一種測定血漿中5,6‑二氫‑7,8‑二甲基‑4,5‑二氧‑4‑氫‑吡喃喹啉‑2‑羧酸濃度的方法與流程

2023-12-05 22:43:21

本發明屬於藥物分析技術領域，涉及體內藥物的分析測定方法，具體涉及一種測定血漿中5，6-二氫-7，8-二甲基-4，5-二氧-4-氫-吡喃喹啉-2-羧酸濃度的方法。

背景技術：

瑞吡司特是抗變態反應藥，在體內能迅速脫脂化為活性代謝產物5，6-二氫-7，8-二甲基-4，5-二氧-4-氫-吡喃喹啉-2-羧酸(亦稱MY-1250)，通過MY-1250抑制組胺、過敏性慢反應物質、血小板激活因子等化學介質的釋放而發揮抗哮喘作用。支氣管哮喘患者口服瑞吡司特，能抑制抗原引起的肺功能下降和皮膚過敏反應，臨床上主要用於支氣管哮喘的預防和治療。目前關於人體口服瑞吡司特片或顆粒後血漿中活性代謝產物MY-1250的測定方法沒有文獻報導。

技術實現要素：

針對上述問題，本發明提供了一種測定血漿中5，6-二氫-7，8-二甲基-4，5-二氧-4-氫-吡喃喹啉-2-羧酸濃度的方法。

本發明採用的技術方案是：

一種測定血漿中5，6-二氫-7，8-二甲基-4，5-二氧-4-氫-吡喃喹啉-2-羧酸濃度的方法，其特徵在於，血漿樣品經預處理後經液質聯用系統檢測其濃度，具體方法包括如下步驟：

(1)血漿樣品預處理：取血漿樣品，加入鹽酸溶液酸化，加入內標左乙拉西坦溶液，加入甲醇沉澱蛋白，高速離心，吸取上清液，加入去離子水，混勻後進樣；

(2)將步驟(1)預處理後的血漿樣品進行液相色譜分離；

色譜柱為Agilent ZORBAX Eclipse C18，4.6×100mm，3.5μm；流動相：甲醇和水相，水相為6mmoL·L-1醋酸銨水溶液，水相中 按照體積比含有0.02％氨水；

梯度洗脫：0-8.5min，水相與甲醇的體積比為75∶25；8.6-9.6min，水相與甲醇的體積比為5∶95；9.7-13.0min，水相與甲醇的體積比為75∶25；柱溫為35℃；流速為800μL·min-1；進樣量：50μL；

(3)質譜測定：

條件包括：

離子源：電噴霧離子化電離源ESI；離子檢測方式：多反應監測；離子極性：正離子；離子源電壓IS：4500V；離子源溫度TEM：750℃；碰撞氣CAD：8L·min-1；氣簾氣CUR：35L·min-1；離子源Gas1：65L·min-1；離子源Gas2：70L·min-1；檢測對象的離子選擇通道：MY-1250，[M+H]+，m/z 286.1/198.2，DP106，EP10，CE47，CXP15；內標左乙拉西坦，[M+H]+，m/z 171.3/126.2，DP27，EP6，CE40，CXP10；

(4)計算：採用內標法，以5，6-二氫-7，8-二甲基-4，5-二氧-4-氫-吡喃喹啉-2-羧酸和內標左乙拉西坦的峰面積比值代入標準曲線方程計算5，6-二氫-7，8-二甲基-4，5-二氧-4-氫-吡喃喹啉-2-羧酸濃度。

優選的，步驟(1)中，於1.5mL塑料離心管中精密加入血漿樣品600μL，精密加入12μL鹽酸溶液(5mol·L-1)，精密吸取酸化後的受試者血漿樣本204μL，精密加入內標400ng·mL-1左乙拉西坦溶液50μL，旋渦10s，加入600μL甲醇沉澱蛋白，渦旋1min，於15000rpm、4℃離心5min。吸取400μL上清液至進樣瓶中，加入800μL水，渦旋混勻，進樣測定。

優選的，所述的血漿為口服瑞吡司特片或顆粒後的血漿。

優選的，所述血漿為人或動物的血漿。

需要指出的是：其中，所述的血漿為口服瑞吡司特片或顆粒後的血漿。本發明方法重點是保護口服瑞吡司特片或顆粒後，血漿內MY-1250的檢測方法，從而為研究MY-1250的體內代謝奠定基礎。

