轉鐵蛋白受體檢測試劑盒及製備方法

2023-12-05 19:58:16 1

轉鐵蛋白受體檢測試劑盒及製備方法
【專利摘要】本發明涉及一種轉鐵蛋白受體含量檢測試劑盒，所述檢測試劑盒由試劑Ⅰ和試劑Ⅱ組成，所述試劑Ⅰ的組分包括：緩衝劑、防腐劑、螯合劑、表面活性劑和水；所述試劑Ⅱ的組分包括：包被抗轉鐵蛋白受體抗體的膠乳微球顆粒、緩衝劑、防腐劑、助懸劑和水；所述包被抗轉鐵蛋白受體抗體的膠乳顆粒的粒徑為120～200nm。還涉及轉鐵蛋白受體含量檢測試劑盒的製備方法，其中包被抗轉鐵蛋白受體抗體的膠乳微球顆粒採用化學交聯法製備；本發明通過選擇合適粒徑的氨基基團膠乳微球顆粒及使用化學交聯法製備膠乳微球顆粒，使製備的轉鐵蛋白受體檢測試劑盒提高了靈敏度和穩定性、延長了貨架期和開瓶穩定期。
【專利說明】轉鐵蛋白受體檢測試劑盒及製備方法
【技術領域】
[0001 ] 本發明涉及轉鐵蛋白受體含量檢測領域，尤其涉及一種轉鐵蛋白受體檢測試劑盒及製備方法。
【背景技術】
[0002]鐵以三種不同的方式分布於人體:約80%的鐵參與轉運氧的血紅蛋白和儲存氧的肌紅蛋白，還有幾種存在於細胞氧化和呼吸鏈的酶中。過剩的鐵與鐵蛋白和含鐵血黃素結合以備使用，因為游離的鐵對細胞是有毒性的。只有約0.1%的鐵在血液循環中被運輸，它們與轉鐵蛋白結合，從「產地」——與具有生理功能的鐵結合的蛋白(例如:在骨髓中合成的血紅蛋白)被運往「儲存地」(例如:肝中的鐵蛋白)。在健康的人體中，每天從食物中攝取大約Img的鐵，並且有等量的鐵丟失。紅細胞含有大多數的鐵，另外有少部分但是必不可少的鐵提供給肌肉和酶，使它們進行正常活動。過剩的鐵與鐵蛋白結合，儲存在不同的細胞中。
[0003]參與正常生理活動的鐵/生成水平的鐵的總量可由可溶性轉鐵蛋白受體(STfR)的量來反映。這種可溶性的細胞受體可介導結合了鐵的轉鐵蛋白進入紅細胞樣細胞前體。循環的可溶性受體與帶受體的細胞的密度成一定比例，隨著對鐵的需求量的增加和紅細胞量的增多而增多。
[0004]轉鐵蛋白受體是一穿膜的糖蛋白，它傾向於結合已經結合了二價鐵的轉鐵蛋白，並且通過受體介導的內吞作用進入細胞。所有的體細胞都在其表面表達轉鐵蛋白受體，但75?80%的轉鐵蛋白受體存在於骨髓的紅細胞樣細胞的前體中。肝和胎盤的組織中轉鐵蛋白受體的密度也很高。轉鐵蛋白受體的細胞外部分經剪切後成為可溶性轉鐵蛋白受體，它與細胞上的受體的濃度成一定的比例。測定可溶性轉鐵蛋白受體的主要目的是診斷是否缺鐵。由於它是一個極為靈敏的標誌物，診斷結果可與慢性疾病引起的貧血相區別。又由於它與紅細胞生成的量有關，因此它可作為監測紅細胞生成治療效果的最早的標誌物。
[0005]目前轉鐵蛋白受體的檢測產品其方法學多是基於普通的免疫比濁法和酶聯免疫法。普通的免疫比濁法是利用反應體系中的抗原抗體反應形成免疫複合物，在一定時間內複合物聚合出現濁度。該檢測方法較傳統的免疫化學定量方法敏感、快速、簡便，但是要求反應時形成的免疫複合物的數量和分子量達到一定高度，否則就難以測出。酶聯免疫法是使抗原或抗體與某種酶連接成酶標抗原或抗體，這種酶標抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在測定的最後加入酶反應的底物，底物被酶催化變為有色產物，有色產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，該檢測方法由於酶的催化效率很高，故可極大地放大反應效果，從而使測定方法達到很高的敏感度。但是酶聯免疫法檢測操作繁瑣、自動化程度低、耗時很長，不利於檢驗科的快速檢測，同時由於酶聯免疫適合批量檢測，因而不適用於單個樣本的及時檢測。