用於治療無症狀性腦缺血和其它器官的缺血的fxii抑制劑的製作方法

2023-12-02 17:10:21 2

用於治療無症狀性腦缺血和其它器官的缺血的fxii抑制劑的製作方法
【專利摘要】無症狀性腦缺血(SBI)或其它器官的缺血可以由在醫療操作中被引入動脈系統的栓塞造成。本申請提供了在接受醫療操作的患者中施用FXII抑制劑的方法，和可用於研究缺血包括SBI和其它器官的缺血以及用於評價候選治療劑的動物模型。
【專利說明】用於治療無症狀性腦缺血和其它器官的缺血的FXI I抑制
劑
[0001]領域
[0002]本申請涉及無症狀性腦缺血和其它器官的缺血，在接受醫療操作的患者中施用因子XII抑制劑的方法，和可用於研究無症狀性腦缺血和其它器官中的缺血以及用於評估潛在療法的動物模型。
[0003]背景
[0004]無症狀性腦缺血(SBI)是腦力小的缺血性損傷的病況，其為醫療操作、特別地血管操作和外科手術的副作用。缺血還可在其它器官中發生。在醫療操作期間偶然地釋放入動脈循環的任何外來或內源性材料均可導致SBI或其它器官的缺血，例如彌散性栓塞性缺血。SBI是一種異質性症候群，其中栓塞物的確切來源可能變化。例如，引起SBI或其它器官的缺血的栓塞物或微栓塞物可由不同的物質(包括氣泡、油、脂肪、膽固醇、凝固的血液和/或碎片)組成。通常地，缺血性損傷是彌散性的。在SBI中，腦的區域散布微栓塞物，單個病灶難以利用常規磁共振成像(MRI)來檢測。例如，在造影劑注射過程中和血管探測過程中發現有微栓塞物信號(Bendszus M和 Stoll G, 5Lancet Neurol.364-372，2006)。SBI 內組織損傷的確切機制尚不清楚(Bendszus M 和 Stoll G, 5Lancet Neurol.364-372，2006)。
[0005]由於損傷的彌散性質，SBI患者通常不存在如在中風中存在的局灶性明確確定的神經功能缺損。然而，行為改變、神經心理缺損和加重的血管性痴呆經常在許多大手術(例如冠狀動脈旁路術、膜置換術、頸動脈內膜切除術或支架安裝)後的患者中和許多重症監護室中的具有血管介入、冠狀血管造影術、動脈導管線或主動脈內反搏術(intra-aortic counterpulsation)裝置的患者中看到。這些症狀在醫療操作後極其普遍，但極少看作與所述操作直接相關。隨著日益靈敏的成像模式例如彌散加權磁共振成像(diffusion-weighted MRI,DffI)的出現，對無明顯的臨床症狀例如癱瘓或敏感性缺乏但確實存在腦損傷的了解日益增加。
[0006]已進行手術和操作(尤其是牽涉心血管結構的那些手術和操作)的患者中高達45%產生SBI。在美國每年進行200多萬次的冠狀血管造影術具有11-15%的SBI風險(Bendszus M 和 Stoll G, 5Lancet Neurol.364-372，2006)。高達 26% 的經歷診斷性血管造影的患者，高達54%的經歷頸動脈支架術的患者以及高達45%的心臟手術後的患者可患上SBI (Bendszus M 和 Stoll G, 5Lancet Neurol.364-372，2006)。
[0007]除了認知功能衰退的風險增加、中風風險增加和日益惡化的痴呆外，SBI的臨床表現還包括行為和神經心理學改變(Vermeer SE等人34Strokel 126-1129，2003 ；KobayashiS等人28Strokel932-1939, 1997)。已顯示SBI的存在使60-90歲的患者患痴呆的風險超過2倍，並且在神經心理學測試中導致更急劇的整體認知功能下降和惡化的行為(VermeerSE 等人 34Strokel 126-1129，2003 ；Lopez OL 等人 60Arch.Neurol.1394-1399，2003)。
[0008]SBI與臨床中風不同。臨床中風會導致明確確定的神經功能缺損，並且通常涉及為腦供應含氧血的動脈中易損斑塊的自發性破裂或歸因於由心房顫動引起的心臟的血栓栓塞症。與中風相反，處於SBI風險中的患者可能不具有潛在的動脈粥樣硬化疾病或者中風或血栓形成的風險因子。經歷血管手術的患者可包括例如具有先天性心臟缺損的患者。因在醫療操作中引入的微栓塞物的副作用，此類在其它方面健康的患者仍然處於發生 SBI 的風險中(Harrison，s Principles of Internal Medicine 第 16 版(KasperDL, Fauci, AS, Longo, DL, Braunwald E, Hauser SL, Jameson JL eds.,2005))。因此，可從SBI的預防性療法或治療受益的患者群包括經歷包括與血管系統的結構接觸的醫療操作的患者。
[0009]雖然已顯示肝素能減少由動脈內腦血管造影術引起的臨床無症狀性栓塞性事件(Bendszus等人，Circulationll0:2110_2115，2004)，其具有相對高的顱外和顱內出血併發症的風險。此外，不清楚由不同類型的栓塞物引起的不同SBI事件是否牽涉相似的分子機制和/或可使用類似的治療劑來治療。期望的療法將能減少由所有類型的栓塞物引起的缺血性損傷，包括由氣泡、油、脂肪、膽固醇、凝固的血液和/或碎片組成的微栓塞物，但不影響止血(例如肝素所表現的)。因此，需要無論什麼原因引起的SBI和其它器官中的缺血(例如彌散性栓塞性缺血)的安全有效的治療。研究SBI和評價治療的動物模型的開發一直面臨挑戰，因為需要產生彌散性微損傷而不引起明顯的中風。因此，仍然需要SBI的現實動物模型來研究組織損傷的分子機制和評價治療劑候選者。
[0010]因子XII(FXII)是參與內源性凝血級聯活化的絲氨酸蛋白酶。最近，已發現小鼠中因子XII的缺乏或抑制會減少中風模型的腦損傷，並且防止動脈血栓形成，但不增加出血的風險(W02006/066878 ；W02008/098720 ；Kleinschnitz C 等人 203J.Exp.Med.513-518，2006 ；Renne T 等人 202J.Exp.Med.271-281，2005)。與 FXII 缺陷型小鼠類似，缺乏FXII的人，即使在大型手術期間，也不遭受異常出血的痛苦(Ratnoff OD和Colopy JE,34J.Clin.1nvest.602-613, 1955 ；Colman RW, Hemostasis and Thrombosis.Basic Principles&Clinical Practicel03-122(Colman RW, Hirsch J, Mader VJ, ClowesAW, George J eds.,Lippincot t ffilliams&ffilkins, Philadelphia, 2001) ；SchmaierAH, 118J.Clin.1nvest.3006-3009，2008)。
[0011]最近，Infestin-4被報導為活化的FXII (FXIIa)的新型抑制劑。Infestin是一類來源於吸血昆蟲騷擾錐蝽(Triatoma infestans)(已知引起Chagas病的寄生蟲克氏錐蟲(Trypanosoma cruzi)的主要載體)的中腸的絲氨酸蛋白酶抑制劑(CamposITN 等人 32Insect Biochem.Mol.Bi0.991-997, 2002 ；Campos ITN 等人 577FEBSLett.512-516，2004)。該昆蟲使用此類抑制劑來阻止攝入的血液的凝固。Infestin基因編碼4個結構域，形成可抑制凝血途徑中的不同因子的蛋白質。具體地，結構域4編碼作為FXIIa的強抑制劑的蛋白質(Infestin-4)。Infestin-4已被施用於小鼠而無出血併發症發生(TO2008/098720)。
[0012]儘管異質性機制導致SBI和其它器官的缺血，包括彌散性栓塞性缺血，但本申請的實施方案提供了 FXII抑制劑，特別地包含Infestin-4的蛋白質及其變體，來治療SBI和其它器官的缺血。此外，本申請提供了模擬可在醫療操作期間進入循環的各種類型栓塞物的SBI的動物模型。本文中描述的動物模型可用作研究SBI和評價治療劑候選者的工具。
[0013]發明概述
[0014]本申請提供了在接受醫療操作的患者中施用因子XII (FXII)抑制劑的方法，其中所述醫療操作包括與如下的至少一種接觸:心臟；至少一種選自主動脈、主動脈弓、頸動脈、冠狀動脈、頭臂動脈(brachiocephalic artery)、脊椎基底動脈循環(vertebrobasilarcirculation)、顱內動脈、腎動脈、肝動脈、腸繫膜動脈中至少一種血管和/或心臟顱側的動脈系統的血管；和靜脈血管(如果患者具有已知的中隔缺損的話)。醫療操作包括在體內的至少一種所述血管的中釋放至少一個栓塞物，這可導致目標器官的缺血，以及在醫療操作之前、期間和/或之後施用FXII抑制劑。「FXII抑制劑」是指因子XII和激活的因子XII(FXIIa)之一或兩者的抑制劑。
[0015]栓塞物可由各種材料組成。例如，栓塞物由氣泡、油、脂肪、膽固醇、凝固的血液和/或碎片組成。在一個實施方案中，栓塞物不是血栓。
[0016]在一個實施方案中，目標器官是腦，患者患有、已患有或有風險患上(i)無症狀性腦缺血或(ii)由非血栓可溶解性(nonthrombolysable)物質引起的中風。在另一個實施方案中，目標器官是心臟、腎、肝和/或胃腸道器官，包括食管、胃、小腸和/或大腸(包括結腸和/或直腸)。
[0017]在一個實施方案中，醫療操作包括與所述血管中至少之一的內側接觸。在另一個實施方案中，醫療操作包括一個或多個所述血管的夾閉。
[0018]在一個實施方案中，醫療操作是血管手術。在某些實施方案中，醫療操作是冠狀血管造影術、頸動脈支架安裝、經皮冠狀血管介入療法(percutaneous coronaryintervention)、頸動脈內膜切除術(carotid endarterectomy)或心血管手術。在另一個實施方案中，醫療操作是狹窄性腎動脈的擴張術。在一個實施方案中，醫療操作是診斷性的血管手術。在某些實施方案中，醫療操作是包括導管、支架、氣囊和/或移植物中的任一種或多種的血管手術。在另一個實施方案中，醫療操作包括施用造影劑，因為造影劑的注射可無意中產生氣泡和/或移動碎片等。
[0019]在一個實施方案中 ，FXII抑制劑包括野生型Infestin-4(SEQ ID NO:1)多肽序列或其變體。在另一個實施方案中，Infestin-4的變體包含野生型Infestin-4序列的N末端胺基酸2-13，和所述N末端胺基酸之外的至少一個和多達5個胺基酸突變，所述突變導致與野生型Infestin-4序列的差異；和/或包含來自野生型Infestin-4序列的6個保守半胱氨酸殘基和與野生型Infestin-4序列有至少70%的同源性。參見圖2。在另一個實施方案中，所述FXII抑制劑包括SPINK-1 (SEQ ID NO: 2)，一種在胰腺中表達的人蛋白，其被突變而包括野生型Infestin-4序列的N末端胺基酸2-13(示為SEQ ID N0:3)，或所述突變的SPINK-1的變體。在某些實施方案中，所述突變的SPINK-1的變體包括:野生型Infestin-4序列的N末端胺基酸2-13，並且具有所述N末端胺基酸之外的至少一個和多達5個胺基酸突變，所述突變導致與野生型SPINK-1序列的差異並且增加變體與野生型Infestin-4序列的同源性，和/或包括來自野生型SPINK-1序列的6個保守半胱氨酸殘基和與野生型SPINK-1序列有至少70%的同源性。在一個實施方案中，FXII抑制劑是SPINK KU K2或K3 (SEQ ID N0:3、4 或 5)。
[0020]在另一個實施方案中，FXII抑制劑選自AT III抑制劑、血管緊張素轉化酶抑制劑、C1抑制劑、抑肽酶、α-1蛋白酶抑制劑、抗蛋白酶素([(S)-1-羧基-2-苯乙基]-氨甲醯基-L-Arg-L-Val-Arginal) >Z-Pro-Pro-醒-二甲基乙酸酯、DX88、亮抑酶妝(Ieupeptin)、脯氨醯寡肽酶的抑制劑例如Fmoc-Ala-Pyr-CN、玉米胰蛋白酶抑制劑、牛胰胰蛋白酶抑制劑的突變體、大腸桿菌素(ecotin)、YAP(黃鰭金槍魚抗凝血劑蛋白(yellowfin soleanticoagulant protein))、笑瓜(Cucurbita maxima)胰蛋白酶抑制劑_v和/或笑瓜同效抑制劑(isoinhibitor)。
[0021]在另一個實施方案中，FXII抑制劑是抗-FXII抗體，抗-FXII抗體是指結合併且抑制FXII和/或FXIIa的抗體。[0022]在某些實施方案中，將FXII抑制劑連接至增加半衰期的多肽(HLEP)。在一個實施方案中，HLEP可以是例如白蛋白、afamin、甲胎蛋白或維生素D結合蛋白。在一個實施方案中，HLEP可以是人白蛋白或其變體。在其它實施方案中，HLEP是免疫球蛋白。免疫球蛋白部分可以是來自IgG的Fe。