有益效果：本發明方法與現有技術相比，具有如下優勢：

(1)預處理方法簡便：血漿樣品酸化後，有機溶劑沉澱蛋白，適用 於常規測定。

(2)專屬性強：採用Agilent ZORBAX Eclipse C18(4.6×100mm，3.5μm)色譜柱作為固定相；甲醇和水相(6mmoL·L-1醋酸銨水溶液，含0.02％氨水(％))作為流動相，梯度洗脫：0-8.5min，水相∶甲醇(75∶25)；8.6-9.6min，水相∶甲醇(5∶95)；9.7-13.0min，水相∶甲醇(75∶25)；MY-1250保留時間為7.9min左右；內標左乙拉西坦保留時間為3.05min左右，13分鐘完成測定，內源性物質不幹擾二者的測定。

(3)靈敏度高：血漿最低定量限為2ng·mL-1。

(4)本發明方法快速、準確、靈敏度高、操作簡便，為MY-1250的臨床血藥物濃度測定提供依據，服務於新藥研究開發及臨床應用。本方法的血漿標準曲線線性範圍為2～1500ng·mL-1，批內和批間精密度RSD均小於10％。

附圖說明

圖1為質譜圖。

其中，A為人空白血漿的質譜圖，B為人空白血漿加入標準品後的質譜圖，C為人空腹口服瑞吡司特片150mg後2h血漿樣品的質譜圖。

註：圖中MY-1250[M+H]+，m/z 286.1/198.2，保留時間為7.9min左右；內標I.S.[M+H]+，m/z 171.3/126.2，保留時間為3.05min左右。

具體實施方式

下面結合附圖對本發明的較佳實施例進行詳細闡述，以使本發明的優點和特徵能更易於被本領域技術人員理解，從而對本發明的保護範圍做出更為清楚明確的界定。

實施例1：人血漿中MY-1250濃度的測定。

一、實驗材料與儀器

MY-1250對照品：由河南輔仁堂製藥有限公司提供，批號： 20140501D；左乙拉西坦對照品：由浙江華海藥業股份有限公司提供，批號：201308-2；試驗用水：超純水；甲醇：色譜純(Merck Company)；氨水、醋酸銨：分析純(國藥集團化學試劑有限公司)；鹽酸：分析純(上海凌峰化學試劑有限公司)。

API 4000 LC/MS/MS聯用儀(美國應用生物系統公司)，色譜工作站：Analyst 1.6；梅特勒XS 105DU電子天平(瑞士梅特勒公司)；Eppendorf Centrifuge 5424R高速低溫離心機(德國Eppendorf公司)；KDC-2042型低速冷凍離心機(安徽中科中佳科學儀器有限公司)；Millipore Drict-Q5超純水機(法國Millipore公司)。

二、液質條件

1.液相色譜條件

色譜柱為Agilent ZORBAX Eclipse C18，4.6×100mm，3.5μm；流動相：甲醇和水相，水相為6mmoL·L-1醋酸銨水溶液，水相中按照體積比含有0.02％氨水；

梯度洗脫：0-8.5min，水相與甲醇的體積比為75∶25；8.6-9.6min，水相與甲醇的體積比為5∶95；9.7-13.0min，水相與甲醇的體積比為75∶25；柱溫為35℃；流速為800μL·min-1；進樣量：50μL；

2.質譜條件

離子源：電噴霧離子化電離源ESI；離子檢測方式：多反應監測(MRM)；離子極性：正離子；離子源電壓IS：4500V；離子源溫度TEM：750℃；碰撞氣CAD：8L·min-1；氣簾氣CUR：35L·min-1；離子源Gas1：65L·min-1；離子源Gas2：70L·min-1；檢測對象的離子選擇通道：MY-1250，[M+H]+，m/z 286.1/198.2，DP106，EP10，CE47，CXP15；內標左乙拉西坦，[M+H]+，m/z 171.3/126.2，DP27，EP6，CE40，CXP1o。

三、實驗過程：

1.MY-1250標準溶液的配製：

稱取適量MY-1250對照品(相當於含10mg MY-1250)，置於100 mL容量瓶中，先加入少量甲醇溶解，再加入1moL·L-1NH4AC溶液4mL，混勻溶解後，用甲醇定容至刻度，混勻得到含0.1mg·mL-1MY-1250標準曲線儲備液，再以甲醇依次稀釋，配成濃度分別為0.04、0.1、0.2、0.6、2、6、20、30μg·mL-1的MY-1250標準工作液。

2.人血漿樣品的處理：

5名健康男性受試者空腹服用瑞吡司特片150mg，用250mL溫開水送服；於給藥後2h採集外周靜脈血3ml，注入肝素管內，離心(4000r·min-1，5min)，吸取受試者血漿樣本600μL，加入12μL鹽酸溶液(5mol·L-1)，渦旋混勻後，吸取預處理後的受試者血漿樣本204μL，並加入50μL內標工作液，渦旋混勻後加入600μL甲醇沉澱蛋白，渦旋1min，於15000rpm、4℃離心5min。吸取400μL上清液至進樣瓶中，加入800μL水，渦旋混勻，吸取混勻液50μL進樣(見圖1-C)，計算MY-1250和內標峰面積的比值f1，代入標準曲線計算濃度。

