甲酸溶解，過OasisMCX小柱後(OasisMCX小柱先用2ml甲醇活化，再用2ml水平衡)，用2ml甲醇洗脫，棄去；再用2ml濃度8%的氨水溶液(氨水溶液中的甲醇與水的比例為30:70)洗脫，棄去；最後用2ml體積百分含量為8%氨水甲醇溶液洗脫，收集，氮氣吹乾，用流動相定容至lml，過0.22Mm微孔濾膜，上機。4)液相色譜條件同實施例1;5)質譜條件同實施例1。3.實驗結果1)方法的回收率和精密度對添加了1.0mg/kg、2.0mg/kg、4.Omg/kg鹽酸克倫特羅和萊克多巴胺標準溶液的飼料進行重複性試驗。每個濃度取3份平行樣，根據測定結果計算回收率和精密度，結果見表6。表6兩種藥物的回收率和精密度(n二6)組分添加濃度(mg/kg)回收率平均值(％)變異係數(％)鹽酸克倫特羅1.081.55.92.081.95.74.083.25.0萊克多巴胺1.072.14.12.073.25.54.073.95.92)方法的檢出限根據儀器響應值與噪音的比值為3來計算方法的檢出限，則鹽酸克倫特羅和萊克多巴胺的檢出限分別為l叫g/kg和10Pg/kg。1.實驗儀器與試劑如下1)實驗儀器同實施例1;2)實驗試劑同實施例1;2.實驗方法如下1)加標樣品製備準確稱取5.0g粉碎好的詞料於聚四氟乙烯微波萃取罐中，分別加入濃度為1.0rag/kg、2.0mg/kg、4.Omg/kg鹽酸克倫特羅和萊克多巴胺混合標準工作液，開口靜置過夜，待工作液中溶劑完全揮發，然後按照樣品處理步驟進行提取和淨化。2)樣品提取在製備好的樣品中，加入45ml提取溶劑(31.5ml乙腈+13.5ml水)，進行微波萃取，將上清液移至雞心瓶中，轉速5000r/min離心5min，然後用2mol/LNaOH調pH至11-12，再用7ml乙酸乙酯萃取，上清液移至另一雞心瓶中，重複一次，合併上清液。微波萃取條件溫度IO(TC;壓力6.0atm;時間12min。3)樣品淨化將上清液於6(TC旋轉蒸乾，用2ml濃度2%甲酸溶解，過OasisMCX小柱後(OasisMCX小柱先用2ml甲醇活化，再用2ml水平衡)，用2ml甲醇洗脫，棄去；再用2ml濃度8X的氨水溶液(氨水溶液中的甲醇與水的比例為30:70)洗脫，棄去；最後用2ml體積百分含量為8%的氨水甲醇溶液洗脫，收集，氮氣吹乾，用流動相定容至lral，過0.22Wn微孔濾膜，上機。4)液相色譜條件同實施例1;5)質譜條件同實施例1;3.實驗結果l)方法的回收率和精密度對添加了1.0mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg鹽酸克倫特羅和萊克多巴胺標準溶液的飼料進行重複性試驗。每個濃度取3份平行樣，根據測定結果計算回收率和精密度，結果見表7。表7兩種藥物的回收率和精密度(n=6)tableseeoriginaldocumentpage102)方法的檢出限根據儀器響應值與噪音的比值為3來計算方法的檢出限，則鹽酸克倫特羅和萊克多巴胺的檢出限分別為lWg/kg和8Pg/kg。如圖所示圖1為2種藥物標準色譜圖。圖2為2種藥物標準質譜圖。圖3為添加濃度1.0mg/kg的飼料樣品的色譜圖。圖4為方法標準曲線圖。標準工作曲線的製備如下將濃度在0.25l^g/ml4.(￥g/ml的2種e-類興奮劑的混標註入液質聯用儀，以標準工作曲線樣品峰面積為縱坐標，標準品濃度為橫坐標，可得標準工作曲線。