膠乳增強免疫比濁法是近年來出現的一種體液蛋白均相免疫比濁檢測方法，它是通過在高分子膠乳微球的表面交聯抗體，當交聯有抗體的微球與抗原結合後，在短時間內會迅速聚集在一起，改變了反應液的散光性能或透光性能。而且，反應液散光性能或透光性能(即吸光度)的改變與被測抗原的濃度有較強的相關性，在一定範圍內可以反映被測抗原的濃度，該檢測方法省卻了 ELISA法反覆孵育和洗板等煩瑣操作步驟，幾分鐘就能獲得結果，省時省力。此外，此法操作步驟的簡化也相應地避免了許多人為操作因素和試劑、環境等外界因素的幹擾，能較真實地反映被測物質的含量。但是膠乳增強免疫比濁法檢測轉鐵蛋白受體試劑盒仍存在靈敏度和穩定性有待提高、貨架期及開瓶穩定期較短的問題。

【發明內容】

[0006]為了解決以上技術問題，本發明提供一種轉鐵蛋白受體檢測試劑盒及製備方法，通過選擇合適粒徑的氨基基團膠乳微球顆粒及使用化學交聯法製備膠乳微球顆粒，使製備的轉鐵蛋白受體檢測試劑盒提高了靈敏度和穩定性、延長了貨架期和開瓶穩定期。
[0007]—種轉鐵蛋白受體含量檢測試劑盒，所述檢測試劑盒由試劑I和試劑II組成，所述試劑I的組分包括:緩衝劑、防腐劑、螯合劑、表面活性劑和水；所述試劑II的組分包括:包被抗轉鐵蛋白受體抗體的膠乳微球顆粒、緩衝劑、防腐劑、助懸劑和水；所述包被抗轉鐵蛋白受體抗體的膠乳顆粒的粒徑為120?200nm。
[0008]在上述技術方案中，所述抗轉鐵蛋白受體抗體為單克隆抗體或多克隆抗體。
[0009]在上述技術方案中，所述緩衝液為磷酸鹽緩衝液；所述防腐劑為Proclin 300 ;所述螯合劑為乙二胺四乙酸二鈉；所述表面活性劑為吐溫20 ;所述助懸劑為乙二醇。
[0010]在上述技術方案中，每IL試劑I中各組分的用量為防腐劑:0.05_2mL,螯合劑為
0.l_5g，表面活性劑0.l_3mL，餘量為磷酸鹽緩衝溶液。
[0011]在上述技術方案中，每IL試劑I中各組分的用量為防腐劑:0.Ι-lmL，螯合劑為l-3g，表面活性劑l_2mL，餘量為磷酸鹽緩衝溶液。
[0012]在上述技術方案中，每IL試劑II中各組分的用量為:包被抗轉鐵蛋白受體抗體膠乳微球顆粒0.l_5g、防腐劑0.05-2mL、助懸劑5_50mL，餘量為磷酸鹽緩衝溶液。
[0013]在上述技術方案中，每IL試劑II中各組分的用量為:包被抗轉鐵蛋白受體抗體膠乳微球顆粒l_3g、防腐劑0.Ι-lmL、助懸劑10-30mL，餘量為磷酸鹽緩衝溶液；
[0014]在上述技術方案中，所述試劑I和試劑II的pH值範圍為6.5?8.5。
[0015]在上述技術方案中，包括以下步驟:(1)製備試劑1:將防腐劑、螯合劑、表面活性劑溶解於磷酸緩衝液中，充分溶解，混合均勻，並用磷酸緩衝液定容，得到試劑I ;(2)製備試劑I1:製備包被抗轉鐵蛋白受體抗體的膠乳微球顆粒溶液；將防腐劑、助懸劑溶解於磷酸緩衝液中；將膠乳微球顆粒溶液與混合溶液混勻，定容，得到試劑II。
[0016]在上述技術方案中，所述包被抗轉鐵蛋白受體抗體的膠乳微球顆粒採用化學交聯法製備得到，所述化學交聯法製備包被轉鐵蛋白受體抗體的膠乳微球顆粒包括以下步驟:
[0017](I)洗滌膠乳:取適量氨基膠乳微球顆粒溶液用活化緩衝液稀釋，震蕩混合均勻，再加入表面活性劑，震蕩混合均勻，離心棄上清，保留沉澱，沉澱用6mmol/L磷酸緩衝液重懸；
[0018](2)抗體溶液的配製:取抗體溶液，用6mmol/L磷酸緩衝液稀釋，調pH到5.0 ；
[0019](3) EDC溶液的配製:取EDC粉末用去離子水配製成濃度為10mg/mL的EDC溶液；