[0023]在另一個實施方案中，FXII抑制劑通過接頭連接至HLEP。在一個實施方案中，接頭可以是可切割的。在某些實施方案中，接頭可被內源性、外源性和/或共同的凝血途徑的凝血蛋白酶切割。在一個實施方案中，接頭被FXIIa切割。
[0024]本申請的另一個方面涉及包括操作的SBI的動物模型，其中所述操作包括將至少一個栓塞物釋放進入動物的動脈系統(這可導致腦的缺血性損傷)，以及評價動物中腦的缺血性損傷的適應徵。缺血性損傷在臨床上是無症狀的。在本說明書中，術語「釋放」或「釋出」包括將外源性來源的栓塞物提供至動物的動脈系統中和使用技術在內部產生栓塞物，但不包括將線插入血管而產生血栓。在一個實施方案中，操作包括將栓塞物釋放進入動脈系統。在一個實施方案中，操作包括將栓塞物釋放進入頸動脈。在某些實施方案中，操作包括使用導管釋放栓塞物。在另一個實施方案中，操作包括夾閉和/或手術。在一個實施方案中，動物模型包括評價動物中其它目標器官包括心臟和/或腎的缺血性損傷。在一個實施方案中，操作不包括將線插入血管以產生血栓。在一個實施方案中，操作不會引起動物的中風。
[0025]在一個實施方案中，栓塞物包括螢光材料。在某些實施方案中，栓塞物由非血栓可溶解性材料組成(意指栓塞物可能不被血栓溶解劑溶解)。在此類實施方案中，栓塞物不是血栓。例如，栓塞物可由聚合物、氣泡、油、脂肪、膽固醇和/或碎片組成。在一個實施方案中，栓塞物是微珠(包括微球體或微粒)。栓塞物可由50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的非血栓可溶解性物質組成。在另一個實施方案中，栓塞物由凝固的血液組成。在一些實施方案中，評價包括成像和/或組織學。在一些實施方案中，成像包括MRI和/或SPECT。在一個實施方案中，動物模型是小鼠。在另一個實施方案中，動物模型是大鼠。
[0026]在另一個實施方案中，所述動物模型用於評價減少SBI的治療劑候選者。在該實施方案中，給動物施用治療劑，測試其減少腦內缺血性損傷的能力。在另一個實施方案中，給動物施用治療劑，測試其減少其它目標器官內缺血性損傷(包括彌散性栓塞性缺血)的能力。在某些實施方案中，治療劑候選者是凝血途徑的抑制劑。在一個實施方案中，治療劑是FXII的抑制劑。在一個實施方案中，治療劑是抗體。在另一個實施方案中，治療劑是蛋白質、肽、核酸或小分子。在一些實施方案中，在操作之前、期間和/或之後給動物施用所述治療劑候選者。
[0027]在一個實施方案中，使用成像法(包括MRI和/或SPECT成像)來評價目標器官的缺血性損傷，以開發FXII的抑制劑。在施用FXII抑制劑之前和/或之後進行成像法。在一個實施方案中，目標器官是腦。[0028]其它實施方案示於下列項中。
[0029]項1.因子XII (FXII)的抑制劑用於預防和/或治療接受醫療操作的患者中的缺血，其中所述醫療操作包括接觸如下的至少之一: [0030](a)心臟，
[0031](b)至少一種選自主動脈、主動脈弓、頸動脈、冠狀動脈、頭臂動脈、脊椎基底動脈循環、顱內動脈、腎動脈、肝動脈、腸繫膜動脈之中的血管和/或靠近心臟的動脈系統的血管，
[0032](C)靜脈血管，如果患者具有已知的中隔缺損的話；
[0033]並且其中所述醫療操作包括在體內的至少一種所述血管中釋放至少一個栓塞物，所述栓塞物可在至少一個目標器官中導致所述缺血並且其中在醫療操作之前、期間和/或之後施用FXII抑制劑。
[0034]項2.根據項I的因子XII抑制劑的使用，其中所述栓塞物由氣泡、油、脂肪、膽固醇、凝固的血液和/或碎片組成。
[0035]項3.根據項I和2的因子XII抑制劑的使用，其中所述目標器官是:
[0036](a)腦，並且其中所述患者患有、已患有或有風險患上無症狀性腦缺血或中風，其中所述中風由非血栓可溶解性物質引起；和/或
[0037](b)心臟、腎、肝；和/或胃腸道器官。
[0038]項4.根據項I至3的因子XII抑制劑的使用，其中所述醫療操作包括:
[0039](i)與所述血管中至少一種或多種的內側的接觸；
[0040](ii)所述血管中至少一種或多種的夾閉；
[0041](iii)包括導管、支架、氣囊、移植物和/或施用造影劑的任一個或多個的血管手術；
[0042](iv)血管手術和/或為診斷性的血管操作；和/或
[0043](V)冠狀血管造影術、頸動脈支架安裝、經皮冠狀血管介入療法(percutaneouscoronary intervention)、頸動脈內膜剝離術(carotid endarerectomy)、心血管手術或狹窄腎動脈的擴張術。
[0044]項5.根據項I至4的因子XII抑制劑的使用，其中所述FXII抑制劑包括:
[0045](i)野生型Infestin-4多肽序列(SEQ ID NO:1)或其變體，其中變體包括:
[0046](a)野生型Infestin-4序列的N末端胺基酸2_13和所述N末端胺基酸之外的至少一個和多達5個胺基酸突變，所述突變導致與野生型Infestin-4序列的差異；
[0047]和/ 或
[0048](b)來自野生型Infestin-4序列的6個保守半胱氨酸殘基和與野生型Infestin-4序列有至少70%的同源性；
[0049](ii)SPINK-l，其被突變而包括野生型Infestin-4序列N末端胺基酸2-13，或所述突變的SPINK-1的變體，其中變體包含:
[0050](a)野生型Infestin-4序列的N末端胺基酸2_13和所述N末端胺基酸之外的至少一個和多達5個胺基酸突變，所述突變導致與野生型SPINK-1序列的差異並且增加變體與野生型Infestin-4序列的同源性；
[0051]和/或[0052](b)來自野生型SPINK-1序列的6個保守半胱氨酸殘基和與野生型SPINK-1序列有至少70%的同源性；
[0053](iii)AT II1、血管緊張素轉換酶抑制劑、Cl抑制劑、抑肽酶、α-l蛋白酶抑制齊L1、抗蛋白酶素([(S)-1羧基-2-苯乙基]-氨甲醯基-L-Arg-L-Val-Arginal)、Z-Pro-Pro-醛-二甲基乙酸酯、DX88、亮抑酶肽、脯氨醯寡肽酶的抑制劑例如Fmoc-Ala-Pyr-CN,玉米-胰蛋白酶抑制劑、牛胰胰蛋白酶抑制劑的突變體、大腸桿菌素、YAP(黃鰭金槍魚抗凝血劑蛋白)、筍瓜胰蛋白酶抑制劑-V、筍瓜同效抑制劑和/或Pro-Phe-Arg-氣甲基-麗(PCK);和 / 或
[0054](iv)抗-FXII抗體，其中所述抗體結合FXII並且抑制其活性和/或活化。
[0055]項6.根據項5的因子XII抑制劑的使用，其中突變的SPINK-1的變體為SPINK KUK2 或 K3(SEQ ID N0:3、4 或 5)。
[0056]項7.根據項I至5的因子XII抑制劑的使用，其中所述FXII抑制劑連接了增加半衰期的多肽，其中所述增加半衰期的多肽任選地是:
[0057](i)白蛋白、afamin、甲胎蛋白或維生素D結合蛋白；或
[0058](ii)人白蛋白或其變體；或
[0059](iii)免疫球蛋白或其變體；或
[0060](iV) IgG 的 Fe。
[0061]項8.根據項·7的因子XII抑制劑的使用，其中所述增加半衰期的多肽通過接頭連接至FXII抑制劑，並且其中所述接頭任選地可被內源性、外源性或共同的凝血途徑的凝血蛋白酶切割。
[0062]項9.成像方法用於開發因子XII抑制劑的用途，包括施用因子XII抑制劑候選物和使用放射或核醫學例如CT (任選地SPECT-CT和/或FMT-CT)) ；MRI (任選地彌散加權磁共振(DWI)和/或fMRI) ；PET ;光學成像(任選地突光反射成像(fluorescence reflectanceimaging);超聲、顯微鏡檢查、突光檢查、放射自顯影術和/或磷體成像)評價因子XII抑制劑候選物對動物目標器官的缺血的效果，其中所述缺血由栓塞物引起，和
[0063](i)所述目標器官是腦、心臟、腎、肝和/或胃腸道器官，以及
[0064](ii)如果所述目標器官是腦，則其中所述缺血性損傷在臨床上是無症狀的和/或所述栓塞物是非血栓可溶解性的。
[0065]項10.組織學方法用於開發因子XII抑制劑的用途，其包括施用因子XII抑制劑候選物和使用TTC染色、免疫組織化學和/或組織化學評價所述因子XII抑制劑候選物對動物中目標器官的缺血的效果，其中所述缺血由栓塞物引起，和
[0066](i)所述目標器官是腦、心臟、腎、肝和/或胃腸道器官，和
[0067](ii)如果所述目標器官是腦，則其中所述缺血性損傷在臨床上是無症狀的和/或所述栓塞物是非血栓可溶解性的。
[0068]項11.一種缺血的動物模型，其包括:
[0069](a)操作，其中所述操作包括有意地將至少一個栓塞物釋放在動脈系統中，這可導致至少一個目標器官的缺血性損傷，
[0070]⑴其中所述目標器官是腦、心臟、腎、肝和/或胃腸道器官；和
[0071](ii)如果所述目標器官是腦，則其中所述缺血性損傷在臨床上是無症狀的和/或所述栓塞物是非血栓可溶解性的；和
[0072](b)評價所述動物中目標器官的缺血性損傷的指徵。
[0073]項12.根據項9至11的方法，其中所述操作包括
[0074](i)將所述栓塞物釋放進入血管；
[0075](ii)將所述栓塞物釋放進入動脈；
[0076](iii)將所述栓塞物釋放進入心臟、主動脈、主動脈弓、頸動脈、冠狀動脈、頭臂動脈、脊椎基底動脈循環、顱內動脈、腎動脈、肝動脈、腸繫膜動脈和/或心臟顱側的系統的血管；和/或
[0077](iv)將所述栓塞物釋放進入頸動脈。
[0078]項13.根據項9或11的方法，其中所述評價步驟包括磁共振成像和/或SPECT成像。
[0079]項14.根據項9至11的方法，其用於評價治療缺血的治療劑候選物，其中
[0080](i)測試所述治療劑候選物降低目標器官中缺血性損傷的能力，並且其中在操作之前、期間和/或之後給所述動物施用所述治療劑候選物；和/或
[0081](ii)所述治療劑候選物是凝血途徑的抑制劑。
[0082]項15.根據項9至14的方法，其中所述治療劑候選物是
[0083]⑴FXII抑制劑，或
[0084](ii)抗體，或
[0085](iii)小分子。
[0086]本申請中各實施方案的其它目的和有利方面部分地示於下列描述中，部分地根據所述描述而顯而易見，或可在實踐中學習。各實施方案的目的和有利方面將通過所附權利要求中明確指出的要素和組合來展示。
[0087]附圖概述
[0088]專利或申請文件包含至少一個彩色附圖。在申請並且支付必要的費用後將由專利局提供具有彩色附圖的此專利或專利申請的複印件。
[0089]圖1.R.prolixus抑制劑與凝血酶以及SPINK-1與胰凝乳蛋白酶的接觸位點。#表示作為R.prolixus抑制劑與凝血酶之間的接觸位點的胺基酸；+表示作為SPINK-1與胰凝乳蛋白酶之間的接觸位點的胺基酸。
[0090]圖2.1nfestin-4 (14)與SPINK-1 (SP)之間的胺基酸序列相似性。*表示相同的胺基酸；I表示相似胺基酸；粗體胺基酸是保守半胱氨酸；Infestin-4序列的加以下劃線的胺基酸2-13是保守的。
[0091]圖3.1nfestin-4、SPINKl 和 3 個 SPINKl 變體(K1、K2 和 Κ3)的胺基酸序列。* 表示相同的胺基酸；I表示相對於Infestin-4序列相似的胺基酸。14的加以下劃性的序列被用於替代SPINK-1的15個胺基酸，產生Kl。變體K2和K3是通過在Kl序列上進行額外的點突變(加以下劃線的胺基酸)產生的。
[0092]圖4.模型。(A)注射前FTC+微珠粒的螢光圖像。(B)從新鮮小鼠血液製備的離體形成和標記的凝固血液的螢光圖像。(C)舉例說明栓塞物的施用的卡通圖。將遞送導管插入頸外動脈(ECA)。ICA:頸內動脈，CCA:頸總動脈。在注射過程中，暫時結紮CCA以迫使栓塞物進入ICA。(D，E)注射微珠粒(D)或凝固血液(E)後腦表面的螢光圖像。[0093]圖5.rHA-1nfestin-4減少損傷，通過氯三苯基四唑.鎮(TTC)定量的。施用栓塞
物後第3天利用TTC掃描對組織損傷進行的評估示於條線圖中。顯示了代表性TTC切片和相應腦切片的螢光反射圖像。數據表示為平均值+平均值的標準誤差。*p〈0.05。
[0094]圖6.rHA-1nfestin-4不增加繼發性出血(第3天)。注射珠粒或凝固血液後第3天評估繼發性出血。每小鼠顯示一個代表性腦切片。紅色框架表示其中檢測到出血(箭頭)的小鼠。 [0095]圖7.rHA-1nfestin_4在施用凝固血液後減少受損區域中的FXIII活性，如通過SPECT-CT估量的。在施用由凝固血液組成的栓塞物後3小時估量血漿轉穀氨醯胺酶活性(FXIIIa)。FR1:顯示凝固血液的位置的螢光反射成像。％IDGT是指每克組織注射的劑量。TBR:目標對本底比率。數據表示為平均值+平均值的標準誤差。*P〈0.05。
