用於製備能夠同時利用葡萄糖和木糖的突變大腸桿菌的方法

2023-12-02 10:45:16 2

用於製備能夠同時利用葡萄糖和木糖的突變大腸桿菌的方法
【專利摘要】本發明涉及通過基因工程和進化適應製備能夠同時利用葡萄糖和木糖的突變E.coli菌株的方法；使用該方法製備的突變E.coli；以及使用該突變E.coli生產生物燃料、生物活性成分、藥用材料或化用基本化學物質的方法。與野生型E.coli相比，能夠同時利用葡萄糖和木糖的突變E.coli能夠更有效地應用於由生物質生產生物燃料的酶促糖化過程。
【專利說明】用於製備能夠同時利用葡萄糖和木糖的突變大腸桿菌的方 法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及用於製備能夠同時利用葡萄糖和木糖的突變E. coli的方法。更具體 而言，本發明涉及通過基因工程和進化適應製備能夠同時利用葡萄糖和木糖的突變E. coli 菌株的方法；使用該方法製備的突變E. coli ;以及使用該突變E. coli生產生物燃料、生物 活性成分、藥用材料或化工用化學物質的方法。
[0002] 發明背景
[0003] 隨著石化燃料的消耗，引起了對全球對可替代能源的密切關注。作為可替代能源 之一的燃料乙醇可以由纖維素類生物質轉化獲得。每年，由於通過光合作用固定（fixed)纖 維素而生產大量的纖維素。另外，纖維素是可再生的。當考慮到其可再生性和生產率，纖維 素在功能上和經濟上是非常有利的。目前，在纖維素類生物質以外，主要是利用木質纖維素 類生物質，並且大量研究已聚焦於有效降解木質纖維素類生物質的成分，包括纖維素、半纖 維素和木質素；另外對產生纖維素類生物質的新菌株的尋找以及糖化作用和發酵過程也正 處於研究中。
[0004] 纖維素燃料的生產可大致分為i)使用至少三種酶（內切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶 和β-葡聚糖酶）的生物質酶促糖化過程，和ii)由此得到的糖的微生物發酵過程。近期， 已經有關於同步糖化發酵（SSF)的大量研究，同步糖化發酵目的是在一個反應器中同時進 行酶促糖化過程和發酵過程，通過同步糖化發酵使設備成本和酶抑制活性顯著降低，導致 乙醇的生產效率得到提高。在這些過程中，酶促糖化過程是最昂貴的。因此，研究方向針對 通過研發產生相關酶的細菌發酵菌株使得用於糖化作用的酶功能強化或者用量減少。特 別是，近期在生物工程技術已允許將糖化作用相關酶的基因導入細菌發酵菌株並在其中表 達，從而開發出能夠同時進行糖化作用和發酵作用的細菌菌株。然而，這種策略有外源基因 如糖化作用相關基因表達效率非常低以及對過表達後的細胞生長和代謝有負面影響的缺 點。因此，所關注的焦點從引入外源基因轉向改變發酵菌株內源途徑的調節。
[0005] 大腸桿菌被視為生產木質纖維素類燃料的有效工具，因為其可以利用存在於生物 質水解產物中的所有糖類。然而，如果優選的糖（例如葡萄糖）存在於水解產物中，則會發 生導致抑制參與除靶標外的碳源分解代謝的酶合成的碳源代謝物抑制（CCR)，並伴隨著限 制微生物潛能的結果。儘管糖類如木糖和阿拉伯糖存在於水解產物中，但直到葡萄糖完全 消耗後木糖才可以代謝。葡萄糖的這種優先性擾亂了發酵過程，由此降低該過程的效率，並 且由於未利用的碳源的累積，對下遊過程具有負面影響。從木質纖維素水解產物獲得的糖 混合物在組成上有很大變化，但相對其他糖，葡萄糖和木糖佔主要部分。為了在成本、效率 和簡易度上改善纖維素燃料的生產，有需要研發可以同時利用這兩種糖的突變E. coli。