[0020](4)抗體偶聯膠乳微球顆粒的製備:將步驟(I)所得膠乳微球顆粒重懸液與步驟(2)所得抗體溶液混合，室溫下培育15-30分鐘；再加入步驟(3)所得EDC溶液；用0.1M氫氧化鈉溶液調整反應體系的PH至6.0-7.0,室溫條件下在搖床上反應2-3小時；
[0021](5)向步驟(4)中反應完成的體系中加入BSA溶液，反應10_15分鐘，離心棄上清，並用6mmol/L磷酸緩衝液洗漆沉澱2次,後用6mmol/L磷酸緩衝液重懸沉澱,既得包被抗轉鐵蛋白受體抗體的膠乳微球顆粒溶液。
[0022]本發明的檢測試劑盒通過實驗篩選膠乳顆粒粒徑及類型，優選直徑為120_200nm的氨基基團膠乳微球顆粒作為製備本發明檢測試劑盒的原料之一，合適的粒徑能有效保證所製備的檢測試劑盒的穩定性、靈敏度以及良好的檢測線性範圍；抗轉鐵蛋白受體的抗體包被優選粒徑的膠乳微球顆粒採用特定的化學交聯法，將抗體與膠乳微球顆粒上的基團通過化學鍵的方式結合到一起的，化學鍵的穩定性較強，能保證檢測試劑盒中包被抗體的膠乳微球顆粒的穩定性，進而保證了檢測試劑盒品質的穩定性，延長了試劑盒的貨架期和開瓶穩定期。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1為本發明實施例1-5製備的轉鐵蛋白受體含量檢測試劑盒標準工作曲線；
[0024]圖2為本發明實施例2製備的檢測試劑盒與酶聯免疫檢測試劑盒測定人血清中轉鐵蛋白受體含量其結果的相關性圖；
[0025]圖3為本發明實施例4製備的檢測試劑盒熱穩定性檢驗結果圖；
圖4為本發明實施例提供的檢測試劑盒製備過程中抗轉鐵蛋白受體的抗體包被膠乳微球顆粒原理圖。
【具體實施方式】
[0026]下面結合附圖和實施例對本發明的技術方案進行詳細描述。
[0027]實施例1
[0028]包被抗轉鐵蛋白受體抗體的膠乳微球顆粒溶液的製備:
[0029](I)洗滌膠乳:取0.5mL粒徑為120 nm濃度為10% (w/v)的氨基膠乳微球顆粒(購自Poly Microspheres公司)於10 mL離心管中，向離心管中加入4.5 mL 0.12 mol/LpH值為7.4的磷酸鹽(PBS)緩衝液，離心得膠乳微球顆粒，用去離子水重複洗滌兩次膠乳微球顆粒，後用5 mL濃度為6 mmol/L pH值為7.4的磷酸鹽(PBS)緩衝液重懸膠乳微球顆粒；
[0030](2)抗體溶液的配製:取一定量的抗體溶液(購自臺灣Abnova Corporation),用6mmol/L磷酸緩衝液稀釋,調pH到5.0 ；
[0031](3) EDC溶液的配製:取10 mg的EDC粉末用10 mL去離子水溶解，配製成濃度為10mg/mL 的 EDC 溶液；
[0032](4)抗體偶聯膠乳微球顆粒的製備:取5mL (I)步所得膠乳微球顆粒重懸液與5mL(2)步所得抗體溶液按照1:1混勻，室溫下培育25分鐘；再加入3mL的(3)步所得EDC溶液；用0.1M氫氧化鈉溶液調整反應體系的pH至6.5，室溫條件下在搖床上反應2.5小時。
[0033](5)向(4)步反應完成的體系中加入2 mL 1% (w/v)濃度的BSA溶液，反應15分鐘，離心棄上清，並用6mmol/L磷酸緩衝液洗漆沉澱2次,後用lmL6mmol/L磷酸緩衝液重懸沉澱，既得包被抗轉鐵蛋白受體抗體的膠乳微球顆粒溶液。
[0034]檢測試劑盒的製備:
[0035]1、試劑I的製備:[0036]按所述用量取各組分:
[0037]Procline 3000.5mL
[0038]乙二胺四乙酸二鈉1.5g
[0039]吐溫201.2mL
[0040]將上述各組分溶解於900mL pH為7.0濃度為0.05mol/L磷酸緩衝液中，用lmol/L氫氧化鈉溶液調節溶液PH至7.0，後用pH為7.0濃度為0.05mol/L磷酸緩衝液定容至1L，密封4 °C保存，備用。