[0096]圖8.rHA-1nfestin_4在施用微珠粒後減少受損區域中的FXIII活性，如通過SPECT-CT估量的。在施用珠粒栓塞物後3小時估量血漿轉穀氨醯胺酶活性(FXIIIa)。FRI:顯示珠粒的位置的螢光反射成像。%IDGT是指每克組織注射的劑量。TBR:目標對本底比率。數據表示為平均值+平均值的標準誤差。*P〈0.05。
[0097]圖9.FXIII的免疫組織化學。施用珠粒或凝固血液後3小時FXIII的免疫組織化學染色。條棒表不50 μ m。
[0098]圖10.施用凝固血液後通過MRI測量到MPO活性未改變。施用由凝固血液組成的栓塞物後3天估量MPO活性。FR1:螢光反射成像，顯示凝固血液的位置。AU:任意單位。CNR:對比噪聲比(Contrast To Noise Ratio)。數據表示為平均值+平均值的標準誤差。*p>0.05。
[0099]圖11.施用微珠粒後通過MRI測量到MPO活性未改變。施用由微珠粒栓塞物後3天估量MPO活性。FR1:螢光反射成像，顯示珠粒的位置。AU:任意單位。CNR:對比噪聲比。數據表示為平均值+平均值的標準誤差。*P>0.05。
[0100]詳細描述
[0101]本申請的實施方案涉及對接受醫療操作的患者施用因子XII (FXII)抑制劑的方法，其中醫療操作包括與下述中至少一種的接觸:心臟；至少一種選自主動脈、主動脈弓、頸動脈、冠狀動脈、頭臂動脈、脊椎基底動脈循環、顱內動脈、腎動脈、肝動脈、腸繫膜動脈中的至少一種血管和/或心臟顱側的動脈系統的血管；和靜脈血管，如果患者具有已知的中隔缺損的話。醫療操作包括在體內的至少一種所述血管中釋放至少一個栓塞物，這可導致目標器官的缺血，以及在醫療操作之前、期間和/或之後施用FXII抑制劑。缺血可由各種類型的栓塞物引起，無論栓塞物是否由氣泡、油、脂肪、膽固醇、凝固血液和/或碎片組成。在一個實施方案中，目標器官是腦，並且患者患有、已患有SBI或處於發生SBI的風險中。此外，本申請的實施方案提供了可用於研究SBI和用於評價治療劑候選物的SBI動物模型。
[0102]本申請實施方案的一個有利方面是SBI可在經歷一系列醫療操作或者呈現或未呈現不同疾病狀況的患者中減少。所述方法的成功不依賴於患者具有還是不具有下列操作或疾病狀況的任一種。所述方法的成功因而不依賴於患者具有還是不具有任何潛在的疾病或例如血栓形成的潛在風險。事實上，相信所述方法在不具有例如血栓形成的潛在風險但接受醫療操作例如以修正先天性心臟缺損的患者中有效地起作用。因此，患者群體比處於血栓形成風險中的患者群體更廣泛，從而也有所不同。本申請意欲涉及包括或不包括具有特定操作或疾病狀況的那些患者的患者群體亞組。
[0103]1.定義
[0104]如本申請中所用，縮寫「FXII」是指因子XII或活化的因子XII(FXIIa)或兩者。因此，術語「FXII抑制劑」包括FXII和FXIIa之一或兩者的抑制劑。此外，抗-FXII抗體包括結合併且抑制FXII和FXIIa之一或兩者的抗體。
[0105]如此處所用，術語「缺血」是指人患者或動物中對組織或目標器官的供血不足的狀況，如果不治療，所述狀況可導致缺血性損傷。例如，大腦或「腦缺血」是指至腦的血液的減少，這樣氧供應不能滿足腦組織的需要。腦「梗死」是指如果缺血或血流停止持續足夠長時間而導致細胞死亡時可導致的死亡腦組織。梗死可使用計算機斷層攝影術(CT)或MRI來鑑定。梗死還可指由小的缺血性損傷或微小病變(其特徵在於彌散性並且太小以至於在常規MRI中不導致明確改變)引起的死亡組織。此類小的梗死可利用更靈敏的成像模式例如彌散加權MRI來顯示。
[0106]如本文中所用，術語「缺血性損傷」是指可因缺血(例如彌散性或局灶性缺血、微小損傷、短暫缺血、微小損傷、損傷、微梗死或梗死)而對目標器官發生的一系列損害。缺血損傷的進一步特徵可在於它們可由栓塞物(包括氣泡、油、脂肪、膽固醇、凝固血液和/或碎片)引起。取決於栓塞物的尺寸，可造成不同的事件。例如，如果栓塞物(例如非血栓可溶解性物質，包括空氣泡)較大，則其可引起中風。這樣的事件可以是心臟手術或動脈內手術的副作用。如果栓塞物(例如空氣泡)較小或存在許多小的栓塞物例如多個空氣泡，則其可引起SBI。在一個實施方案中，中風例如由空氣泡所組成的栓塞物引起。
[0107]術語「無症狀的」，當指「無症狀性腦缺血」(「SBI」)或「無症狀腦梗死」或「臨床上無症狀的」時，是指缺乏急性和明顯的定義中風的症狀例如輕偏癱、感覺減退和/或失語症的腦組織內缺血的狀況。中風可定義為與腦循環的損害相關的任何急性臨床事件，其導致持續超過24小時的局灶性神經功能缺損。SBI可能與更細微的神經功能缺損相關，包括但不限於行為改變、更糟的認知能力、視野缺損、手臂和腿的擾動(arm and legdisturbance)、虛弱、抑鬱性症狀、軀體功能的減退和加重的血管性痴呆。例如,與先發性短暫缺血發作或中風樣症狀相關的梗死可被定義為症狀性的，而不具有相應的中風樣症狀的梗死可被定義為「無症狀的」。術語「無症狀的」並不意味著無症狀；其意指症狀與典型的中風不同，並且通常更細微，在某些情況下僅以其它方式表現它們自己，僅可通過尖端的成像或更強的測試例如認知測試來檢測。術語「彌散」，當指器官內的彌散性栓塞性缺血時，是指缺血的一個特徵，其由栓塞物向器官中超過一個位置發生散布引起的，即缺血不是局灶性的。
[0108]如此處所用，術語「降低」包括降低個體或動物中SBI的概率，減輕任何症狀的嚴重度，和/或降低處於患SBI風險的群體中實際患上SBI的患者的比例。因此，「減少」是指減小、降低、減弱、限制、減輕或改善SBI的狀況。減少SBI可包括例如保護以免於SBI的發生；減小SBI的風險，當SBI發生或一旦其已發生時減輕其嚴重度；限制SBI的損傷，例如限制缺血性損傷發展成梗死；減少SBI的擴散，例如限制受缺血性損傷影響或損害的腦區域或血管的量；或改善與SBI相關的腦病況，例如炎症或水腫。
[0109]在一個實施方案中，患者患有或已患有SBI。在某些實施方案中，患者處於發生SBI的「風險」中。處於SBI 「風險」中的患者包括已接受、正在接受或將接受醫療操作的患者，所述醫療操作包括與如下的任一個的接觸:心臟；主動脈、主動脈弓、頸動脈、冠狀動脈、頭臂動脈、脊椎基底動脈循環、顱內動脈、腎動脈、肝動脈、腸繫膜動脈，和/或心臟顱側的動脈系統的血管；和靜脈血管(如果患者具有已知的中隔缺損的話)。處於SBI 「風險中」的患者已接受、正在接受或將接受醫療操作，所述醫療操作包括將至少一個栓塞物釋放在體內血管中。可在醫療操作之前、期間和/或之後進行給患有、已患有SBI或有風險患上SBI的患者施用FXII抑制劑的方法，以限制SBI的發生，或限制SBI的發展或減輕其損害。在某些實施方案中，患者無需患有SBI來施用FXII抑制劑。例如，患者在進行醫療操作之前可能不患有SBI，或可能不知道患者在進行醫療操作之前、期間和/或之後是否患有SBIJM在這些情況下，患者因醫療操作而處於發生SBI的「風險中」，從而可施用FXII抑制劑。在某些實施方案中，患者或動物在施用FXII抑制劑之前、期間和/或之後可能患有SBI。在某些實施方案中，患者或動物在施用FXII抑制劑之前、期間和/或之後可能不患有SBI。[0110]術語「可導致」意指包括其中目標器官的缺血在接受產生栓塞物的操作的患者或動物以及尚未接受FXII抑制劑的患者或動物中發生的情形；其還包括其中目標器官的缺血不在接受操作的人或動物中發生(因為患者或動物事先或同時接受了 FXII抑制劑的施用)的情形。如果患者或動物在操作後短時間內(例如操作結束後1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、
15、20或30分鐘內，I小時內或2、4、6、8、12、24、28、72或96小時內)接受FXII抑制劑，則缺血(以及如果缺血持續的話將會發生的任何梗死)也可能不發生。
[0111]例如，在動物模型的一個實施方案中，可在操作之前、期間和/或之後短時間內(如上定義的)施用FXII抑制劑，因此動物可能不發生SBI。在該動物模型的另一個實施方案中，可在操作之後施用FXII抑制劑，並且動物可能發生SBI。該術語還指並非具有所包括的醫療操作之一的每一個患者事實上有栓塞物被移除的事實。所有這些情形都包括在本申請的實施方案中。
[0112]短語在動物受試者中「誘導無症狀性腦缺血」是指所述方法中，所述動物具有缺血性損傷的指徵，例如腦的梗死，例如通過成像和/或組織學顯示的，以及其中症狀在臨床是無症狀性的,如上文中和實施例2A中所描述的。
[0113]「接受」醫療操作的患者是指將進行醫療操作、正在進行醫療操作、或已進行了醫療操作的患者。
[0114]如「允許FXII抑制劑減少缺血性損傷」中所用，術語「允許」被定義為以足以減少腦內缺血性損傷的量和施用途徑施用FXII抑制劑。術語「減少」和「缺血性損傷」在上文中已定義。缺血性損傷的量可通過各種成像模式(其包括但不限於MRI和/或CT)來進行估量。
[0115]「栓塞物」是指由固體、液體或氣體組成的能夠阻塞血管的任何脫落的血管內物質。阻塞可在遠離起始點的位置發生。栓塞物的組成包括、但不限於氣泡或C02;油、脂肪、膽固醇；碎片例如血管碎片，例如鈣化物、組織或腫瘤碎片；凝固血液、生物體例如細菌或寄生蟲或其它傳染源；或外來物質。術語「氣泡」包括由空氣或其它氣體或在某些情況下由不是血液或凝固血液的液體形成的栓塞物。氣泡在形狀上可以是球形的或非球形的。在一個實施方案中，栓塞物不是血栓。在另一個實施方案中，栓塞物由凝固血液組成。術語「微栓塞物」包括在如本文中所用的術語「栓塞物」中，是指具有微觀尺寸的栓塞物，並且可由與上文中定義的栓塞物相同的材料組成。因此，「栓塞物」包括單個或多個栓塞物、微栓塞物、大批栓塞物或大批微栓塞物。
[0116]栓塞物可以是動脈栓塞物，其中脫落的血管內物質處於動脈或動脈系統的血管中。在一個實施方案中，栓塞物是「反常栓塞物」，其是指因例如中隔缺損而進入動脈系統的靜脈來源栓塞物。
[0117]「同源性」是指相同的或組成保守性置換的胺基酸的百分數。同源性可使用序列比較程序例如 GAP (Deveraux等人，1984, Nucleic Acids Researchl2, 387-395,將所述文獻通過引用併入本文)來進行測定。這樣，可通過將缺口插入比對來比較具有與本文中引用的序列相似長度或明顯不同長度的序列，這樣的缺口可以例如通過GAP使用的比較算法來確定。
[0118]I1.醫療操作
[0119]在一個實施方案中，給接受醫療操作的患者施用FXII抑制劑。如本文中所用，術語「醫療操作」是指診斷、幹預、治療或手術的行為。在一個實施方案中，醫療操作包括與如下的至少一個的接觸:心臟；選自主動脈、主動脈弓、頸動脈、冠狀動脈、頭臂動脈、脊椎基底動脈循環、顱內動脈、腎動脈、肝動脈、腸繫膜動脈中的至少一種血管，和/或心臟顱側的動脈系統的血管；和靜脈血管(如果患者具有已知的中隔缺損的話)。如本文中所用，術語「接觸」是指儀器、外部物體、人例如外科醫生或因醫療操作觸碰所述血管結構的任何其它物體對所述血管結構的物理觸碰。在一個實施方案中，醫療操作包括與所述血管中至少一種的內側的接觸。在某些實施方案中，醫療操作包括對所述血管中一種或多種的夾閉。在一些實施方案中，醫療操作包括栓塞物的釋放，並且栓塞物可由氣泡、油、脂肪、膽固醇、凝固血液和/或碎片組成。在一些實施方案中，醫療操作包括導管、支架、氣囊、移植物中的任一種或多種，和/或施用造影劑，因為造影劑的注射可無意地產生空氣泡和/或逐出碎片等。
[0120]在一個實施方案中，醫療 操作是血管操作。術語「血管操作」包括影響心臟或血管的任何操作，其中血管被定義為運輸或包含血液的結構。血管操作可包括例如使用導管或施用造影劑。在某些實施方案中，醫療操作牽涉動脈系統，指涉及動脈、動脈分支、小動脈、毛細血管或參與將血液運離心臟的血管的手術。在一些實施方案中，醫療操作牽涉下列血管的一種或多種:主動脈、主動脈弓、頸動脈、冠狀動脈、頭臂動脈、脊椎基底動脈循環、顱內動脈、腎動脈；肝動脈，包括例如肝總動脈和/或肝固有動脈(hepatic artery proper);腸繫膜動脈，包括例如腸繫膜上動脈和/或腸繫膜下動脈；和/或心臟顱側的動脈系統的血管；靜脈血管(如果患者具有已知的中隔缺損的話)。
[0121]術語「診斷性的」是指實施來鑑定或評價病況、疾病或障礙的操作。診斷性操作可包括例如使用導管、支架、氣囊、移植物中的任一種或多種和/或施用造影劑。