[0006] 通過一些分解代謝物脫阻抑的E. coli菌株已證明葡萄糖和木糖的同時利 用。許多研究已聚焦於cAMP受體蛋白（cAMP receptor protein, CRP)，稱為CCR的整 體（global)轉錄調節因子。一些具有CRP突變（CRP*)的E. coli菌株被認為部分脫 離 CCR 的控制（Karimova，G.，et al·，Research in Microbiology, 2004, 155(2) :76-79; Nair, N. U. , et al. ,Metabolic Engineering, 2010, 12(5) :462-468 ；Kimata, K. , et al. , Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America, 1997, 94 (24) : I 29 14-129 19 ； Inada,T. ,et al.,Genes Cells, 1996, 1(3) :293-301)。另外，缺少E. coli的葡萄糖磷酸轉移酶系統（PTS)部分地除 去（deprivecOCCR，並且甲基乙二醛合酶基因的刪除有利於調節葡萄糖的利用模式。然而， 這些方法無法以足夠程度消除CCR，以生產纖維素生物燃料，因此，仍然需要新的方法。
[0007] 同時，L-阿拉伯糖代謝相關的操縱子和基因通常被稱為ara操縱子，其是編碼 將阿拉伯糖分解代謝為木酮糖5-磷酸鹽（磷酸戊糖途徑的中間產物）所需的酶的基因 序列。在ara操縱子中，是araBAD操縱子和araFGH操縱子，以及作為個體基因的araE。 它們之中，araB編碼L-核酮糖激酶，araA編碼L-阿拉伯糖異構酶，araD編碼L-核酮 糖-5-憐酸酶 4_ 差向異構酶（L-ribulose-5-phosphatase 4-epimerase) ;araF、araG 和 araH編碼各自的阿拉伯糖ABC轉運體亞基；以及araE編碼阿拉伯糖/氫離子同向轉運 體(symporter)(Mayer, C. and ff. Boos, Chapter 3. 4. I, Hexose/Pentose and Hexitol/ Pentitol Metabolism(己糖/戊糖和己糖醇/戊糖醇的代謝）。在A. B6ck，R. Curtiss III, J. B. Kaper, P. D. Karp, F. C. Neidhardt, T. Nystrom, J. M. Slauch, C. L. Squires, and D. Ussery (ed. ), EcoSal-Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology(大腸桿菌和沙門氏菌：細胞與分子生物學）中。http://www.ecosal.org.ASM Press, Washington, DC.) 〇
[0008] 同樣，D-木糖代謝相關的操縱子和基因通常被稱為xyl操縱子，其是編碼將木 糖分解代謝為木酮糖5-磷酸鹽（磷酸戊糖途徑的中間產物）所需的酶的基因序列。xyl 操縱子含有xylAB操縱子和xylGHl操縱子，其中sylA編碼D-木糖異構酶，xylB編碼木 酮糖激酶，以及xylF、xyIG和xyIH編碼各自的D-木糖ABC轉移酶亞基（Mayer，C. and W. Boos, Chapter3. 4.1，Hexose/Pentose and Hexitol/Pentitol Metabolism.在A. B0ck, R. Curtiss III, J. B. Kaper, P. D. Karp, F. C. Neidhardt, T. Nystrom, J. M. Slauch, C. L. Squires, and D. Ussery (ed. ), EcoSal-Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology(大腸桿菌和沙門氏菌：細胞與分子生物學）中。http://www. ecosal. org. ASM Press, Washington, DC.) 〇
[0009] 關於本發明，對由生物質有效生產生物燃料、生物活性成分和藥用材料的廣泛而 深入的研究帶來如下結果：當野生型E. coli中的araBAD操縱子、araFGH操縱子、araE基 因、xylAB操縱子和xylGHl操縱子的誘導型啟動子被改變成組成型啟動子時，所獲得的在 木糖基本培養基或阿拉伯糖與木糖的基本培養基中生長的突變E. coli可以同時利用葡萄 糖和木糖。


【發明內容】

[0010] 因此，本發明的目的在於提供用於製備能夠同時利用葡萄糖和木糖的突變大腸杆 菌的方法。