3.專屬性：

取沒有給予過瑞吡司特片的人空白血漿200μL於1.5mL塑料離心管中，加入50μL甲醇和4μL鹽酸溶液(5mol·L-1)，渦旋混勻後加入610μL甲醇沉澱蛋白，渦旋1min，於15000rpm、4℃離心5min。吸取400μL上清液至進樣瓶中，加入800μL水，渦旋混勻，吸取混勻液50μL進樣(見圖1-A)。

取1.5mL塑料離心管精密加入MY-1250標準溶液(1.6μg·mL-1)10μL，加入空白血漿200μL，渦旋混勻，加入4μL鹽酸溶液(5mol·L-1)和50μL 0.4μg·mL-1內標工作液，渦旋混勻後加入600μL甲醇沉澱蛋白，渦旋1min，於15000rpm、4℃離心5min。吸取400μL上清液至進樣瓶中，加入800μL水，渦旋混勻(見圖1-B)。

結果顯示，在本實驗所採用的LC-MS-MS條件下，血漿樣品無雜峰對檢測組分造成幹擾，MY-1250保留時間在7.9min左右，內標左乙拉西坦保留時間在3.05min左右。MY-1250和內標互不幹擾，峰形良好，基線平穩。

4.線性試驗

人血漿標準曲線：分別吸取10μL MY-1250的標準曲線工作液至1.5mL塑料離心管中，並加入空白血漿200μL，渦旋混勻，製備成相當於含MY-1250濃度為2、5、10、30、100、300、1000、1500ng·mL-1的標準曲線血漿樣本。按「血漿樣品預處理」項下操作。計算MY-1250峰面積As和內標峰面積Ai的比值f(f＝As/Ai)，以峰面積比值f對血藥濃度C作回歸計算。以平均比值f對血藥濃度C作回歸計算，得回歸方程：f＝0.00824×C+0.000784(r＝0.9987，權重係數w＝1/C＊C)，MY-1250血漿濃度在2～1500ng·mL-1範圍內線性關係良好。最低定量限為2ng·mL-1。

5.準確度和精密度

按照人血漿標準曲線方法配製含MY-1250濃度為4、80、1200ng·mL-1的低、中、高的血漿樣品，按「血漿樣品預處理」處理方法分別處理。連續做3批，每批每個濃度各做6份樣品，計算MY-1250峰面積As和內標峰面積Ai的比值f，代入每批的血漿標準曲線中求得MY-1250實測濃度，由實測濃度計算批內、批間精密度和相對標準偏差(RSD)，實測濃度與加入濃度的比值即為準確度。結果顯示，批內和批間精密度RSD均小於10％，準確度符合要求。

6.測定結果

上述給予過瑞吡司特片150mg後2h的5名健康男性受試者血漿中MY-1250含量分別為154.3、84.24、123.9、257.5、30.67ng·mL-1。

實施例2：人血漿中MY-1250濃度的測定

參照實施例1，5名健康女性受試者空腹服用瑞吡司特片150mg，用250mL溫開水送服；於給藥後4h採集外周靜脈血3mL，注入肝素管內，離心(4000r·min-1，5min)，吸取受試者血漿樣本600μL，加入12μL鹽酸溶液(5mol·L-1)，渦旋混勻後，製備血漿。含藥血漿樣品處理及測定條件相同，結果空腹口服瑞吡司特片150mg後4h的5名健康女性受試者血漿中MY-1250含量分別為50.24、52.71、41.2、 26.12、43.45ng·mL-1。

實施例3：人血漿中MY-1250濃度的測定

參照實施例1，5名健康男性受試者空腹服用瑞吡司特顆粒50mg/袋×3袋，用250mL溫開水衝服；於給藥後2h採集外周靜脈血3mL，注入肝素管內，離心(4000r·min-1，5min)，吸取受試者血漿樣本600μL，加入12μL鹽酸溶液(5mol·L-1)，渦旋混勻後，製備血漿。含藥血漿樣品處理及測定條件相同，結果空腹口服瑞吡司特顆粒150mg後2h的5名健康男性受試者血漿中MY-1250含量分別為49.26、107.6、56.76、100.7、124.5ng·mL-1。

對這些實施例的多種修改對本領域的專業技術人員來說將是顯而易見的，本文中所定義的一般原理可以在不脫離本發明的精神或範圍的情況下，在其它實施例中實現。