[0041]2、試劑II的製備:
[0042]按所述用量量取各組分:
[0043]Procline3000.5mL
[0044]乙二醇25mL
[0045]將上述各組分溶解於SOOmLpH為7.0濃度為0.05mol/L磷酸緩衝液中，攪拌、充分溶解後加入35份上述製備得到的包被肝型脂肪酸結合蛋白抗體的膠乳顆粒溶液，充分混勻之後，用lmol/L氫氧化鈉溶液調節溶液pH至7.0，後用pH為7.0濃度為0.05mol/L磷酸緩衝液定容至1L，密封4°C保存，備用。
[0046]實施例2
[0047]包被抗轉鐵蛋白受體抗體的膠乳微球顆粒溶液的製備:
[0048](I)洗漆膠乳:取0.6mL粒徑為160 nm濃度為10% (w/v)的氨基膠乳微球顆粒(購自Poly Microspheres公司)於IOmL離心管中，向離心管中加入4.4mL 0.12mol/L pH值為7.4的磷酸鹽(PBS)緩衝液，離心得膠乳微球顆粒，用去離子水重複洗滌兩次膠乳微球顆粒，後用5mL濃度為5mmol/L pH值為7.4的磷酸鹽(PBS)緩衝液重懸膠乳微球顆粒；
[0049](2)抗體溶液的配製:取一定量的抗體溶液(購自臺灣Abnova Corporation),用6mmol/L磷酸緩衝液稀釋,調pH到5.0 ；
[0050] (3) EDC溶液的配製:取IOmg的EDC粉末用IOmL去離子水溶解，配製成濃度為10mg/mL 的 EDC 溶液；
[0051](4)抗體偶聯膠乳微球顆粒的製備:取5mL (I)步所得膠乳微球顆粒重懸液與5mL(2)步所得抗體溶液按照1:1混勻，室溫下培育20分鐘；再加入4mL的(3)步所得EDC溶液；用0.1M氫氧化鈉溶液調整反應體系的pH至6.5，室溫條件下在搖床上反應2.5小時；
[0052](5)向(4)步反應完成的體系中加入3mL 1% (w/v)濃度的BSA溶液，反應20分鐘，離心棄上清，並用6mmol/L磷酸緩衝液洗漆沉澱2次,後用lmL5mmol/L磷酸緩衝液重懸沉澱，既得包被抗轉鐵蛋白受體抗體的膠乳微球顆粒溶液。
[0053]檢測試劑盒的製備:
[0054]1、試劑I的製備:
[0055]按所述用量取各組分:
[0056]Procline3000.25mL
[0057]乙二胺四乙酸二鈉2g
[0058]吐溫201.5mL
[0059]將上述各組分溶解於900mL pH為7.2濃度為0.05mol/L磷酸緩衝液中，用lmol/L氫氧化鈉溶液調節溶液pH至7.2，後用pH為7.2濃度為0.05mol/L磷酸緩衝液定容至1L，密封4 °C保存，備用。
[0060]2、試劑II的製備:
[0061]按所述用量量取各組分:
[0062]Procline3000.25mL
[0063]乙二醇20mL
[0064]將上述各組分溶解於800mL pH為7.2濃度為0.05mol/L磷酸緩衝液中，攪拌、充分溶解後加入30份上述製備得到的包被肝型脂肪酸結合蛋白抗體的膠乳顆粒溶液，充分混勻之後，用lmol/L氫氧化鈉溶液調節溶液pH至7.2，後用pH為7.2濃度為0.05mol/L磷酸緩衝液定容至1L，密封4°C保存，備用。[0065]實施例3
[0066]包被抗轉鐵蛋白受體抗體的膠乳微球顆粒溶液的製備:
[0067](I)洗滌膠乳:取0.8mL粒徑為200 nm濃度為10% (w/v)的氨基膠乳微球顆粒(購自Poly Microspheres公司)於IOmL離心管中，向離心管中加入4.2mL0.12mol/L pH值為7.4的磷酸鹽(PBS)緩衝液，離心得膠乳微球顆粒，用去離子水重複洗滌兩次膠乳微球顆粒，後用5mL濃度為5mmol/L pH值為7.4的磷酸鹽(PBS)緩衝液重懸膠乳微球顆粒；