[0011] 本發明的另一個目的在於提供使用該方法製備的能夠同時利用葡萄糖和木糖的 突變 E. coli。
[0012] 本發明的又一目的在於提供從生物質生產生物燃料、生物活性成分、藥用材料或 化工用化學物質的方法。
[0013] 根據其中一方面，本發明提供用於從野生型E. COli製備能夠同時利用葡萄糖和 木糖的突變E. coli的方法，包括：（1)將野生型E. coli中araBAD操縱子、araFGH操縱子、 araE基因、xylAB操縱子和xylFGH操縱子的誘導型啟動子替換成各自的組成型啟動子；以 及（2)將替換啟動子後的E. coli在木糖基本培養基或阿拉伯糖與木糖的基本培養基中生 長10天或以上。
[0014] 根據其中另一方面，本發明提供了能夠同時利用葡萄糖和木糖的突變E. coli菌 株，其是通過將野生型E. coli中的araBAD操縱子、araFGH操縱子、araE基因、xylAB操 縱子和xylFGH操縱子的誘導型啟動子替換成各自的組成型啟動子，並將替換啟動子後的 E. coli在木糖基本培養基或阿拉伯糖與木糖的基本培養基中生長10天或以上而製備的。
[0015] 根據其中又一方面，本發明提供了通過使用能夠同時利用葡萄糖和木糖的突變 E. coli從生物質生產生物燃料、生物活性成分、藥用材料或化工用化學物質的方法，所述突 變E. coli是通過以下方法製備：將野生型E. coli中的araBAD操縱子、araFGH操縱子、araE 基因、xylAB操縱子和xylFGH操縱子的誘導型啟動子替換成各自的組成型啟動子，並將替 換啟動子後的E. coli在木糖基本培養基或阿拉伯糖與木糖的基本培養基中生長10天或以 上。
[0016] 與野生型E. coli相反，本發明的突變E. coli具有同時利用葡萄糖和木糖的能力， 其可以減少用於從生物質生產生物燃料、生物活性成分、藥用材料或化工用化學物質的生 化工程所需的時間，由此可以提高生產效率。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0017] 根據本發明的以下說明並結合附圖，本發明的以上和其他目的和特徵將是顯而易 見的，附圖分別示出了：
[0018] 圖1是通過使用λ -紅重組系統將E. coli的染色體上的誘導型啟動子（內源性 啟動子）替換成組成型啟動子CP的過程的示意圖；
[0019] 圖2示出了將araBAD操縱子的誘導型啟動子替換成組成型啟動子的過程；
[0020] 圖3示出了將araFGH操縱子的誘導型啟動子替換成組成型啟動子的過程；
[0021] 圖4示出了將araE基因的誘導型啟動子替換成組成型啟動子的過程；
[0022] 圖5示出了將xylAB操縱子和xylFGH操縱子的誘導型啟動子替換成組成型啟動 子的過程；
[0023] 圖6描述了在葡萄糖基本培養基⑷和木糖基本培養基⑶中的生長率，其中菱 形（?)代表野生型E. coli (WT);矩形（)代表菌株（AXcp)，其具有替換了 araBAD操縱 子、araFGH操縱子和araE的誘導型啟動子以及xylAB操縱子和xylFGH操縱子的誘導型啟 動子的組成型啟動子，但沒有進行進化適應；X代表實施例1的菌株（AXcpX50)，其具有替換 了 araBAD操縱子、araFGH操縱子和araE的誘導型啟動子以及xylAB操縱子和xylFGH操 縱子的誘導型啟動子的組成型啟動子，然後在木糖基本培養基中進行進化適應；以及三角 形（Λ )代表實施例2的菌株（AXcpAX50)，其具有替換了 araBAD操縱子、araFGH操縱子和 araE的誘導型啟動子以及xylAB操縱子和xylFGH操縱子的誘導型啟動子的組成型啟動子， 然後在阿拉伯糖與木糖的基本培養基中進行進化適應；
[0024] 圖7描述了野生型E. coli (WT) (A)、具有替換了 araBAD操縱子、araFGH操縱子和 araE的誘導型啟動子以及xylAB操縱子和xylFGH操縱子的誘導型啟動子的組成型啟動子 但沒有進行進化適應的菌株（AXcp) (B)、實施例1的具有替換了 araBAD操縱子、araFGH操 縱子和araE的誘導型啟動子以及xylAB操縱子和xylFGH操縱子的誘導型啟動子的組成型 啟動子然後在木糖基本培養基中進行進化適應的菌株（AXcpX50) (C)、實施例2的具有替換 了 araBAD操縱子、araFGH操縱子和araE的誘導型啟動子以及xylAB操縱子和xylFGH操 縱子的誘導型啟動子的組成型啟動子然後在阿拉伯糖與木糖的基本培養基中進行進化適 應的菌株（AXcpAX50) (D)，在含有葡萄糖（2g/L)和木糖（2g/L)的培養基中培養的期間，葡 萄糖（?)和木糖（)的殘餘濃度以及生長率。
