降鈣素原和c反應蛋白的檢測試紙及其製備方法和檢測方法

2023-11-04 04:40:52

降鈣素原和c反應蛋白的檢測試紙及其製備方法和檢測方法
【專利摘要】降鈣素原和C反應蛋白的檢測試紙，為一種量子點標記免疫定量檢測試紙，包括底襯以及依次搭接地粘貼於底襯上的樣品墊、過濾墊、結合墊、層析膜和吸水墊從而形成多層膜結構，各層膜結構之間部分重疊；所述結合墊上包被有量子點標記的降鈣素原特異性抗體I、量子點標記的C反應蛋白特異性抗體I、以及量子點標記的兔IgG；所述層析膜上有一條包被降鈣素原特異性抗體II的檢測線、一條包被C反應蛋白特異性抗體II的檢測線，以及一條包被羊抗兔IgG抗體的質控線。該試紙可方便快捷、準確定量地同時檢測降鈣素原和C反應蛋白。
【專利說明】降鈣素原和C反應蛋白的檢測試紙及其製備方法和檢測方 法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及醫藥檢測領域，尤其涉及降鈣素原和C反應蛋白的檢測試紙及其製備 方法和檢測方法。

【背景技術】
[0002] 降鈣素原（PCT)是存在於人體的一種特定標記物。PCT的檢查在對診斷髮熱性疾 病有著重要的作用，它是區別細菌和非細菌性感染的重要標誌物。普通檢測方法檢測PCT 濃度下線為0. 5ng/ml可用於判斷全身性細菌感染，更高濃度的2-10ng/ml可能為嚴重細菌 感染，>10ng/ml可能為感染性休克。如果能夠更精確檢測PCT濃度，則能夠判斷局部細菌 感染和胞內病原微生物感染(如立克次體、布魯菌、軍團菌、支原體、衣原體等）等。
[0003] PCT適應症：1、細菌感染與病毒感染的鑑別診斷；2、幫助SIRS/膿毒症的早期診 斷，評估疾病的嚴重程度及預後；3、抗生素治療效果的評估，指導臨床抗生素使用；4、手 術和嚴重創傷患者細菌感染併發症監測；5、胰腺炎鑑別診斷。
[0004] 目前檢測PCT的試紙檢測精度不高，不能定量檢測。
[0005] CRP是一種急性反應蛋白，多種因素均可引起其升高，其檢測在臨床應用相當廣 泛，包括急性感染性疾病的診斷和鑑別診斷，手術後感染的監測；抗生素療效的觀察；病程 檢測及預後判斷等。
[0006] CRP適應症：1、組織損傷、感染、腫瘤、心肌梗塞及一系列急慢性炎症性疾病，如風 溼性關節炎、全身性血管炎、多肌痛風溼病；2、術後感染及併發症的指標：手術後病人CRP 升高，術後7 -10天CRP水平應下降，如CRP不降低或再次升高，提示可能並發感染或血栓 栓塞；3、可作為細菌性感染和病毒性感染的鑑別診斷：大多數細菌性感染會引起患者血清 CRP升高，而病毒性感染則多數不升高。
[0007] 現有技術中不能同時檢測PCT和CRP，給臨床帶及診斷來不便，也不利於準確診斷 病因和病情。另外，檢測結果受溫度幹擾大。