[0122]在一個實施方案中，醫療操作是血管手術。血管手術是指牽涉脈管結構例如心臟或血管的手術。血管手術的實例包括、但不限於心血管手術，例如冠狀動脈-旁路移植術；或無心肺轉流的心臟動脈移植；心瓣膜置換或修復術，包括例如主動脈或二尖瓣、主動脈或二尖瓣瓣膜切開術或瓣膜成形術；心臟移植；改善狹窄或反流的病況的手術；牽涉心臟起搏器包括臨時起搏器或永久性起搏器、兩心室起搏器的手術；牽涉發生器(generator)改變、拔除導線或可植入的環狀記錄器、植入的心律轉換器(cardioverter) /去纖顫器裝置或支持循環的機械裝置例如體外泵或心室輔助裝置的手術；頸動脈內膜切除術；動脈內膜血栓切除術；主動脈瘤與剝離手術；透析入口操作例如動靜脈瘻；牽涉心臟腫瘤或外傷性心臟損傷的手術；和重建性手術或任何其它目前已知的手術或未來的血管手術。
[0123]血管手術可以例如包括先天性心臟缺損的糾治性手術。先天性心臟缺損的糾治性手術包括但不限於修復畸形或缺損的手術，例如房間隔或室間隔缺損的修復；動脈導管開放的修復；分流的修復；主動脈縮窄修復；全部或部分肺靜脈回流異常的修復；大動脈完全錯位的靜脈開關校正或心室內手術；法樂四聯症狀的修復；或用於先天性心臟缺損的任何其它目前已知的手術或未來的手術。
[0124]在一個實施方案中，醫療操作包括使用導管。如本文中所用，術語「導管」是指被插入血管的管。牽涉使用導管的操作的實例包括但不限於給血管安裝支架例如冠狀動脈、頸動脈安裝支架、顱內支架安裝、主動脈或髂動脈血管成形術；血管成形術例如氣囊血管成形術；血栓切除術；導管定向的溶栓術；栓塞物形成、化療法或加熱的直接或局部施用；心瓣膜置換術或修復；或主動脈或二尖瓣瓣膜切開術或瓣膜成形術。在一個實施方案中，醫療操作包括導管或支架的任何使用或牽涉血管剝離或夾閉的操作。血管手術可包括血管探測術例如血管內一線圈栓塞術(endovascular-coil occlusion)、血管內動脈瘤閉塞術或利用異物(例如鉬線圈(platinum coils))的頡內血管探測術。
[0125]在一個實施方案中，醫療操作包括成像。成像可用於使體內生物學和細胞過程可視化，並且可用於篩選、診斷、評價、監測或治療病況、疾病或障礙。成像可以包括或可以不包括使用導管。成像技術可使血管系統成像，例如冠狀血管造影術，包括診斷性血管造影或基於導管的血管造影術，包括觀察冠狀血管系統、肺血管系統或身體的任何部分的血管系統或主動脈造影照片。
[0126]在一個實施方案中，醫療操作包括施用造影劑、放射性同位素或染料。關於成像模式和通常使用的造影劑的論述，參見Pysz MA等人65Clinical Radiology500-516, 2010 ；下面給出造影劑和各種成像技術的實例。
[0127]例如，用於CT的造影劑包括但不限於鋇、碘、氪和氙。單光子-發射計算機斷層攝影術(single photon-em·ission computed tomography, SPECT-CT)中使用的造影劑包括但不限於 99mTc、1231、mIn、177Lu。正電子發射斷層攝影術(positron emission tomography,PET)中使用的常用造影劑包括但不限於同位素nC、18F、64Cu、68Ga。MRI中使用的造影劑包括但不限於釓(Gd3+)、氧化鐵顆粒(SP10、USP10)、氧化錳和19F。磁共振波譜分析(MRS)中使用的造影劑包括但不限於膽鹼、肌酸、乳酸鹽、脂質、聚(多)胺和N-乙醯基-天冬氨酸。微氣泡造影劑(Contrast microbubble)可用於超聲(US)例如充氣微球(例如過氟丁燒)或脂質外殼的氣泡。螢光分子、染料和/或吸光顆粒可用於光學成像技術。放射性示蹤元素可用於腫瘤學、心血管或神經學成像，例如nC、18F、64Cu、mIn、99mTC、9°Y、1311、1231-/131和153Sm。組織蛋白酶(Capthesin)B-或MMP2/9-激活的「智能(smart) 」突光探針可用於光學斷層攝影術。造影劑包括NIRF染料、量子點和具有表面增強拉曼散射(SERS)性質的納米顆粒可用於拉曼光譜分析。其它成像技術可包括利用對比例如微泡的超聲心動描記術(ECH0)，包括二維ECHO、負荷超聲(stress echo)、都卜勒ECHO和經食管內ECHO。成像技術可包括顯微術、光聲成像或任何其它目前已知或未來的分子成像模式和/或相關造影劑。分子成像可包括施用結合至組織或疾病特異性標誌物，或附著至用於靶向遞送的治療劑候選物的微珠粒(包括微球體和微粒)和納米顆粒。
[0128]可在進行醫療操作之前、期間和/或之後給患者施用FXII抑制劑。可在進行醫療操作之前、期間和/或之後1、2、4、6、12、24、48、72或96小時或更長時間內施用FXII抑制劑。FXII抑制劑可以以單次劑量或以多個劑量施用，或在進行醫療操作之前、期間和/或之後以0.25,0.5、1、2、4、6、12、24或48小時或更長時間的間隔反覆施用。還可在進行醫療操作之前、期間和/或之後以連續輸注的形式施用？乂11抑制劑1、2、4、6、12、24、48、72或96小時或更長時間。由於不增加出血風險的有利性質，因此可在進行醫療操作之前、期間和/或之後施用FXII抑制劑。可在臨床試驗中針對每一個具體操作確定施用的最佳時間。施用的時間安排還可取決於一系列因素，例如操作的類型或患者個體的病況，包括患者的病史、潛在疾病和/或其它療法的使用，並且可由醫護人員確定。
[0129]II1.FXII 抑制劑
[0130]如上文中所討論的，「FXII」是指因子XII和活化因子XII (FXIIa)之一或兩者。因此，「FXII抑制劑」包括FXII和FXIIa之一或兩者的抑制劑。此外，抗-FXII抗體包括結合和抑制FXII和FXIIa之一或兩者的抗體。術語「FXII抑制劑」還意欲包括與延長半衰期的多肽連接的FXII抑制劑，在一個實施方案中所述多肽包括接頭。
[0131]在一個實施方案中，FXII/FXIIa抑制劑是特異性FXII/FXIIa抑制劑，優選特異性FXIIa抑制劑。
[0132]特異性FXII/FXIIa抑制劑是指如果以1:1的摩爾比使用時，抑制除FXII和/或FXIIa外的血眾絲氨酸蛋白酶(plasmatic serine proteases)的水平低於或等於25%的抑制劑。換句話說:當將所述抑制劑以相應血漿絲氨酸蛋白酶對所述抑制劑的摩爾比1:1使用時，特異性FXII/FXIIa抑制劑抑制除FXII和/或FXIIa外的血漿絲氨酸蛋白酶低於或等於25%。例如，特異性FXII/FXIIa mAb抑制血漿絲氨酸蛋白酶FXIa僅5%，其中FXIa對所述mAb的摩爾比為1:1，而同一 FXII/FXIIa mAb抑制FXIIa至少80%，優選至少90%。
[0133]在本發明的一個實施方案中，如果以相應血漿絲氨酸蛋白酶對所述抑制劑的摩爾比1:1使用時，一種其它的血漿絲氨酸蛋白酶被抑制超過50%。
[0134]在本發明的另一個實施方案`中，如果以相應血漿絲氨酸蛋白酶對所述抑制劑的摩爾比1:1使用時，兩種其它的血漿絲氨酸蛋白酶被抑制超過50%。
[0135]在另一個實施方案中，FXII/FXIIa抑制劑是人FXII/FXIIa抑制劑，包括人源化單克隆抗體，優選完全人源化的單克隆抗體。
[0136]A.1nfestin-4
[0137]在一個實施方案中，本申請提供了包含Infestin結構域4(Infestin_4)的FXII抑制劑。在一個實施方案中，FXII抑制劑包含Infestin-4的變體。在另一個實施方案中，FXII抑制劑包含Infestin結構域4以及任選地Infestin結構域1、2和/或3 ;這類蛋白質已知為FXII的強效抑制劑(參見W02008/098720 ;也參見Campos ITN等人577FEBSLett.512-516，2004)。提供了 Infestin-4 的野生型多肽序列(SEQ ID NO:1) ? 如本文中所用的，術語「變體」是指具有胺基酸突變的多肽，其中「突變」被定義為相對於野生型Infestin-4序列的置換、缺失或添加，其中此類變化不改變多肽抑制FXII的功能性能力。術語「變體」包括野生型或突變的Infestin-4序列的片段。下面提供此類變體的進一步實例。
[0138]在一個實施方案中，Infestin-4變體包括野生型Infestin-4序列的N末端氨酸2-13(參見圖2中加以下劃線的序列)，以及所述N末端胺基酸之外的至少一個和多達5個胺基酸突變，所述突變導致與野生型Infestin-4序列的差異，或6個保守性半胱氨酸殘基(參見圖2中以粗體標示的胺基酸)並且與野生型Infestin-4序列有至少70%的同源性。基於相關抑制劑長紅錐蝽(Rhodnius prolixus) (PDB:1TSO)對凝血酶結合的結構數據的分析和SPINK-1對胰凝乳蛋白酶結合的分析，Infestin-4序列的N末端胺基酸2_13對於對FXII的結合可能是非常重要的，這兩種抑制劑共有接觸位點集中在N末端區域的共同特徵,如圖1中顯示的。因此,在一個實施方案中，Infestin-4的變體包含野生型Infestin-4序列的保守性N末端區域胺基酸2-13，以及這些保守性N末端胺基酸之外的至少一個和多達5個胺基酸突變，所述突變導致與野生型Infestin-4序列的差異。突變可以是置換、缺失或添加。如本文中所用，術語「在所述N末端胺基酸之外」是指沿著變體的多肽鏈在除包含序列VRNPCACFRNYV(即來自野生型Infestin-4序列的胺基酸2_13)的胺基酸連續區段外的任何胺基酸。在另一個實施方案中，Infestin-4變體包含6個保守性的半胱氨酸殘基並且與野生型Infestin-4序列具有至少70%的同源性。在一個實施方案中,所述6個保守性半胱氨酸殘基是野生型Infestin-4序列的位置6、8、16、27、31和48處的胺基酸(參見圖2)。在一個實施方案中，變體包含最後的保守性半胱氨酸。在其它實施方案中，半胱氨酸的確切位置和彼此的相對位置可能因Infestin-4變體中的插入或缺失而從位置6、8、16、27、31和48發生改變。然而，在這些實施方案中，Infestin-4變體包含所有6個半胱氨酸並且與野生型 Infestin-4 序列可能共有 70%、75%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同源性。
[0139]在一些實施方案中，Infestin-4變體的特徵在於其抑制FXII。可以例如通過體外和/或體內鑑定(包括測試FXII酶活性的抑制、延長的凝固時間即激活部分促凝血酶原激酶時間(aPTT)的直接測 定或評估凝固的體內方法)來評估抑制FXII的功能活性。Infestin-4變體的其它實例是下文中描述的SPINK-1突變體。
[0140]B.SPINK-1 突變體
[0141]一個實施方案涉及用於人的治療性應用的FXII抑制劑。可使用與Infestin-4具有高度相似性的人蛋白質。例如，與Infestin-4具有最高相似性的人蛋白質是SPINK-1，一種在胰腺中表達的Kazal-型絲氨酸蛋白酶抑制劑(也稱為胰腺分泌型胰蛋白酶抑制劑，PSTI)。Kazal-型絲氨酸蛋白酶抑制劑家族是絲氨酸蛋白酶抑制劑的眾多家族之一。來自不同物種的許多蛋白質已有描述(Laskowski MKato I, 49Ann.Rev.Biochem.593-626，1980)。Infestin-4與SPINK-1之間的胺基酸序列相似性概述於圖2中。
[0142]基於野生型SPINK-1序列(SEQ ID NO: 2)，可產生不同的變體以增加SPINK-1序列與Infestin-4的同源性。短語「增加與Infestin-4的同源性」是指對SPINK-1產生胺基酸突變以使SPINK-1序列更接近Infestin-4序列的方法。
[0143]在一個實施方案中，將SPINK-1突變以包含野生型Infestin-4序列的N末端胺基酸2-13 ;已給出了所述多肽序列並且被稱為Kl (SEQ ID N0:3)。如上所述，Infestin-4序列的N末端部分被認為對於FXII抑制功能是非常重要的。
[0144]因此，在一個實施方案中，突變的SPINK-1的變體還包含野生型Infestin-4序列的N末端胺基酸2-13，以及所述N末端胺基酸之外的至少一個和多達5個胺基酸突變，所述突變導致與野生型SPINK-1序列的差異並且增加變體與野生型Infestin-4序列的同源性。在另一個實施方案中，突變的SPINK-1的變體包含6個保守的半胱氨酸殘基並且與野生型SPINK-1序列具有至少70%的同源性。突變可以是置換、缺失或添加。如上文中定義的，術語「在所述N末端氨酸之外」是指沿著變體多肽鏈除由序列VRNPCACFRNYV (即來自野生型Infestin-4序列的胺基酸2-13)組成的胺基酸連續區段外的任何胺基酸。術語「變體」包括所述突變的SPINK-1序列的片段。在一個實施方案中，所述6個保守的半胱氨酸殘基可以是野生型SPINK-1序列的位置9、16、24、35、38和56處的胺基酸(參見圖2)。在一個實施方案中，變體包含最後的保守半胱氨酸。在另一個實施方案中，半胱氨酸的確切位置和彼此的相對位置可因SPINK-1變體中的插入或缺失而從野生型SPINK-1序列的位置9、16、24、35、38和56發生改變。然而，在這些實施方案中，SPINK-1變體包含所有6個半胱氨酸。在一些實施方案中，SPINK-1變體的特徵也在於其抑制FXII。