[0025] 圖8描述了當包括野生型E. coli MG1655(WT) (A)、實施例〈3-1>的敲除ptsG的 野生型菌株（WTAptsG) (B)、實施例2的突變菌株（AXcpAX50) (C)和實施例〈3-2>的敲除 PtsG的AXcpAX50菌株（AXAptsG) (D)的各菌株在含有葡萄糖（2. 5g/L)和木糖（2. 5g/L) 的M9基本培養基中培養時，葡萄糖（·）和木糖(▼)的殘餘濃度，以及細胞生長率（□);
[0026] 圖9描述了當包括野生型E. coli MG1655(WT) (A)、實施例〈3-1>的敲除ptsG的野 生型菌株（WT Λ ptsG) (B)、實施例2的突變菌株（AXcpAX50) (C)和實施例〈3-2>的敲除PtsG 的AXcpAX50菌株（AXAptsG) (D)的各菌株在含有葡萄糖（5.0g/L)和木糖（5.0g/L)的M9 基本培養基中培養時，葡萄糖（·）和木糖（V)的殘餘濃度，以及細胞生長率（□);
[0027] 圖10比較了各菌株MG1655、AXcp、AXcpX50和AXcpAX50的修飾的DNA區域中的核 苷酸序列比對；
[0028] 圖11示出了各菌株的突變基因的肽序列比對；
[0029] 圖12是實施例4中根據在木糖基本培養基中培養16小時後木糖的利用而篩選的 各突變菌株的生長率的圖表。
[0030] 圖13描述了實施例2的突變菌株（AXcpAX50)在含有以1:1、2:1、3:1或4:1比例 的葡萄糖和木糖（總共5g/L ;A-D)的M9基本培養基中培養時，葡萄糖（·）和木糖（▼)的 殘餘濃度，以及突變菌株的生長率；以及
[0031] 圖14描述了實施例5中獲得的WT-pXR菌株（A)和AX-pXR菌株⑶在含有5. 8g/ L葡萄糖和4. 2g/L木糖的M9基本培養基中培養時，木糖醇的生成（)和菌株的生長率 (#)。
[0032] 發明詳述
[0033] 隨後，定義本文所使用的術語。
[0034] 如本文所用，術語"操縱子"是指在單個調節信號或啟動子的控制下含有基因簇的 基因組DNA的功能單元。本發明所使用的'araBAD操縱子'、'araFGH操縱子'、'xylAB操縱 子'和'xylFGH操縱子'的結構和功能是本領域已知的。
[0035] 如本文所用，術語"啟動子"是指DNA的幫助特定基因轉錄的區域。如本文所用，術 語"誘導型啟動子"是指一種啟動子，其活性是通過特定因子的存在或缺失而誘導的。術語 "組成型啟動子"指的是未經調節的啟動子，其允許相關基因的持續表達。araBAD操縱子、 araFGH操縱子、araE基因、xylAB操縱子以及xylFGH操縱子的誘導型啟動子是本領域已知 的。
[0036] 本發明提供了用於從野生型製備能夠同時利用葡萄糖和木糖的突變E. coli的方 法，包括：（1)將野生型E. coli中araBAD操縱子、araFGH操縱子、araE基因、xylAB操縱子 和xylFGH操縱子的誘導型啟動子替換成相應組成型啟動子；以及（2)將替換啟動子後的 E. coli在木糖基本培養基或阿拉伯糖與木糖的基本培養基中生長10天或以上。
[0037] 在工業上難以使用野生型E. coli從生物質製備各種化學品，例如胺基酸、生物燃 料、生物聚合物和生物醇等，因為野生型E. coli由於碳源代謝物抑制而不能同時利用葡萄 糖和木糖。相反，本發明的突變E. coli明顯減少用於生產化學品的生化過程所需的時間， 隨之而來,提高了發酵效率、產率和生產效率,並降低了工藝操作成本。
[0038] 這些特性可以通過下述基因工程方法實現：將E. coli的染色體上的araBAD操縱 子、araFGH操縱子、araE基因、xylAB操縱子和xylFGH操縱子的誘導型啟動子替換成各自 的組成型啟動子；並結合使菌株在木糖基本培養基或阿拉伯糖與木糖的基本培養基中生長 的進化適應。