[0068](2)抗體溶液的配製:取一定量的抗體溶液(購自臺灣Abnova Corporation),用6mmol/L磷酸緩衝液稀釋,調pH到5.0 ；
[0069](3) EDC溶液的配製:取IOmg的EDC粉末用IOmL去離子水溶解，配製成濃度為10mg/mL 的 EDC 溶液；
[0070](4)抗體偶聯膠乳微球顆粒的製備:取5mL (I)步所得膠乳微球顆粒重懸液與5mL
(2)步所得抗體溶液按照1:1混勻，室溫下培育20分鐘；再加入4mL的(3)步所得EDC溶液；用0.1M氫氧化鈉溶液調整反應體系的pH至6.5，室溫條件下在搖床上反應2.5小時。
[0071](5)向(4)步反應完成的體系中加入3mL 1% (w/v)濃度的BSA溶液，反應20分鐘，離心棄上清，並用6mmol/L磷酸緩衝液洗漆沉澱2次,後用lmL5mmol/L磷酸緩衝液重懸沉澱，既得包被抗轉鐵蛋白受體抗體的膠乳微球顆粒溶液。
[0072]檢測試劑盒的製備:
[0073]1、試劑I的製備:
[0074]按所述用量取各組分:
[0075]Procline3000.6mL
[0076]乙二胺四乙酸二鈉1.8g
[0077]吐溫201.0mL
[0078]將上述各組分溶解於900mLpH為7.2濃度為0.05mol/L磷酸緩衝液中，用lmol/L氫氧化鈉溶液調節溶液pH至7.2，後用pH為7.2濃度為0.05mol/L磷酸緩衝液定容至1L，密封4 °C保存，備用。
[0079]2、試劑II的製備:
[0080]按所述用量量取各組分:
[0081]Procline3000.BmT,
[0082]乙二醇15mL
[0083]將上述各組分溶解於SOOmLpH為7.2濃度為0.05mol/L磷酸緩衝液中，攪拌、充分溶解後加入26份上述製備得到的包被肝型脂肪酸結合蛋白抗體的膠乳顆粒溶液，充分混勻之後，用lmol/L氫氧化鈉溶液調節溶液pH至7.2，後用pH為7.2濃度為0.05mol/L磷酸緩衝液定容至1L，密封4°C保存，備用。
[0084]實施例4
[0085]包被抗轉鐵蛋白受體抗體的膠乳微球顆粒溶液的製備:
[0086](1)洗漆膠乳:取0.5mL粒徑為140nm濃度為10% (w/v)的氨基膠乳微球顆粒(購自Poly Microspheres公司)於IOmL離心管中，向離心管中加入4.5mL 0.12mol/L pH值為7.2的磷酸鹽(PBS)緩衝液，離心得膠乳微球顆粒，用去離子水重複洗滌兩次膠乳微球顆粒，後用5mL濃度為5mmol/L pH值為7.2的磷酸鹽(PBS)緩衝液重懸膠乳微球顆粒；
[0087](2)抗體溶液的配製:取一定量的抗體溶液(購自臺灣Abnova Corporation),用5mmol/L磷酸緩衝液稀釋,調pH到5.0 ；
[0088](3) EDC溶液的配製:取IOmg的EDC粉末用IOmL去離子水溶解，配製成濃度為10mg/mL 的 EDC 溶液；
[0089](4)抗體偶聯膠乳微球顆粒的製備:取5mL (I)步所得膠乳微球顆粒重懸液與5mL
(2)步所得抗體溶液按照1:1混勻，室溫下培育18分鐘；再加入2mL的(3)步所得EDC溶液；用0.1M氫氧化鈉溶液調整反應體系的pH至6.5，室溫條件下在搖床上反應2.5小時。
[0090](5)向(4)步反應完成的體系中加入4mL 1% (w/v)濃度的BSA溶液，反應20分鐘，離心棄上清，並用5mmol/L磷酸緩衝液洗漆沉澱2次,後用ImL 5mmol/L磷酸緩衝液重懸沉澱，既得包被抗轉鐵蛋白受體抗體的膠乳微球顆粒溶液。