[0145]已給出了這樣的SPINK-1變體的實例，被命名為K2和K3(分別地SEQ ID Ν0:4和5)。在SPINK-1變體Κ2和Κ3中，在N末端之外產生進一步胺基酸置換以增加與Infestin-4的同源性，其中變體的特徵也在於它們抑制FXII活性。參見W02008/098720。圖3顯示這類變體的胺基酸序列以及相對SPINK-1野生型序列的改變程度。在SPINK-1變體K3的情況下，產生5個胺基酸置換以增加與Infestin-4的同源性。因此在一些實施方案中，SPINK-1變體與野生型 SPINK-1 序列可能具有 70%、75%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同源性。
[0146]C.其它FXII抑制劑
[0147]在一個實施方案中，給接受醫療操作的患者施用FXII的其它抑制劑。如上所述，術語FXII抑制劑包括FXII和FXIIa 二者的抑制劑。在W02006/066878中，推薦使用抗FXII抗體或FXII抑制劑。具體地，FXII的抑制劑包括抗凝血酶III (AT III)、血管緊張素轉換酶抑制劑、Cl抑制劑，抑肽酶、α-1蛋白酶抑制劑、抗蛋白酶素([(S)-1-羧基-2-苯乙基]_ 氨甲酸基-L-Arg-L- Val-Arginal)、Z-Pro-Pro-醒-二甲基乙酸酯、DX88 (DyaxInc., 300Technology Square, Cambridge, MA02139, USA;ffilliams A 和 Baird LG.2003.DX_88and HAE:a developmental perspective.Transfus Apheresis Sc1.29:255-258中引用的)、亮抑酶肽、脯氨醯寡肽酶的抑制劑例如Fmoc-Ala-Pyr-CN、玉米胰蛋白酶抑制劑(CTI)、牛胰胰蛋白酶抑制劑的突變體、大腸桿菌素、黃鰭金槍魚抗凝血劑蛋白、筍瓜(Cucurbita maxima)胰蛋白酶抑制劑-V包括笑瓜同效抑制劑和Hamadarin (如由Isawa H等人 J.Biol.Chem.277:27651-27658 公開的)和 Pro-Phe-Arg-氯甲基-酮(PCK)。
[0148]FXII抑制劑可以是例如抗體或抗體片段或保持抑制性活性的模擬物，例如美國專利N0.6，613，890中第4至8欄中公開的澱粉樣蛋白前體蛋白的Kunitz蛋白酶抑制劑結構域的類似物。其它適當的抑制劑可以是Isawa H等人277J.Biol.Chem.27651-27658，2002中公開的Hamadarin。適當的玉米胰蛋白酶抑制劑及其產生方法公開於Chen Z等人，65Applied and Environmental Microbiology, 1320-1324，1999 和 Wen L 等人，18PlantMol.Biol.813-814，1992 中。
[0149]在另一個實施方案中，FXII抑制劑可以是結合FXII並且抑制FXII激活和/或活性的抗-FXII抗體。這樣的抗體已在例如W02006/066878和Ravon等人，lBlood4134-43，1995中進行了描述。如上所論述的，「抗-FXII抗體」包括結合併且抑制FXII和FXIIa之一或兩者的抗體。下面更詳細地描述抗-FXII抗體。
[0150]D.連接至增加半衰期的多肽的FXII抑制劑[0151]本申請的另一個方面提供了連接至增加半衰期的多肽(HLEP)的FXII抑制劑。在一個實施方案中，FXII抑制劑是小的蛋白質。因此，預計其會象針對其它小蛋白質所公布的那樣被快速腎清除(Werle M 和 Bernkop-Schnurch A, 30Amino Acids351_367, 2006)。解決多肽化合物血漿半衰期較短的一個方法是反覆地注射其或通過連續輸注進行注射。另一個方法是增加多肽本身的固有血漿半衰期。例如，在一個實施方案中，將FXII抑制劑連接延長半衰期的蛋白質。
[0152]「增加半衰期的多肽」增加FXII抑制劑在患者或動物中的體內半衰期。例如，白蛋白和免疫球蛋白以及其片段或衍生物已被描述為增加半衰期的多肽(HLEP)。Ballance等人(W02001/79271)描述了許多不同治療性多肽的融合多肽，所述治療性多肽當與人血清白蛋白融合時，預測具有增加的體內功能半衰期和延長的貯存期限。
[0153]術語「白蛋白」和「血清白蛋白」包括人白蛋白(HA)及其變體(給出了其完全成熟形式(SEQ ID N0:6))以及來自其它物種的白蛋白及其變體。如本文中所用，「白蛋白」是指白蛋白多肽或胺基酸序列或具有白蛋白的一個或多個功能活性(例如生物活性)的白蛋白變體。如本文中所用，白蛋白能夠穩定或延長FXII抑制劑的治療活性。白蛋白可來源於任何脊椎動物，尤其是任何哺乳動物例如人、猴、牛、綿羊或豬。非哺乳動物白蛋白包括但不限於來自母雞和鮭魚的白蛋白。白蛋白連接的多肽的白蛋白部分可來自與治療性多肽部分不同的動物。關於白蛋白融合蛋白的實例，參見W02008/098720。
[0154]在一個實施方案中，白蛋白變體在長度上為至少10、20、40或至少70個胺基酸，或可包括來自HA序列(SEQ ID N06)的15、20、25、30、50或更多個連續氨酸，或可包括HA的特定結構域的部分或全部。白蛋白變體可包括胺基酸置換、缺失或添加，包括保守或非保守置換，其中此類改變不會顯著地改變賦予所述增加半衰期的多肽的治療活性的活性部位或活性結構域。這類變體可以共有 70%、75%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或99%的同源性。
[0155]在一個實施方案中，白蛋白變體包括片段，並且可由白蛋白的至少一個完整結構域或所述結構域的片段組成或可選擇地包含所述結構域或片段，所述結構域可以是例如結構域 I (SEQ ID N06 的胺基酸 1-194)、2 (SEQ ID N06 的胺基酸 195-387)、3 (SEQ ID N06 的胺基酸 388-585)、1+2 (SEQ ID N06 的 1-387)、2+3 (SEQ ID N06 的 195-585)或 1+3 (SEQ IDN06的胺基酸1-194+SEQ ID N06的胺基酸388-585)。每一個結構域本身由兩個同源的亞結構域即 1-105、120-194、195-291、316-387、388-491 和 512-585 組成，具有包含殘基 Lysl06至Glull9、Glu292至Val315和Glu492至Ala511的柔性亞結構域間接頭區域。
[0156]在另一個實施方案中，在結構或進化上與白蛋白相關的其它蛋白質可用作HLEP，包括但不限於甲胎蛋白(W02005/024044;Beattie 和 Dugaiczyk, 20Gene415_422，1982)、afamin (Lichenstein 等人 269J.Biol.Chem.18149-18154，1994)和維生素 D 結合蛋白(Cooke和David, 76J.Clin.1nvest.2420-2424，1985)。它們的基因代表具有結構和功能相似性的一個多基 因簇，在人、小鼠和大鼠中作圖到同一染色體區域。白蛋白家族成員的結構相似性顯示它們可用作為HLEP。例如，已聲稱甲胎蛋白會延長所連接的治療性多肽的體內半衰期(W02005/024044)。可使用能夠穩定或延長治療活性的此類蛋白質或其變體，並且其可衍生自任何脊椎動物，尤其是任何哺乳動物，例如人、猴、牛、綿羊或豬，或非哺乳動物包括但不限於雞或鮭魚。參見W02008/098720。此類變體在長度上可具有10個或更多個胺基酸，或可包括各自蛋白質序列的約15、20、25、30、50或更多個連續胺基酸，或可包括各自蛋白質的特定結構域的部分或全部。白蛋白家族成員融合蛋白可包括天然存在的多態性變體。
[0157]在另一個實施方案中，免疫球蛋白(Ig)或其變體可用作HLEP，其中變體包括片段。在一個實施方案中，使用免疫球蛋白恆定區的Fe結構域或部分。恆定區可以是IgM、IgG、IgD、IgA或IgE免疫球蛋白的恆定區。治療性多肽部分通過抗體的鉸鏈區或肽接頭連接至Ig，其中所述肽接頭可以是能切割的。幾項專利和專利申請描述了治療性蛋白質與免疫球蛋白恆定區的融合以延長治療性蛋白質的體內半衰期(US2004/0087778、W02005/001025, W02005/063808, W02003/076567, W02005/000892, W02004/101740,US6, 403，077)。例如，細胞因子IFN-β與Fe融合獲得了增強的IFN-β生物活性，延長的循環半衰期和更大的溶解度(W02006/000448)。
[0158]因此，另一個實施方案是使用此類免疫球蛋白序列(例如免疫球蛋白的Fe片段及其變體)作為HLEP。可將FXII抑制劑與免疫球蛋白恆定區的Fe結構域或至少部分(作為HLEP)融合，並且可將其在原核或真核宿主細胞例如細菌、酵母、植物、動物(包括昆蟲)或人細胞系中或在轉基因動物(W02008/098720)中作為重組分子產生。SPINK_K2_Fc融合蛋白示例性地示於SEQ ID N0:7中。
[0159]E.接頭
[0160]在一個實施方案中，可在治療性多肽與HLEP之間引入間插肽接頭。在一個實施方案中，引入可切割的接頭，特別地如果HLEP通過例如位阻幹擾治療性多肽的特異性活性時。在某些實施方案中，接頭通過酶例如內源性、外源性或共同的凝血途徑的凝血蛋白酶切害I]。內源性途徑的凝血蛋白酶是接觸活化途徑中的蛋白酶，包括例如FXIIa、FXIa或FIXa。在一個實施方案中，接頭由FXIIa切割。外源性途徑的蛋白酶包括組織因子途徑中的蛋白酶例如FVIIa。共同途徑的蛋白酶包括參與血纖蛋白原向血纖蛋白轉化的蛋白酶，例如FXa、FIIa 和 FXIIIa0
[0161]F.治療性製劑和施用
[0162]FXII抑制劑或其變體可具有高於80%或高於95%、96%、97%、98%或99%純度的純度。在一個實施方案中，變體可具有相對於汙染性大分子例如其它蛋白質和核酸而言大於99.9%純度的藥物純狀態，以及不含感染因子和熱源。
[0163]可將純化的FXII抑制劑溶解在常規生理相容性含水緩衝液中，任選地可向其中添加藥物賦形劑以提供用於治療患者的SBI的藥物製劑。此類藥物載體和賦形劑以及適當的藥物配方在本領域是公知的。參見例如Kibbe等人Handbook of PharmaceuticalExcipients,(第3版，Pharmaceutical Press), 2000。可以以冷凍乾燥或穩定的可溶形式配製藥物組合物。可利用本領域已知的多種方法冷凍乾燥多肽。凍幹的製劑可在使用前通過添加一種或多種藥學上可接受的稀釋劑例如注射用無菌水或無菌生理鹽水溶液來進行重建。
[0164]可利用任何藥學上適當的施用工具將FXII抑制劑的製劑遞送至患者。各種遞送系統是已知的並且可用於通過任何方便的途徑施用組合物。組合物可全身性例如通過胃腸外途徑施用。如本文中所用，「胃腸外」包括皮下、靜脈內、肌內、動脈內和氣管內注射、滴注、噴霧施用和輸注技術。胃腸外製劑可按照已知的方法，通過靜脈內途徑以單次快速推射(bolus)的形式或以持續輸注(constant infusion)的形式施用或通過皮下途徑施用。對於胃腸外使用公知的脂質載體包括無菌水、鹽水、含水葡萄糖、糖溶液、乙醇、二醇類和油。對於全身性使用，可配製治療性蛋白質以用於靜脈內管線(intravenous line)或動脈管線(intravenous line)使用。可通過輸注連續地或通過單次快速推注施用製劑。一些製劑包含緩釋系統。在一個實施方案中，以貼劑方式施用製劑。用於口服施用的片劑和膠囊可包含常規賦形劑例如粘合劑、填料、潤滑劑或溼潤劑等。口服液體製劑可以以含水或油性懸浮液、溶液、乳劑、糖漿劑、酏劑等形式存在，或可以以無水產品(使用時利用水或其它適當的載體重建)形式提供。適當的液體製劑可包含常規添加劑例如懸浮劑、乳化劑、非水性載體和防腐劑。[0165]FXII抑制劑的劑量可取決於許多因素，例如適應症、製劑或施用模式，並且對於各適應症，可在臨床前試驗和臨床試驗中進行確定。可在醫療操作之前、期間和/或之後施用FXII抑制劑的劑量。在一個實施方案中，可在醫療操作之前和/或之後1、2、4、6、12、24、48、72或96小時內施用FXII抑制劑。可在醫療操作之前、期間和/或之後，以單次劑量或以多次劑量或以0.25,0.5、1、2、4、6、12、24、或48小時的間隔反覆施用FXII抑制劑。由於具有不增加出血風險的有利性質，因此在一個實施方案中，在操作期間施用FXII抑制劑。可單獨地或與其它治療劑組合地施用藥物組合物。這些藥劑可共配製，或可將其作為單獨的製劑同時或分開地、通過相同或不同的施用途徑施用。FXII抑制劑的施用方案或劑量還可在具有相同適應症或不同適應症的患者個體間變化，這取決於例如其它治療狀況或療法等因素。