[0039] 在本發明中，步驟1提出將野生型E. coli的araBAD操縱子、araFGH操縱子、araE 基因、xylAB操縱子和xylFGH操縱子的誘導型啟動子取代為各自的組成型啟動子。
[0040] araBAD操縱子中，araB編碼L-核酮糖激酶，araA編碼L-阿拉伯糖異構酶，且araD 編碼L-核酮糖-5-磷酸酶4-差向異構酶。阿拉伯糖ABC轉運體亞基分別由araF、araG和 araH編碼，araE負責編碼阿拉伯糖/氫離子同向轉運體。araBAD操縱子的誘導型轉運子 具有SEQ ID NO: 1的核苷酸序列。araFGH操縱子和araE的誘導型啟動子分別具有SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的核苷酸序列。
[0041] 在該步驟中，可以通過拼接重疊延伸（splice overlap extension, S0E)PCR使用 如圖1-4的λ -紅重組系統來進行將araBAD操縱子、araFGH操縱子和araE基因的誘導型 啟動子替換為熟知的相應組成型啟動子的過程，但也可以採用本領域已知的替代方法。只 要允許特定基因的組成型轉錄是已知的，則任何組成型啟動子均可用於本發明。優選具有 核苷酸序列SEQ ID NO:6的CP25啟動子，或者具有核苷酸序列SEQ ID NO:7的CP6啟動 子。根據[Jensen, P. R. and K. Hammer (1998). ^The sequence of spacers between the consensus sequences modulates the strength of prokaryotic promoters. ^Applied and Environmental Microbiology 64(1):82-87]的報導，已知 CP25 啟動子是固有活性 (constitutive activity)最強的，而CP6啟動子排第二。在本發明的一個實施方案中， araBAD操縱子和araE基因的誘導型啟動子被CP25啟動子替代，而araFGH操縱子的誘導型 啟動子被CP6啟動子替代。
[0042] 同樣，在該步驟中，可以通過拼接重疊延伸（SOE) PCR使用如圖5所示的λ-紅重 組系統來進行將xylAB操縱子和xylFGH操縱子的誘導型啟動子替換為熟知的相應組成型 啟動子的過程，但也可以通過本領域已知的替代方法進行。
[0043] xylAB操縱子中，xylA編碼D-木糖異構酶，而xylB編碼木酮糖激酶。D-木糖ABC 轉運體亞基分別由xylFGH操縱子中的xylF、xyIG和xyIH編碼。xylAB操縱子和xylFGH操 縱子的誘導型啟動子分別具有SEQ ID N0:4和SEQ ID N0:5的核苷酸序列。
[0044] 可以組成型轉錄特定基因的任何已知的啟動子均可以用於本發明。優選具有核苷 酸序列SEQ ID NO:6的CP25啟動子，或者具有核苷酸序列SEQ ID NO:7的CP6啟動子。在 本發明的一個實施方案中，xyIAB操縱子的誘導型啟動子被CP25啟動子替代，而xyIFGH操 縱子的誘導型啟動子被CP6啟動子替代。
[0045] 通過突變過程獲得的E. coli菌株獲得了同時利用葡萄糖和木糖的表型，因為在 替代了誘導型啟動子的組成型啟動子的控制下，激活了 araBAD操縱子、araFGH操縱子、 araE基因、xylAB操縱子和xylFGH操縱子。
[0046] 在本發明中，步驟2提出通過將E. coli在木糖基本培養基或阿拉伯糖與木糖的基 本培養基中生長10天或以上，對在步驟1突變的E. COli進行進化適應。本文中，術語'木糖 基本培養基'是指含有作為單獨碳源的木糖的培養基。木糖基本培養基的實例包括但不限 於，含有木糖4g/L、磷酸氫二鈉6. 78g/L、磷酸二氫鉀3. Og/L、氯化鈉0. 5g/L、氯化銨I. Og/ L、硫酸鎂2mM和氯化鈣0. ImM的M9基本培養基。術語'阿拉伯糖與木糖的基本培養基'是 指不含除阿拉伯糖和木糖以外碳源的培養基。該培養基的實例包括含有阿拉伯糖2g/L、木 糖2g/L、磷酸氫二鈉6. 78g/L、磷酸二氫鉀3. Og/L、氯化鈉0. 5g/L、氯化銨I. Og/L、硫酸鎂 2mM和氯化鈣0. ImM的M9基本培養基，但並不限於此。此外，生長期是可以影響葡萄糖和木 糖的利用的最短持續時間，菌株可以生長或適應10天或以上、20天或以上、30天或以上、40 天或以上，或50天或以上。