[0091]檢測試劑盒的製備:
[0092]1、試劑I的製備:
[0093]按所述用量取各組分:
[0094]Procline3001.2mL
[0095]乙二胺四乙酸二鈉3.5g
[0096]吐溫202.5mL
[0097]將上述各組分溶解於900mL pH為7.2濃度為0.05mol/L磷酸緩衝液中，用lmol/L氫氧化鈉溶液調節溶液pH至7.2，後用pH為7.2濃度為0.05mol/L磷酸緩衝液定容至1L，密封4 °C保存，備用。
[0098]2、試劑II的製備:
[0099]按所述用量量取各組分:
[0100]Procline3001.2mL
[0101]乙二醇40mL
[0102]將上述各組分溶解於800mL pH為7.2濃度為0.05mol/L磷酸緩衝液中，攪拌、充分溶解後加入32份上述製備得到的包被肝型脂肪酸結合蛋白抗體的膠乳顆粒溶液，充分混勻之後，用lmol/L氫氧化鈉溶液調節溶液pH至7.2，後用pH為7.2濃度為0.05mol/L磷酸緩衝液定容至1L，密封4°C保存，備用。
[0103]實施例5
[0104]包被抗轉鐵蛋白受體抗體的膠乳微球顆粒溶液的製備:
[0105](I)洗漆膠乳:取0.5mL粒徑為180nm濃度為10% (w/v)的氨基膠乳微球顆粒(購自Poly Microspheres公司)於IOmL離心管中，向離心管中加入4.5mL 0.12mol/L pH值為7.6的磷酸鹽(PBS)緩衝液，離心得膠乳微球顆粒，用去離子水重複洗滌兩次膠乳微球顆粒，後用5mL濃度為6mmol/L pH值為7.6的磷酸鹽(PBS)緩衝液重懸膠乳微球顆粒；
[0106](2)抗體溶液的配製:取一定量的抗體溶液(購自臺灣Abnova Corporation),用6mmol/L磷酸緩衝液稀釋,調pH到5.0 ；
[0107](3) EDC溶液的配製:取IOmg的EDC粉末用IOmL去離子水溶解，配製成濃度為10mg/mL 的 EDC 溶液；
[0108](4)抗體偶聯膠乳微球顆粒的製備:取5mL (I)步所得膠乳微球顆粒重懸液與5mL
(2)步所得抗體溶液按照1:1混勻，室溫下培育20分鐘；再加入4mL的(3)步所得EDC溶液；用0.1M氫氧化鈉溶液調整反應體系的pH至6.5，室溫條件下在搖床上反應2.5小時。
[0109](5)向(4)步反應完成的體系中加入5mL 1% (w/v)濃度的BSA溶液，反應20分鐘，離心棄上清，並用6mmol/L磷酸緩衝液洗漆沉澱2次,後用ImL 6mmol/L磷酸緩衝液重懸沉澱，既得包被抗轉鐵蛋白受體抗體的膠乳微球顆粒溶液。
[0110]檢測試劑盒的製備:
[0111]1、試劑I的製備:
[0112]按所述用量取各組分:
[0113] Procline3002.5mL
[0114]乙二胺四乙酸二鈉3.0g
[0115]吐溫202.2mL
[0116]將上述各組分溶解於900mL pH為7.2濃度為0.05mol/L磷酸緩衝液中，用lmol/L氫氧化鈉溶液調節溶液pH至7.2，後用pH為7.2濃度為0.05mol/L磷酸緩衝液定容至1L，密封4 °C保存，備用。
[0117]2、試劑II的製備:
[0118]按所述用量量取各組分:
[0119]Procline3002.5mL
[0120]乙二醇35mL
[0121]將上述各組分溶解於800mL pH為7.2濃度為0.05mol/L磷酸緩衝液中，攪拌、充分溶解後加入35份上述製備得到的包被肝型脂肪酸結合蛋白抗體的膠乳顆粒溶液，充分混勻之後，用lmol/L氫氧化鈉溶液調節溶液pH至7.2，後用pH為7.2濃度為0.05mol/L磷酸緩衝液定容至1L，密封4°C保存，備用。