[0166]IV.SBI的動物模型
[0167]本申請的一個方面涉及缺血的動物模型，該模型模擬可在至少一個目標器官中導致缺血性損傷的栓塞物的異質機制和來源。在一個實施方案中，動物模型包括操作，其中操作包括將至少一個栓塞物釋放在動物的動脈系統中，這可導致至少一個目標器官的缺血性損傷，其中所述目標器官是腦、心臟、腎、肝和/或胃腸道器官(包括食管、胃、小腸和/或大腸(包括結腸和/或直腸)，和此外，如果目標器官是腦，則其中缺血性損傷表徵為臨床上無症狀和/或栓塞物是非血栓可溶解性的。在一個實施方案中，目標器官是腦。在一個實施方案中，評價動物中臨床上無症狀的腦內缺血性損傷的指徵。在某些實施方案中，動物也接受治療劑候選物來測試治療劑候選物減少目標器官內缺血性損傷的能力。術語「臨床上無症狀的」是如上定義的。在該實施方案中，臨床上評估小鼠以評價腦中的缺血性損傷是否是「臨床上無症狀的」，即評估動物中與中風相關的急性、明顯的行為或運動缺陷。中風的指標包括但不限於運動障礙、昏睡、緊握(grip)、四肢無力、眼瞼下垂、步態障礙(gaitdisturbance)、轉圈和打滾(rolling)。在施用栓塞物後不顯示中風樣症狀的動物可能在腦中具有臨床上無症狀的缺血性損傷。
[0168]動物模型還包括評估動物腦內的缺血性損傷的指徵。在一個實施方案中，評估包括成像。通過評價腦的圖像，缺血性損傷的「指徵」對於本領域技術人員來說是明顯的。例如，導致組織損害的缺血性損傷在腦圖像上明顯地表現為組織外觀的物理變化，或表現為腦區域中或周圍的炎症、凝血或水腫。例如，彌散加權磁共振成像(DWI)可用於使缺血性損傷可視化，因為分子的擴散在受傷組織中和周圍不同。
[0169]動物模型被認為是非治療性模型，即其是用於評價栓塞物的臨床影響的研究工具。在該模型中，在動物中有意地釋放栓塞物，意在引起缺血，如果不採取其它步驟的話，這樣的栓塞物將產生缺血性損傷。換句話說，動物的健康和身體狀況未被操作改善，從而其不能被認為是治療性的，也不能被認為是有益的手術操作。在評價過程中或在評價結束時處死動物。然而，在一個實施方案中，動物模型可用於評價治療劑候選物治療缺血的效力。在這類實施方案中，雖然治療性候選物可能在動物模型中具有治療性結果，但只是治療性候選物而非動物模型被認為是治療性的。 [0170]A.動物
[0171]動物模型的特徵還在於所述動物可以是哺乳動物，包括但不限於小鼠、大鼠、兔、貓、狗、豬或猴。例如，動物可以是小鼠或大鼠。動物可以是雄性的或雌性的以及可以是任何年齡。可使用的鼠品系的實例包括但不限於BALB/c、C57/BL6、C57/CL10J、CBA/J、DBA/J、FVB/J、C3H/HeJ、A/J、AKR/J、129Sl/SvImJ、129Xl/SvJ、N0D、SJL、TALLYJ0/JngJ、MRL、NZW、亞系和雜交系。可使用的大鼠品系的實例包括但不限於⑶、Wistar、Fisher、Sprague Dawley、BBDP> Long-Evans> Zucker> Hairless 大鼠以及亞系和雜交系。
[0172]在一個實施方案中，所述動物或動物模型是被修飾的，例如經遺傳修飾的動物或已以另一種方式例如通過操作或物質的施用改變的動物。遺傳修飾動物可具有敲除或敲入的基因，或條件化敲除或敲入的基因。所述動物的特徵還可以在於其可用作另一種疾病的模型。例如，動物可因遺傳背景或者因接受誘導疾病或改變的病況(例如自身免疫疾病，例如在NOD小鼠中，或在MOG誘導的EAE中)的藥劑或操作而對另一種疾病易感。使用動物模型在這樣的修飾狀態或疾病背景中研究SBI也可能會令人感興趣。
[0173]B.栓塞物
[0174]在一個實施方案中，給動物施用非血栓可溶解性栓塞物以模擬至少一個可在醫療操作期間被引入的栓塞物。如本文中所用，術語「非血栓可溶解性的」是指不被溶栓性藥物溶解的栓塞物(即栓塞物不由血液組成)。在此類實施方案中，操作釋放並不是血栓的栓塞物。非血栓可溶解性栓塞物的實例包括但不限於氣泡、油、脂肪、膽固醇和/或碎片，因為這類栓塞物不被溶栓藥物溶解。
[0175]在一個實施方案中，栓塞物是模擬成像技術例如超聲中使用的造影劑的微泡溶液。因此腦中的毛細血管和小動脈可以以彌散狀分布而非局灶狀分布的方式被阻塞。
[0176]在一個實施方案中，將微珠粒用於模擬不可溶解的栓塞物，其特徵在於施用不導致明顯的中風樣症狀。術語「微珠粒」包括微球體和其它微粒(例如在形狀上不是均一球狀的微粒)。在一個實施方案中，將微珠粒用於模擬非血栓可溶解性栓塞物。微珠粒的尺寸可以是例如20-200 μ m、25-100ym或30-50μπι的任何尺寸。施用的微珠粒的量可以是 500 或 1000 或 2000 個微珠粒，包括 500-600、500-700、500-800、500-900、500-1000 以及500-2000個微珠粒的任何量。取決於動物的尺寸、微珠粒的類型和尺寸以及其它實驗因素，微珠粒的數目可變化。微珠粒可由天然或合成材料製成，包括但不限於聚苯乙烯、聚乙烯或其它聚合物、膠乳、玻璃、陶瓷、金屬、量子點或順磁性材料。在一個實施方案中，微珠粒是螢光劑，其可允許示蹤栓塞物材料。螢光染料包括但不限於香豆素、螢光素、羅丹明或藻紅蛋白或者其綴合物。微珠粒可以被內部染色或綴合至螢光染料。使用微珠粒進行施用的一個有利方面是它們容易被標準化，其中微珠粒的尺寸和量可被定量並且施用的量可在多個動物間保持恆定。[0177]在另一個實施方案中，將栓塞物給動物施用，其中栓塞物包括凝固血液。使用一些技術例如組織勻漿或超聲處理可將凝固血液減小成小碎片。凝固血液的來源可來自接受施用的相同動物或來自相同品系或物種的動物或者來自與接受所述施用的動物不同的品系或物種的動物的血液。凝血可使用已知的凝血劑例如CaCl2、凝血酶或人凝血酶來誘導。在一個實施方案中，例如通過使用造影劑或血池劑(blood pool agent)例如近紅外線血池劑來使血液凝固血液產生螢光。
[0178]在另一個實施方案中，使用導管在動物的動脈系統中釋放栓塞物。在另一個實施方案中，栓塞物因包括夾閉和/或手術的原因而被釋放在動物的動脈系統中。
[0179]C.操作
[0180]在一個實施方案中，將至少一個栓塞物注射進入動物的動脈系統。可將栓塞物注射進入任何動脈，包括主動脈、主 動脈弓、頸動脈、冠狀動脈、頭臂動脈、脊椎基底動脈循環、顱內動脈、腎動脈、肝動脈、腸繫膜動脈和/或心臟顱側的動脈系統的血管。
[0181]在一個實施方案中，將栓塞物注射進入頸動脈。在一個實施方案中，夾閉動脈。在某些實施方案中，環繞動脈例如頸動脈進行短暫結紮。在一個實施方案中，栓塞物可通過心內注射進行施用，但該方法具有嚴重的不利方面。在該實施方案中，栓塞物遍布整個動物，使得標準化更加困難，因為不清楚有多少栓塞物在腦中留存。此外，這種操作的死亡率很高，並且可能不清楚注射是否成功。在某些情況下，心內注射可能對於評價針對目標器官例如心臟、腎、肝和/或胃腸道器官包括食管、胃、小腸和/或大腸(包括結腸和/或直腸)的缺血是有用的。
[0182]在一個實施方案中，將管或導管用於施用栓塞物。導管可以是動脈導管。導管可由聚乙烯、聚氨酯或其它聚合物或材料製造。導管可具有適於注射的位置和動物尺寸的尺寸。導管可被改造來幫助栓塞物的注射，例如，可通過拉伸管道以手工獲得適用於小型實驗室動物的更窄、更細或更尖的導管來改造導管。在一個實施方案中，使用注射針，其中本領域技術人員可技術性地將栓塞物注射進入動物的動脈系統。
[0183]D.評價
[0184]在一些實施方案中，動物模型包括評價步驟。評價可包括體內或離體技術，例如成像和/或組織學技術。成像技術包括但不限於放射學或核醫學，例如CT，包括SPECT-CT和/或FMT-CT ;MRI，包括彌散加權磁共振成像(DWI)或fMRI ；PET ;光學成像，例如螢光反射成像；超聲、顯微鏡檢查、螢光檢查、放射自顯影術和/或磷成像。可進行組織學和/或染色技術，例如TTC染色、免疫組織化學和/或組織化學。
[0185]在一個實施方案中，可將動物模型與分子成像技術一起用於評價生理過程。例如炎症、血液凝固或可因栓塞物的釋放而發生的補體活化。例如，參與目標生理學過程的分子可利用適合於成像模式的造影劑、放射性同位素或染料來標記。用於各種成像模式的染料和造影劑在上文中進行了描述，並且對於本領域技術人員來說是公知的。參見例如，PyszMA 等人 65Clinical Radiology500-516, 2010。
[0186]E.治療劑候選物
[0187]在另一個實施方案中，動物模型可用於評價治療SBI的治療劑候選物。如短語「測試治療劑候選物的減少腦中缺血性損傷的能力」中所用的，術語「減少……的能力」意欲理解為被測試的任何治療劑候選物，其中測試治療劑候選物的目的是評價其是否可減少缺血性損傷，即治療劑候選物是否可限制或治療SBI。因此，可在SBI的動物模型中施用測試治療劑候選物，評價其減少腦中缺血性損傷的能力。評價可顯示治療劑候選物減少、增加腦內缺血性損傷或與所述腦內缺血性損傷相關的病況的量或不導致改變。
[0188]在一個實施方案中，在進行操作之前、期間和/或之後給動物施用治療劑候選物。可以在整個測試過程中進行一次或多次評價。例如，可在進行操作或治療劑候選物的施用之前、期間和/或之後進行體內成像。對照可包括不接受治療劑候選物的動物，或可包括在進行操作或施用治療劑候選物之前和之後給動物成像。
[0189]在動物模型的一個實施方案中，可在進行操作之前、期間和/或之後1、2、4、6、12、24、48、72或96小時或更長時間內施用治療劑候選物。可在進行操作之前、期間和/或之後以單次劑量或以多份劑量施用，或以0.25、0.5、1、2、4、6、12、24或48小時或更長時間的間隔反覆施用治療劑候選物。在一個實施方案中，治療劑候選物是FXII抑制劑。由於不增加出血風險的有利性質，可在進行操作期間和/或之前和/或之後施用FXII抑制劑。治療劑候選物的劑量可取決於治療劑候選物的性質，例如半衰期或毒性，或可取決於使用的動物的類型或尺寸，或所使用動物的狀況，並且可能需要憑經驗來確定。例如，在一個實施方案中，FXII 抑制劑的劑量為 lmg/kg、50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg、500mg/kg、lOOOmg/kg 或l-1000mg/kg或50-500mg/kg、或100-200mg/kg。可通過用於給動物施用治療劑候選物的任何方法來將治療劑候選物的劑量施用給動物。在一個實施方案中，全身性施用治療劑候選物。在一個實施方案中，通過靜脈內尾靜脈注射施用治療劑候選物。
[0190]在一個實施方案中，治療劑候選物是抗體。抗體可以以全長Ig、Fab、F(ab)2、Fv、scFv或其它形式或其變體的形式存在。抗體可以是單克隆或多克隆的。抗體的特徵可在於同種型是IgM、IgD、IgA、IgG或IgE或其變體。抗體可來自哺乳動物物種，包括但不限於人、小鼠、大鼠、兔、山羊、倉鼠或猴。抗體可以是人源化的或CDR-移植的。抗體可被突變或修飾以改變免疫原性、半衰期或賦予與治療性抗體相關的其它有利性質。在一個實施方案中，抗體抑制參與SBI的病理生理學的分子。在一個`實施方案中，抗體是抗-FXII抗體。在該實施方案中，抗體可結合FXII (其中，「FXII 」包括FXII和FXIIa)的重鏈或輕鏈上的表位，例如中和性表位。抗體對於與FXII的結合可以是高親和力和/或高親合性的。抗體可具有能夠識別超過一個抗原的能力。抗體可綴合至多肽、核酸或小分子。
[0191]在另一個實施方案中，治療劑是蛋白質、肽、核酸或小分子。術語「小分子」是指低分子量化合物。小分子可以例如低於1000道爾頓，從而允許擴散穿過細胞膜。小分子的特徵可以在於其以高親和力結合凝血途徑的分子或FXII或參與SBI的病理生理學的分子。優選小分子是可從GI道再吸收的小分子。
[0192]通過下列不應當解釋為限制性的實施例來進一步舉例說明各實施方案。根據所公開的實施方案的說明書和實踐，其它實施方案對於本領域技術人員來說是顯而易見的。本申請中通篇引用的所有參考資料、專利和公布的專利申請的內容通過引用併入本文。
實施例
[0193]實施例1:1nfestin_4 和 rHA-1nfestin-4 的產生