[0047] 本發明還提供了能夠同時利葡萄糖和木糖的突變E. coli菌株，其是通過以下方 法製備：將野生型E. coli中的araBAD操縱子、araFGH操縱子、araE基因、xylAB操縱子和 xylFGH操縱子的誘導型啟動子替換成各自的組成型啟動子，並將替換啟動子後的E. coli 在木糖基本培養基或阿拉伯糖與木糖的基本培養基中生長10天或以上。
[0048] 本發明的用於製備E. coli菌株的E. coli和組成型啟動子如製備方法中所述。
[0049] 此外，本發明提供了通過使用本發明的突變E. coli從生物質生產生物燃料、生物 活性成分、藥用材料或化工用化學物質的方法。所述生物質優選是纖維素類生物質，且更優 選木質纖維素類生物質。用於從生物質生產生物燃料的方法是本領域廣泛已知的。本發明 以在酶促糖化過程和發酵過程中使用本發明的突變E. coli菌株為特徵。在本發明的一個 實施方案中，可以用本發明的突變E. coli菌株代替所有或一些酶來進行糖化過程。在本發 明的另一實施方案中，可以用本發明的突變E. coli菌株進行發酵過程。此外，本發明的突 變E. coli菌株可以用於同步糖化發酵（SSF)，其目的在於在一個反應器中同時進行酶促糖 化過程和發酵過程。
[0050] 另外，本發明的突變E. coli菌株可以應用於從生物質生產化學品，例如胺基酸、 生物燃料、生物聚合物、生物醇、重組蛋白等。
[0051] 通過以下用於說明目的的實施例可以獲得對本發明更好的理解，但不應被視為限 制本發明。
[0052] 實施例1 :通過啟動子替換和進化適應製備突變E. coli
[0053] 通過下述方式將野生型E. coli的araBAD操縱子、araFGH操縱子、araE基因、 xylAB操縱子和xylFGH操縱子的誘導型啟動子替換為各自的組成型啟動子來製備突變 E. coli〇
[0054] 〈1-1>將araBAD橾縱子、araFGH橾縱子和araE某因的誘導型啟動子替換為各自 的組成型啟動子
[0055] 使用 Datta et al. (Datta，S.，N. Costantino, et al. (2006) · "A set of recombineering plasmids for gram-negative bacteria. ^Gene 379 (0) : 109-115)所述的 λ -紅重組系統，將E. coli MG1655的染色體上的araBAD的誘導型啟動子（SEQ ID NO: I) 替換為組成型CP25啟動子（SEQ ID N0:6)(參見圖1)。
[0056] 簡言之，如文獻[Datta, S.，N. Costantino, et al. (2006) · "A set of recombineering plasmids for gram-negative bacteria.^Gene 379(0):109-115 ； Datsenko KA et al. , Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，97(12)，6640-6645,2000;和 Cherepanov，PP.，W Wackernagel. (1995). Gene disruption in Escherichia coli:TcR and KmR cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant. Gene 158(1):9-14.]中所述，通過拼接重疊延伸（SOE)PCR擴增用於啟動子替換的兩個重疊片 段，以使CP25啟動子與卡那黴素盒（cassette)連接。片段1具有組成型啟動子CP25,其 攜帶與araB啟動子的下遊區域同源的引物序列，由此配置成使用表1列舉的三個拼接重疊 延伸化（SOEing)的引物將組成型啟動子CP25與araB啟動子的下遊區域連接。片段2含 有來自PKD13的卡那黴素盒，其從與araB啟動子的上遊區域同源的突出部分開始，並終止 於允許與片段1連接的同源序列。在98°C下開始3分鐘後，使用95°C下30秒、50?60°C 下30秒和72°C下2分鐘的30個熱循環來進行SOE PCR。該過程示意性地描述於圖2中， 並且在該過程中所用的引物和質粒在表1中給出。