[0122]檢測試劑盒分析性能評估
[0123]1、線性範圍
[0124]配製濃度為Onmol ZmT,, I Onmo I/mL, 20nmol/mL, 40nmol/mL, 80nmol/mL 的轉鐵蛋白受體標準品溶液，用本發明實施例1-5所製備的轉鐵蛋白受體含量檢測試劑盒對其進行檢測，繪製各檢測試劑盒標準工作曲線。
[0125]本發明檢測試劑盒檢測樣本中轉鐵蛋白受體含量的流程如下:向5uL待檢測樣本(校準管以校準品做樣品，空白以蒸懼水為樣品，校準品購自臺灣Abnova Corporation公司)中加入150uL的試劑I充分混勻，於37°C恆溫5分鐘，再向混合體系中加入50uL試劑II，混勻，37°C恆溫I分鐘後，空白管調零，波長540nm，測定各管吸光度Al，4分鐘後測定各管吸光度A2，計算ΛΑ = Α2-Α1。根據多點校準品濃度和對應吸光度變化值ΛΑ，採用多點非線性校準模式確定工作曲線，樣本吸光度變化在工作曲線上相對應的濃度值即為測定濃度。
[0126]測定結果見圖1。從圖1可以看出本發明實施例1-5所製備的檢測試劑盒具有良好的線性，另本發明採用最優化的條件製備出的試劑盒(實施例2)，其標準工作曲線較其餘優選條件製備出的試劑盒線性更優良。
[0127]2、最低檢測限
[0128]取本發明實施例2製備的檢測試劑盒，以5%人血清白蛋白為空白樣本，按照上述測定「線性範圍」的實驗方法，重複測定20次，計算結果均值為0.0006，標準差S為
0.00012，以空白均值加兩倍標準差方法計算吸光度變化量為0.00084，用稀釋後濃度分別為0.25nmol/mL、0.5nmol/mL和1.0nmo I/mL的轉鐵蛋白受體校準品溶液測定，吸光度變化值分別為0.0002,0.0008和0.0013，其中濃度為0.5nmol/mL轉鐵蛋白受體校準品溶液Λ A略高於空白均值加兩倍標準差方法來計算值，因此，本發明檢測試劑盒檢測轉鐵蛋白受體的靈敏度為0.5nmol/mL。
[0129]3、本發明試劑盒與酶聯免疫分析試劑盒測值的相關性試驗
[0130]3.1供試試劑盒
[0131]本發明實施例 2所製備的轉鐵蛋白受體含量檢測試劑盒，酶聯免疫試劑盒(購自美國R&D Systems公司)；
[0132]3.2試驗方法及結果
[0133]通過本發明實施例2所製備的轉鐵蛋白受體含量檢測試劑盒與購自美國R&D公司的酶聯免疫試劑盒測定尿液樣本中轉鐵蛋白受體含量的測定值進行比較，試驗結果如圖2所示，並進行回歸分析。從圖2中可以看出本發明實施例2所製備的轉鐵蛋白受體檢測試劑盒與酶聯免疫檢測試劑盒在測定樣本中轉鐵蛋白受體含量方面具有良好的相關性。
[0134]4、試劑盒的重複性和準確度試驗
[0135]用購自臺灣Abnova公司的轉鐵蛋白受體溶液稀釋成濃度為10nmol/mL樣本,用本發明實施例1、實施例2、實施例3製備的轉鐵蛋白受體含量檢測試劑盒測定稀釋樣本，每個實施例製備的檢測試劑盒重複測定10次，分別計算測定均值(M)和標準差(S)，以S/MX 100%計算變異係數進行重複性考察，以(I一M/樣本濃度)X 100%計算相對偏差進行準確度考察，實驗結果見下表1，由表1的結果可知本發明實施例2採用最優粒徑製備的檢測試劑盒其準確度及精密度優於採用其他粒徑製備的檢測試劑盒。
[0136]表1實施例檢測試劑盒的重複性及其準確度結果
[0137]
【權利要求】