[0194]合成Infestin-4的互補DNA序列，並且在其5』位置延伸接頭(Gly-Gly-Ser)3的編碼序列，隨後插入 pIRESpuro3 (BD Biosciences, Heidelberg, Germany)的 BamHl 和NotI 位點。利用正向引物 5-GCGGCTAGCATGAAGTGGGTAACCTTTATTTCCC-3(SEQ ID NO:8)和反向引物 5-GCGGGATCCTCCTAAGCCTAAGGCAGCTTGACTTG-3 (SEQ ID NO: 9)，通過 PCR 擴增白蛋白互補DNA。利用NheI和BamHl消化擴增子，將其插入Infestin-4載體的Nhel/BamHl位點。將所得的能夠表達由白蛋白-接頭Infestin-4(rHA-1nfestin-4)組成的融合蛋白的載體在大腸桿菌(Escherichia coli) TOPlO (Invitrogen, Karlsruhe, Germany)中擴增，使用標準方案(Qiagen, Hilden, Germany)進行純化。利用Lipofectamine2000試劑(Invitrogen)轉染HEK-293細胞，將所述細胞在4 μ g/mL嘌呤黴素存在的情況下於無血清培養基(Invitrogen293Express)中生長。將轉染的細胞群體在發酵罐中生長。收集上清液用於純化所產生的融合蛋白。通過免疫親和層析純化rHA-1nfestin-4。將發酵上清液過平衡的抗-白蛋白柱。利用甘氨酸緩衝液(PH2.5)洗脫產物。參見W02008/098720 ；HagedornI 等人 117Circulationll53-1160, 2010。 [0195]產生(His)6-標記的Infestin-4 構建體，發現其與 rHA-1nfestin-4構建體相比較具有更短的半衰期。參見W02008/098720 ；Hagedorn I等人117Circulationll53-1160, 2010。在POROS MC20上通過銅金屬螯合層析純化(His)6-標記的Infestin-4。將發酵上清液過加載有硫酸銅的柱子,利用磷酸鹽-氯化鈉緩衝液(pH7.7)進行平衡。隨後在咪唑梯度中洗脫(His)6-標記的Infestin-4。
[0196]實施例2: SBI的動物模型
[0197]本申請提供了反映導致SBI的異質性機理的現實動物模型。在動物模型的一個實施方案中，可利用微珠粒誘導缺血性損傷，所述微珠粒模擬可因例如血管操作和手術造成的非血栓可溶解性栓塞物例如空氣或脂肪。在動物模型的另一個實施方案中，缺血性損傷可以由可能因凝血級聯的擾亂或血管壁損傷而引起的凝固血液所誘導。
[0198]全部實驗在獲自Charles River Laboratories, Inc.(Wilmington, MA)的成年Balb/c小鼠(25-30g ;n=24)中進行。機構倫理委員會批准了全部動物實驗。在進行操作期間和之後在生理學上監測動物。在異氟烷室中通過以2L/分鐘吸入補充氧來利用2%異氟烷麻醉小鼠，隨後將其以仰臥位轉移至溫暖的加熱墊上，同時保持在異氟烷下。使用下述操作，將微珠粒或離體形成的凝固血液在一側逆行性地通過頸外動脈注射進入頸內動脈，同時短暫結紮頸總動脈以迫使栓塞物進入腦的動脈系統而不減弱灌注。
[0199]A.操作
[0200]在麻醉動物後，剃除頸部毛髮，施加奈爾脫毛膏(Nair)以使完全除去毛髮。隨後用異丙醇擦拭頸部，利用滅菌紗布覆蓋頸部。對頸部產生縱形切口，將暴露的腮腺移至一旁。鑑別和分離頸總動脈、頸內動脈和頸外動脈。IO-OEthicon尼龍縫線(Johnson&Johnson, Brussels, Belgium)用於所有動脈結紮術。將兩根10-0縫線環繞頸外動脈系縛,一根環繞頸內動脈，一根環繞頸總動脈。隨後將環繞頸外動脈的兩根縫線打結，隨後在其間切割動脈。此時，對照組中的小鼠(其僅接受頸外動脈的結紮)不進行進一步幹預以確保操作的該部分不會導致任何腦損傷。隨後將環繞頸總動脈和頸內動脈打結，進行短暫結紮。將改進的 Intramedic 聚乙烯 PElO 導管(1.D.0.28mm, 1.D.0.61mm, Becton Dickinson andCompany, Sparks, MD)插入頸外動脈的近端開口端，隨後原位縫合。導管是標準PElO導管，其通過輕輕施加牽引力和手工拉伸管(以獲得略微更窄的腔和直徑)來進行改進。隨後釋放頸內動脈上的結紮，從而允許僅流至頸內動脈進入供應腦的動脈系統。觀察到動脈血嚮導管的閃回(Flashback)，隨後注射製備的微珠粒或凝固的血液(圖4)。
[0201]對於螢光珠粒，已測定約500個珠粒的頸內動脈注射會導致可重現的臨床上無症狀的微小病變。將裝載有約500個Fluoresbrite? Plain YG45微球體(Polysciences, Inc., Warrington, PA,直徑 42.58±0.8 μ m,最大激發=441nm,最大發射=486nm)的注射器連接至導管，進行注射(圖4A+D)。
[0202]對於螢光凝固血液，經心臟穿刺從供體小鼠抽取500 μ L的新鮮異源小鼠血液，隨後立即添加至檸檬酸鈉溶液以進行初始抗凝(終濃度，0.32%)。將20μπιΟ1 CaCl2添加
至血漿，隨後添加10個單位的高活性人凝血酶以誘導凝血(Calbiochem?, emd Chemicals, Inc., Darmstadt, Germany, MW37, 000, 100 單位 /ml,,比活性 2800NIH 單位 /mg 蛋白質)。讓血液在室溫凝固I小時後，添加2nmol Genhance680TM(一種近紅外血池劑)(VisEnMedical, Bedford, MA)以在4°C溫育72小時。這允許對凝固血液進行螢光染色以備通過螢光成像進行隨後的離體檢測。該時間段允許凝固血液收縮和穩定化。當準備使用時，取下凝固血液，利用生理鹽水進行洗滌。將250 μ L生理鹽水添加至凝固的血液，隨後使用組織勻漿器將凝固血液減小成小顆粒(圖4Β)。隨後將10 μ L的該螢光微栓塞物溶液抽入注射器，進行注射。
[0203]在注射微珠粒或凝固血液後，取出導管，拉緊一直原位保持導管的縫線以封閉頸外動脈。隨後重新打開頸內動脈和頸總動脈上的結紮以恢復至腦的血流，將腮腺復位，用7-0尼龍縫線縫合皮膚。將動物送回其籠內，讓其恢復。
[0204]在從麻醉恢復後，評估小鼠的明顯行為和運動缺陷。觀察每一隻動物的運動障礙、昏睡、握緊、四肢無力、眼瞼下垂、步態障礙、打圈和打滾。觀察到任何上述症狀被認為是中風的標誌，而缺乏上述症狀表示未發生明顯的中風，與SBI的可能性一致。如果不存在中風症狀，則將小鼠用於SBI的進一步評價。否則排除小鼠用於SBI的進一步評價並且將其處死。
[0205]B.處理組
[0206]在優化SBI模型後，研究4個組群(η=5-7/組):利用凝固血液或微珠粒誘導SBI的小鼠(未處理的對照)，和其中利用200mg/kg劑量的rHA-1nfestin-4經靜脈內尾靜脈注射處理小鼠的另外兩個組。小鼠在SBI誘導後立即接受它們的第一次注射。在SBI後3小時進行FXIII活性的單光子發射計算機斷層攝影術-計算機斷層攝影術(SPECT-CT)成像。在SBI後3天利用MRI成像的組群每天接受注射，直至並且包括損傷後第3天。SBI後3天評估氯化三苯基四唑「(TTC)染色。
[0207]C.MRI
[0208]利用MRI (髓過氧化物酶(MPO) -Gd,第3天)評估炎症。使用Bruker4.7T掃描儀，通過RARE Tl 掃描(TR: 1500ms, TE:8.48ms, Avg:8,矩陣(Matrix): 192x192x22，體素(VoxelSize):0.133mm x0.13mm x0.5mm)、具有相同幾何形狀(TR:5622.893, TE:20ms, Avg:4)的RARE T2和使用EPI擴散加權順序，利用6個擴散方向的彌散加權成像(DWI)(TR: 4800ms, TE:32ms,矩陣:128x128x22，體素:0.195mm x0.195mm x0.5mm)進行 MRI。
[0209]在靜脈內施用0.3mmol/kg於10%DMS0中稀釋的髓過氧化物酶-釓造影劑之前掃描小鼠以及在所述施用後每15分鐘(直至90分鐘)掃描小鼠。隨後處死小鼠，灌注小鼠，收集腦，切片以在0V-100顯微鏡(Olympus)上進行螢光成像來驗證SBI存在。[0210]為了進行數據分析，使用Amira軟體(Visage Imaging, San Diego, CA)。在注射Tl掃描後90分鐘的每一張圖像切面上鑑定到目標區域(ROI)。在MPO陽性區域的自動化分割之前單個地排除腦室，由委員會認證的放射科醫生確定該分割。利用為平均正常腦本底信號1.25倍的信號強度自動地鑑定MPO陽性體素。將信號幅值除以來自小鼠體外的ROI的噪聲的標準差來計算MPO陽性體素的對比噪聲比(CNR)。以相似的方式分割T2圖像以進行3D顯影。
[0211]D.SPECT-CT
[0212]利用SPECT-CT(FXII1-1nd, 3小時)評估凝血。各組小鼠在注射約ImCi的用銦-111標記的FXII1-底物肽(實際注射量為731-1273 μ Ci)之前I小時經歷SBI誘導和處理。注射後2小時，使用Gamma Medica-1deas X-SPECT小型動物成像系統進行SPECT-CT。使用錐形束(50kVp，500mA) X射線管，利用固態CMOS檢測器對256個投影進行CT掃描。使用改良的費爾德坎普重建算法(modified feldkamp reconstruction algorithm)重建這些投影。SPECT掃描使用具有以90s/投影通過64個投影(每一個照相機32個投影)的Imm中等能量針孔貓準器的雙Y照相機。使用有序亞組期望最大算法(ordered subsetsexpectation maximization algorithm, 0SEM)重建 SPECT 圖像，將其與 CT 圖相融合以進行分子信息的準確解剖學共定位。
[0213]在SPECT-CT成像後立即處死動物，採集血液樣品。利用20ml鹽水灌注動物。採集肌肉樣品；切取腦，連同血液樣品一起，在Wallac Wizardl480 Y進式計數器進行計數。隨後將腦切成2mm的切片,在Olympus Biosystems 0V-100突光掃描儀上進行成像。將腦切片的兩側進行成像。隨後，將切片置於磷屏成像儀(phosphorimager)板上過夜以進行放射自顯影。在Molecular Dynamics Typhoon磷屏成像儀平板讀數器上對板讀數。
[0214]為了進行SPECT-CT數據分析，使用Amira軟體手工地從CT圖像分割腦和肌肉，以計算腦對肌肉的目標本底比值(TBR)。將數據針對腦的質量和每隻動物的注射劑量進行標準化。對放射自顯影·、Y計數和SPECT數據進行衰減修正。使用Osirix軟體(Pixmeo, Geneva, Switzerland)重建 SPECT-CT 數據的 3D 可視化顯影。
[0215]E.離體評估
[0216]在MRI和SPECT-CT成像研究完成後，處死動物，取出腦。
[0217]如果小鼠是SPECT-CT亞組的部分，則首先通過閃爍計數測量腦的總放射活性。隨後使用小鼠腦切片機(Zivic Instruments, Pittsburgh, PA)將新鮮腦切成2mm厚的冠狀縫切片。隨後立即用0V-100?小型動物成像系統(Olympus，Center Valley, PA)(平面反射螢光成像系統與高倍顯微鏡的混合體)對全部腦進行成像。腦切片使用亮視野來成像，GFP螢光通道(激發400nm，發射508nm)用於微珠粒，近紅外線通道用於螢光凝固血液(發射680nm)，使用達到16倍的放大倍數。取決於選擇的解析度、波長和放大倍數，圖像採集時間在每圖像幀5ms與60秒之間的範圍內。也使用數位相機獲得白光圖像以評估由損傷引起的潛在出血。對於SPECT-CT研究中的小鼠，則將腦切片置於磷屏成像儀上進行過夜。
[0218]如果小鼠為MRI亞組的部分，則將腦切片置於PBS中的1%TTC溶液中，在37°C進行30分鐘。隨後用PBS洗滌腦切片3次，每次I分鐘。隨後使用數位相機(Olympus FE-280)對腦成像以評估TTC染色。活的腦組織被TTC染成紅色，而梗死區域不染色。對於用於免疫組織化學(IHC)的小鼠，中央腦切片被TTC染色，而鄰近切片被包埋用於IHC。[0219]為了進行進一步組織學分析，將腦組織的相鄰切片包埋在0.C.T.化合物(Sakura Finetek, Torrance, CA)中，切取一系列5μηι的冷凍切片。將抗生物素蛋白-生物素過氧化物酶法用於IHC，利用FXIII抗體:C-20 (Santa CruzBiotechnology, Inc., Santa Cruz, CA)，隨後利用生物素化的抗-山羊 IgG 二抗(VectorLaboratories, Inc., Burlingame, CA)溫育組織切片。利用 3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)底物(DakoCytomation, Carpinteria, CA)使反應可視化，利用Harris蘇木素溶液對所有切片進行復染色。將載片在400倍放大率下自動地進行數位化,使用NanozoomerHTl.0 (Hamamatsu, Japan)捕獲圖像。