結果分析-鹽酸克倫特羅和萊克多巴胺在動物性產品中的殘留，可通過食物鏈進入人體，對人體具有明顯的急慢性毒性，嚴重的可能危及生命。目前，分別檢測鹽酸克倫特羅和萊克多巴胺的方法有高效液相色譜法、氣相色譜-質譜聯用法、酶聯免疫法等。但是，高效液相色譜法檢測靈敏度低，難以達到規定的最低檢測限；氣相色譜-質譜聯用法需要對樣品進行衍生化，實驗過程複雜；酶聯免疫法僅針對尿樣中的P-類興奮劑進行檢測，應用具有一定的局限性。從上述結果可知本實驗建立的液質聯用測定飼料中6-類興奮劑的方法，採用微波萃取法進行樣品前處理，只需要10min，與以往採用的超聲波提取方法所需30min相比，縮短了提取時間，提高了提取效率；另外採用超高壓液相色譜進行檢測，只需要3min，大大縮短了傳統的液相色譜檢測所需的時間(15min);而且最低檢測限分別達到了8Pg/kg和5J^g/kg,與液相色譜撿測相比降低了很多(液相色譜檢測的最低檢測限分別是125l^g/kg、10(￥g/kg);同時方法的回收率及精密度均達到殘留分析的要求，適合用於飼料中3-類興奮劑的分析。本方法的建立為解決如何更快、更精確地檢測類興奮劑的殘留找到了一條新的途徑，相信在這個平臺上我們將會研究出更多新的方法，以解決目前在獸藥殘留檢測領域中所存在的問題和不足。權利要求1.一種β-類興奮劑的液質聯用測定方法，其特徵在於它包括下列步驟A、樣品提取在樣品中加入20～45ml提取溶劑，採用微波萃取法提取樣品中的目標物，微波萃取溫度在80～100℃，壓力為4.0～6.0atm，時間為8～12min，然後以轉速5000r/min離心2～5min，用2mol/LNaOH調pH至11～12，得一次上清液；再用3～7ml乙酸乙酯萃取，重複萃取條件一次，得二次上清液，合併兩次上清液；提取溶劑為水和乙腈，水和乙腈的體積比為70∶30；B、樣品淨化將A步驟合併後的上清液於60℃旋轉蒸乾，用2ml濃度2％甲酸溶解，過OasisMCX小柱，先用2ml濃度100％的甲醇洗脫，棄去；再用2ml濃度8％的氨水溶液洗脫，棄去，氨水溶液中的甲醇與水的比例為30∶70；最後用2ml體積百分含量為8％的氨水甲醇溶液洗脫，收集，氮氣吹乾，用流動相定容至1ml，過0.22μm微孔濾膜，上機；C、液相色譜檢測條件是色譜柱為ACQUITYUPLCTMC18柱，規格為2.1mm×50mm×1.7μm，流動相為4mmol/L乙酸胺-乙腈，乙酸胺與乙腈的體積比為80∶20，流速為3ml/min，進樣量為5μl，柱溫為室溫；D、質譜檢測條件是採用電噴霧離子源，負離子多反應檢測掃描；霧化器壓力為30psi；乾燥氣流速為7.5L/min；掃描範圍為190～300m/z，加熱溫度35℃。全文摘要本發明公開了一種快速、準確的β-類興奮劑的液質聯用測定方法。它包括微波萃取法進行樣品前處理、超高壓液相色譜檢測和質譜檢測步驟，微波萃取的樣品前處理方法，具有理想的回收率和準確度；超高壓液相色譜測定方法中的流動相為4mmol/L乙酸胺∶乙腈＝80∶20；質譜檢測中的乾燥器流速為7.5L/min。所用流動相具有一定的pH緩衝能力，因此pH不易變化，從而保證了分析結果的重複性和重現性，同時由於超高壓液相色譜的柱效高，因而靈敏度高，檢測速度快，節省檢測時間。文檔編號G01N30/00GK101603954SQ200910117350公開日2009年12月16日申請日期2009年7月4日優先權日2009年7月4日發明者劉彩雲,唐守嶸,張文齊,慕婷婷,趙昊星,邵建寧,麻和平申請人:甘肅省科學院生物研究所