1.一種轉鐵蛋白受體含量檢測試劑盒，其特徵在於，所述檢測試劑盒由試劑I和試劑II組成，所述試劑I的組分包括:緩衝劑、防腐劑、螯合劑、表面活性劑和水；所述試劑II的組分包括:包被抗轉鐵蛋白受體抗體的膠乳微球顆粒、緩衝劑、防腐劑、助懸劑和水；所述包被抗轉鐵蛋白受體抗體的膠乳顆粒的粒徑為120~200nm。
2.如權利要求1所述的轉鐵蛋白受體含量檢測試劑盒，其特徵在於:所述抗轉鐵蛋白受體抗體為單克隆抗體或多克隆抗體。
3.如權利要求1所述的轉鐵蛋白受體含量檢測試劑盒，其特徵在於:所述緩衝液為磷酸鹽緩衝液；所述防腐劑為Proclin 300 ;所述螯合劑為乙二胺四乙酸二鈉；所述表面活性劑為吐溫20 ;所述助懸劑為乙二醇。
4.如權利要求1中所述的轉鐵蛋白受體含量檢測試劑盒，其特徵在於:每IL試劑I中各組分的用量為防腐劑:0.05-2mL，螯合劑為0.l_5g，表面活性劑0.l_3mL，餘量為磷酸鹽緩衝溶液。
5.如權利要求1中所述的轉鐵蛋白受體含量檢測試劑盒，其特徵在於:每IL試劑I中各組分的用量為防腐劑:0.Ι-lmL，螯合劑為l_3g，表面活性劑l_2mL，餘量為磷酸鹽緩衝溶液。
6.根據權利要求1所述的轉鐵蛋白受體含量檢測試劑盒，其特徵在於:每IL試劑II中各組分的用量為:包被抗轉鐵蛋白受體抗體膠乳微球顆粒0.l_5g、防腐劑0.05-2mL、助懸劑5-50mL，餘量為磷酸鹽緩衝溶液。
7.根據權利要求1所述的轉鐵蛋白受體含量檢測試劑盒，其特徵在於:每IL試劑II中各組分的用量為:包被抗轉鐵蛋白受體抗體膠乳微球顆粒l_3g、防腐劑0.Ι-lmL、助懸劑10-30mL,餘量為磷酸鹽緩衝溶液。
8.根據權利要求1所述的轉鐵蛋白受體含量檢測試劑盒，其特徵在於:所述試劑I和試劑II的PH值範圍為6.5~8.5。
9.一種權利要求1-8中任一項所述的轉鐵蛋白受體含量檢測試劑盒的製備方法，其特徵在於:包括以下步驟:(1)製備試劑1:將防腐劑、螯合劑、表面活性劑溶解於磷酸緩衝液中，充分溶解，混合均勻，並用磷酸緩衝液定容，得到試劑I ;(2)製備試劑I1:製備包被抗轉鐵蛋白受體抗體的膠乳微球顆粒溶液；將防腐劑、助懸劑溶解於磷酸緩衝液中；將膠乳微球顆粒溶液與混合溶液混勻，定容，得到試劑II。
10.如權利要求9所述的轉鐵蛋白受體含量檢測試劑盒的製備方法，其特徵在於:所述包被抗轉鐵蛋白受體抗體的膠乳微球顆粒採用化學交聯法製備得到，所述化學交聯法製備包被轉鐵蛋白受體抗體的膠乳微球顆粒包括以下步驟: (1)洗滌膠乳:取適量氨基膠乳微球顆粒溶液用活化緩衝液稀釋，震蕩混合均勻，再加入表面活性劑，震蕩混合均勻，離心棄上清，保留沉澱，沉澱用6mmol/L磷酸緩衝液重懸； (2)抗體溶液的配製:取抗體溶液，用6mmol/L磷酸緩衝液稀釋，調pH到5.0 ； (3)EDC溶液的配製:取EDC粉末用去離子水配製成濃度為10mg/mL的EDC溶液； (4)抗體偶聯膠乳微球顆粒的製備:將步驟(1)所得膠乳微球顆粒重懸液與步驟(2)所得抗體溶液混合，室溫下培育15-30分鐘；再加入步驟(3)所得EDC溶液；用0.1M氫氧化鈉溶液調整反應體系的PH至6.0-7.0，室溫條件下在搖床上反應2-3小時； (5)向步驟(4)中反應完成的體系中加入BSA溶液，反應10-15分鐘，離心棄上清，並用6mmol/L磷酸緩衝液洗漆 沉澱2次,後用6mmol/L磷酸緩衝液重懸沉澱,既得包被抗轉鐵蛋白受體抗體的膠乳微球顆粒溶液。
【文檔編號】G01N33/68GK103954766SQ201410035490
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年1月24日 優先權日:2014年1月24日
【發明者】華權高, 來祥兵, 許可, 沈鶴霄, 舒芹 申請人:武漢生之源生物科技有限公司