[0220]結果表達為平均值+SEM。利用Student’s t檢驗評價兩個組之間的統計學比較，利用ANOVA進行修正以進行多重比較。p〈0.05的值被認為表示統計顯著性。在給出P值的整個實施例中使用相同的統計學分析。
[0221]兩個模型都產生了可導致臨床上無症狀的腦缺血症(圖5)的小血管內腦血管閉塞(圖 4D+E)。
[0222]如TTC染色所評估的，兩個模型都產生佔總腦(如通過TTC染色評估的)不到5%的小梗死(圖5)。微珠粒法相較於凝固血液模型產生略微更多的組織損害。主要在注射側觀察到病損。
[0223]實施例3:利用 rHA-1nfestin-4 治療 SBI
[0224]在用rHA-1nfestin-4處理後，兩個SBI模型中的小鼠都經歷顯著更少的微梗死，梗死減少超過50% (如通過TTC染色檢測到的)。相較於微珠粒模型的梗死面積(54%的減少，圖5A)，在凝固血液模型中梗死面積(66%的減少，圖5B)減少略微更多。微珠粒模型模擬來自不直接影響凝血途徑的 物質的栓塞物；然而rHA-1nfestin-4也減少該模型內的梗死面積。
[0225]在兩個SBI模型中都發現微出血的相對頻繁的證據，在微珠粒模型中有6/8(75%)的小鼠，在血栓栓塞模型中有5/9(56%)的小鼠(圖6)。然而，在施用rHA-1nfestin-4後，在兩個模型中都未發現增加頻率的微出血。事實上，在凝固血液模型中可能存在降低的微出血率(只有1/8的動物具有微出血，圖6，右下)。
[0226]有趣地，與先前對中風的研究(Kleinschnitz C等人，J ExpMed.，203:513-518, 2006 ；Hagedorn I 等人 Circulation, 121:1510-1517，2010)類似，在SBI中也未發現增加的出血頻率，在rHA-1nfestin-4處理後，在凝固血液模型中具有更低的出血率。雖然該更低的比率需要被確認和進一步研究，但其表明rHA-1nfestin-4可能減少由凝固血液引起的血管損傷。此外，其具有臨床相關性，因為由於一般抗凝療法通常具有增加的出血風險，所以其意味著對於不期望副作用的有利模式。在我們目前研究中情況並非如此。
[0227]實施例4:rHA-1nfestin-4 減弱 SBI 中 FXIII 活性
[0228]為了評估rHA-1nfestin-4對凝血級聯的影響，評價FXIII的活性，所述FXIII的活性位於FXII的下遊並且受其影響，負責交聯血纖蛋白凝塊。在SBI誘導後的急性期過程中使用FXIII特異性探針FXII1-1nd進行體內SPECT-CT成像(Tung CH等人4Chembiochem.897-899，2003 ；Nahrendorf M 等人 113Circulationl 196-1202，2006)。在凝固血液(圖7)和微珠粒(圖8)模型中，在rHA-1nfestin-4施用後，FXIII活性的量顯著下降。對離體腦樣本的放射自顯影實驗(圖7和8，中間圖框)確認了這一點。FXIII活性減少的總體程度良好地顯現在3D融合圖像(圖7和8，左圖框)上。與梗死減少的程度相似，相較於微珠粒模型，在凝固血液模型中存在更顯著的FXIII活性降低。體內成像結果通過FXIII的免疫組織化學染色得到確認(圖9)。
[0229]有趣地指出，微珠型模型引起了升高的因子XIII/凝血活性，其可通過施用rHA-1nfestin-4來降低。這表明微珠粒栓塞物形成引起血纖蛋白凝塊形成，並且因組織損傷而誘導繼發性凝血，這可引起受累血管的進一步損害和阻塞。事實上，我們在組織病理學上發現，在未處理的對照小鼠的受損腦區域中存在增加的FXIII含量(圖9)。有趣地，相較於凝固血液模型，微珠粒模型導致更多的損傷和出血面積。可推測微珠粒模型大致上是永久性模型，其加重了病理效應，而注射的凝固血液可經歷(部分)溶栓，從而導致不太嚴重的結果。然而，在兩個模型中觀察到的這種繼發性凝塊形成能夠被rHA-1nfestin-4顯著減少，從而限制所使用的栓塞物質的損害。
[0230]實施例5:rHA-1nfestin-4在SBI後不改變腦內髓過氧化酶活性
[0231]髓過氧化物酶(MPO)是在炎症過程中由許多促炎性髓樣細胞例如中性粒細胞、Ly6Chi單核細胞和活化巨噬細胞與小神經膠質細胞的亞組分泌的最豐富的酶，因此是炎症反應的適當的成像生物標誌物。為了評估MPO活性，在SBI後3天，使用探針MPO-Gd(ChenJff 等人 240Radiology473-481, 2006 ；Querol M 等人 40rg Biomol Chem.1887-1895, 2006)進行體內MRI，所述探針對於MPO活性是高度特異性的和靈敏性的(Rodriguez E等人132J.Am.Chem.Soc.168-177，2010 ；Ronald JA 等人 120Circulation592-599, 2009 ；Chen JW等人131Brainll23-1133, 2008 ；Breckwoldt MO 等人 105PNAS18584-18589，2008 ；Nahrendorf M等人 117Circulationll53-1160, 2008)。
[0232]相較於梗死區域，存在更多的影響更大容積的彌散性MPO活性，如通過兩個模型內的T2-加權成像(圖10和11，左圖圖框，注意:相較於藍色(T2高強度病灶)病損存在更多的橙色(ΜΡ0+區域)，和右上圖框，顯示T2標準化的MPO+區域大於一致水平)報告的。當與凝固血液模型(CNR，珠粒:36±1，凝塊:23±2，p〈0.05)相比較時，微珠粒模型誘導更大的MPO活性和更大的損傷(腦中T2+體素的數目，珠粒:3162±1435，凝塊:548±207 ；P=0.05)。
[0233]在施用rHA-1nfestin-4後，兩種SBI模型中MPO+損傷的標準化面積和所有MPO+損傷的平均CNR沒有顯著的變化，這表明rHA-1nfestin-4不影響MPO活性，從而不影響髓樣細胞活性。因此，儘管從FXII的功能推斷可能有抗炎作用，但rHA-1nfestin-4在SBI誘導後第3天不改變每損傷的MPO活性量。第3天被選擇用來評價MPO活性和炎症，因為發現該時間點是中風模型中最大MPO活性的時間點(Breckwoldt MO等人105PNAS18584-18589, 2008)。因此，炎症級聯的其它部分可能受rHA-1nfestin-4影響，這未在第3天的MPO活性上得到反映?reckwoldt MO等人105PNAS18584-18589, 2008)。牽涉腦缺血症的大部分炎症細胞是髓性細胞，因此，即使其它因子也受rHA-1nfestin-4影響，但作用可能較小。
[0234]FXII抑制劑rHA-1nfestin-4可用於治療與各種類型的導致SBI的栓塞物相關的缺血性損傷，而不會增加患者或動物的出血風險。此外，所述動物模型和成像方法可用作研究SBI的病理生理學背後的機制以及評價和監測治療劑候選物的工具。
【權利要求】
1.因子XII(FXII)抑制劑用於預防和/或治療接受醫療操作的患者的缺血的用途，其中所述醫療操作包括與如下至少一種的接觸: (a)心臟， (b)至少一種選自下述的血管:主動脈、主動脈弓、頸動脈、冠狀動脈、頭臂動脈、脊椎基底動脈循環、顱內動脈、腎動脈、肝動脈、腸繫膜動脈，和/或靠近心臟的動脈系統的血管， (C)靜脈血管，如果患者具有已知的中隔缺損的話； 其中所述醫療操作包括在體內所述血管的至少一種血管中釋放至少一個栓塞物，所述栓塞物可在至少一個目標器官中導致所述缺血，並且其中在所述醫療操作之前、期間和/或之後施用所述FXII抑制劑。
2.權利要求1的FXII抑制劑的用途，其中所述栓塞物由氣泡、油、脂肪、膽固醇、凝固的血液和/或碎片組成。
3.根據權利要求1和2的因子XII抑制劑的用途，其中所述目標器官是: (a)腦，並且其中所述患者患有、已患有如下疾病或處於患所述疾病的風險中: (i)無症狀性腦缺血，或 (?)由非血栓可溶解性物質引起的中風； 和/或 (b)心臟、腎、肝；和/或胃腸道器官。
4.根據權利要求1至3的任一項的因子XII抑制劑的用途，其中所述醫療操作包括與至少一種或多種所述血管的內側的接觸。
5.根據權利要求1至4的任一項的因子XII抑制劑的用途，其中所述醫療操作包括對至少一種或多種所述血管的夾閉。
6.根據權利要求1至5的任一項的因子XII抑制劑的用途，其中所述醫療操作是包括導管、支架、氣囊、移植物和/或施用造影劑中任一項或多項的血管操作。
7.根據權利要求1至6的任一項的因子XII抑制劑的用途，其中所述醫療操作是血管外科手術和/或為診斷性的血管操作。
8.根據權利要求1至7的任一項的因子XII抑制劑的用途，其中所述醫療操作是冠狀血管造影術、頸動脈支架安裝、經皮冠狀動脈介入療法、頸動脈內膜剝離術、心血管手術或狹窄腎動脈的擴張術。
9.根據權利要求1至8的任一項的因子XII抑制劑的用途，其中所述FXII抑制劑包括: ⑴野生型Infestin-4多肽序列(SEQ ID NO:1)或其變體，其中變體包括: (a)野生型Infestin-4序列的N末端胺基酸2_13和所述N末端胺基酸之外的至少一個和多達5個胺基酸突變，所述突變導致與野生型Infestin-4序列的差異； 和/或 (b)來自野生型Infestin-4序列的6個保守半胱氨酸殘基和與野生型Infestin-4序列有至少70%的同源性； (ii)SPINK-1 (SEQ ID NO: 2)，其被突變而包括野生型Infestin-4序列N末端胺基酸2-13，或所述突變的SPINK-1的變體，其中變體包含a)野生型Infestin-4序列的N末端胺基酸2_13和所述N末端胺基酸之外的至少一個和多達5個胺基酸突變，所述突變導致與野生型SPINK-1序列的差異並且增加變體與野生型Infestin-4序列的同源性； 和/或 b)來自野生型SPINK-1序列的6個保守半胱氨酸殘基和與野生型SPINK-1序列有至少70%的同源性； (iii)ATII1、血管緊張素轉換酶抑制劑、Cl抑制劑、抑肽酶、α-1蛋白酶抑制劑、抗蛋白酶素([(S) -1 竣基-2-苯乙基]-氛甲酸基-L-Arg-L-Val-Arginal) >Z-Pro-Pro-醒-二甲基乙酸酯、DX88、亮抑酶肽、脯氨醯寡肽酶的抑制劑例如Fmoc-Ala-Pyr-CN、玉米-胰蛋白酶抑制劑、牛胰胰蛋白酶抑制劑的突變體、大腸桿菌素、YAP(黃鰭金槍魚抗凝血劑蛋白)、筍瓜胰蛋白酶抑制劑-V、筍瓜同效抑制劑和/或PiO-Phe-Arg-氯甲基-酮(PCK)； (iv)抗-FXII抗體，其中所述抗體結合FXII並且抑制其活性和/或活化。
10.根據權利要求9的因子XII抑制劑的用途，其中所述突變的SPINK-1的變體為SPINK K1、K2*K3(SEQ ID N0:3、4 或 5)。
11.根據權利要求1至9的任一項的因子XII抑制劑的應用，其中所述FXII抑制劑連接了增加半衰期的多肽，其中所述增加半衰期的肽任選地是白蛋白、afamin、甲胎蛋白或維生素D結合蛋白、人白蛋白或其變體、免疫球蛋白或其變體、IgG的Fe。
12.根據權利要求11的因子 XII抑制劑的用途，其中所述增加半衰期的多肽通過接頭連接至FXII抑制劑。
13.根據權利要求12的因子XII抑制劑的用途，其中所述接頭是 (i)可切割的； (?)可被內源性、外源性或共同的凝血途徑的凝血蛋白酶切割的； (iii)可被FXIIa切割的。
14.缺血症的動物模型用於評價候選治療劑治療缺血的用途，其中測試所述候選治療劑減少目標器官中缺血性損傷的能力，其中所述動物模型包括 (a)操作，其中所述操作包括將至少一個栓塞物釋放在動脈系統中，這可導致至少一個目標器官的缺血性損傷， (i)其中所述目標器官是腦、心臟、腎、肝和/或胃腸道器官；和(?)如果所述目標器官是腦，則其中所述缺血性損傷在臨床上是無症狀的和/或所述栓塞物由非血栓可溶解性物質組成； 和 (b)評價所述動物的目標器官中缺血性損傷的指徵。
15.權利要求14的動物模型，其中所述目標器官是腦。
16.成像方法用於評價用於開發FXII抑制劑的動物的目標器官中缺血性損傷的用途，其中所述成像方法包括磁共振成像和/或SPECT成像，並且其中在施用FXII抑制劑之前和/或之後進行所述成像方法。
17.權利要求16的成像法的用途，其中所述目標器官是腦。
【文檔編號】C07K16/36GK103582492SQ201280012251
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2012年3月9日 優先權日:2011年3月9日
【發明者】M·納赫倫多夫, R·魏斯勒德爾, G·迪肯內特, G·施託爾, M·諾爾特 申請人:德國傑特貝林生物製品有限公司, 綜合醫院有限公司