[0057] 〈表 1>
[0058]

【權利要求】
1. 由野生型E. coli (大腸桿菌）製備能夠同時利用葡萄糖和木糖的突變E. coli的方 法，包括： (1) 將野生型E. coli的araBAD操縱子、araFGH操縱子、araE基因、xylAB操縱子和 xylFGH操縱子的誘導型啟動子替換為其各自的組成型啟動子；以及 (2) 將啟動子替換後的E. coli在木糖基本培養基或阿拉伯糖和木糖基本培養基中培 養10天或更長。
2. 如權利要求1所述的方法，其中araBAD操縱子、araFGH操縱子、araE基因、xylAB操 縱子和xylFGH操縱子的誘導型啟動子分別具有SEQ ID NO: 1-5的核苷酸序列。
3. 如權利要求1所述的方法，其中所述組成型啟動子具有SEQ ID N0:6或7的核苷酸 序列。
4. 如權利要求1所述的方法，其中所述木糖基本培養基是含有4g/L木糖、6. 78g/L磷 酸氫二鈉、3. Og/L磷酸二氫鉀、0. 5g/L氯化鈉、1. Og/L氯化銨、2mM硫酸鎂和0. ImM氯化鈣 的M9-基本培養基。
5. 如權利要求1所述的方法，其中所述阿拉伯糖和木糖培養基是含有2g/L阿拉伯糖、 2g/L木糖、6. 78g/L磷酸氫二鈉、3. Og/L磷酸二氫鉀、0. 5g/L氯化鈉、1. Og/L氯化銨、2mM硫 酸鎂和0. ImM氯化鈣的M9-基本培養基。
6. 通過以下方法製備的能夠同時利用葡萄糖和木糖的突變E. coli (大腸桿菌），所 述方法包括將野生型E. coli的araBAD操縱子、araFGH操縱子、araE基因、xylAB操縱子 和xylFGH操縱子的誘導型啟動子替換為其各自的組成型啟動子；以及將啟動子替換後的 E. coli在木糖基本培養基或阿拉伯糖和木糖基本培養基中培養10天或更長。
7. 如權利要求6所述的突變E. coli，其中araBAD操縱子、araFGH操縱子、araE基因、 xylAB操縱子和xylFGH操縱子的誘導型啟動子分別具有SEQ ID NO: 1-5的核苷酸序列。
8. 如權利要求6所述的突變E. coli，其中所述組成型啟動子具有SEQ ID N0:6或7的 核苷酸序列。
9. 如權利要求6所述的突變E. coli，其包括由SEQ ID N0:55、56、58和60的核苷酸序 列表示的突變。
10. 如權利要求6所述的突變E. coli，其包括由SEQ ID NO:51和53的胺基酸序列表 示的突變。
11. 如權利要求6所述的突變E. coli，其包括由SEQ ID N0:50、52、54和55的核苷酸 序列表示的突變。
12. 如權利要求6所述的突變E. coli，其包括由SEQ ID NO:57和59的胺基酸序列表 示的突變。
13. 通過使用能夠同時利用葡萄糖和木糖的突變E. coli由生物質生產生物燃料、生物 活性成分、藥用材料或用於化學工業的化學物質的方法，所述突變E. coli通過以下方式制 備：將野生型E. coli的araBAD操縱子、araFGH操縱子、araE基因、xylAB操縱子和xylFGH 操縱子的誘導型啟動子替換為其各自的組成型啟動子；以及將啟動子替換後的E. coli在 木糖基本培養基或阿拉伯糖和木糖基本培養基中培養10天或更長。
【文檔編號】C12N15/70GK104371963SQ201410389340
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2014年8月8日 優先權日:2013年8月14日
【發明者】李成國, 金久熙, 丁聖勳, 金奭玟, 崔倍榮 申請人:國立大學法人蔚山科學技術大學校產學協力團