【發明內容】

[0008] 本發明實施例所要解決的技術問題在於，提供降鈣素原和C反應蛋白的檢測試 紙，從而可方便快捷、準確定量地同時檢測降鈣原PCT和C反應蛋白CRP。
[0009] 本發明解決的又一技術問題在於，提供降鈣素原和C反應蛋白的檢測試紙製備方 法，從而獲得可方便快捷、準確定量地檢測降鈣素原PCT和C反應蛋白CRP的檢測試紙。
[0010] 本發明解決的再一技術問題在於，提供同時檢測降鈣素原PCT和C反應蛋白CRP 的檢測方法，從而可方便快捷、準確定量地檢測降鈣素原PCT和C反應蛋白CRP。
[0011] 為解決上述技術問題，本發明提供以下技術方案：降鈣素原和C反應蛋白的檢測 試紙，其為一種量子點標記免疫定量檢測試紙，包括底襯以及依次搭接地粘貼於底襯上的 樣品墊、過濾墊、結合墊、層析膜和吸水墊從而形成多層膜結構，各層膜結構之間部分重疊； 所述結合墊上包被有量子點標記的降鈣素原特異性抗體I、量子點標記的C反應蛋白特異 性抗體I、以及量子點標記的兔IgG ;所述層析膜上有一條包被降鈣素原特異性抗體II的檢 測線、一條包被C反應蛋白特異性抗體II的檢測線，以及一條包被羊抗兔IgG抗體的質控 線。所述降鈣素原特異性抗體Ι、Π配對，所述C反應蛋白特異性抗體1、11配對，所述配對 的特異性抗體I和特異性抗體II可分別識別對應抗原的不同位點。
[0012] 進一步地，所述降鈣素原的特異性抗體I、II分別為：抗抗鈣素單克隆抗體和抗降 鈣素多克隆抗體。
[0013] 進一步地，所述CRP的特異性抗體1、11分別為：鼠抗人CRP單克隆抗體7C1/OT1。
[0014] 進一步地，CRP的特異性抗體I、II可選自：可與位點N-terminal結合的CRP單 抗、可與位點19-108結合的CRP單抗、可與位點FL結合的CRP單抗或可與C-terminal位 點結合的CRP單抗。
[0015] 進一步地，所述量子點標記的降鈣素原特異性抗體I、量子點標記的C反應蛋白特 異性抗體I以及量子點標記的兔IgG三種量子點的發射螢光波長均在於550nm ;且三種量 子點波長範圍不相同；所述質控線位於所述兩檢測線的後側。
[0016] 進一步地，所述底板為低螢光特性；所述樣品墊是一種玻纖膜或聚酯膜，為待檢樣 品收集區，其前端搭接粘貼於底襯前端上；所述過濾墊為紅細胞過濾膜，過濾墊位於樣品墊 與底襯之間，其前端搭接粘貼於底襯上，後端自樣品墊後端下方延伸出一定長度；所述結合 墊的基體為玻璃纖維素膜或聚酯膜，結合墊位於過濾墊與底襯之間，其前端搭接粘貼於底 襯上，後端自過濾墊後端下方延伸出一定長度；所述層析膜為低螢光特性的硝酸纖維素膜， 其前端插設於結合墊與底襯之間且搭接粘貼於底襯上，並平鋪至底襯的後端；所述吸水墊 為吸水玻纖膜，其搭接於底襯後端覆蓋於層析膜後端上一定長度。
[0017] 進一步地，所述量子點選自 ZnS、CdS、HgS、MgS、CdSe、MgSe、ZnSe、PbSe、PbSe、CdTe、 MgTe、ZnTe、HgTe、InA S、InP中的任意一種或幾種化合物的組合；所述量子點中進一步摻雜 Cu、Mn、Hg中至少一種。
[0018] 本發明還提供製備降鈣素原和C反應蛋白的檢測試紙的方法，包括以下步驟： 步驟1，量子點標記抗體的製備：用化學交聯或生物分子間特異性作用將降鈣素原特 異性抗體I連接到量子點表面，得到其修飾的量子點；將兔IgG連接到量子點表面，得到其 修飾的量子點；將C反應蛋白特異性抗體I連接到量子點表面，得到其修飾的量子點； 步驟2,試紙製作，進一步包括： 製備結合墊：將量子點標記的降鈣素原特異性抗體I、量子點標記的C反應蛋白特異 性抗體I和量子點標記的兔IgG混合，加入牛血清白蛋白，蔗糖，吐溫20,吐溫80、曲拉通 X-100,之後均勻噴塗在結合墊的基體膜上製成結合墊； 製備層析膜：對層析膜的基材使用PBS封閉液處理，清洗，然後在氮氣中乾燥；再噴塗 降鈣素原特異性抗體II形成PCT檢測線，C反應蛋白特異性抗體II形成CRP檢測線、羊抗 兔IgG抗體形成質控線； 層疊：在底板上依次搭接地粘貼樣品墊、過濾墊、結合墊、層析膜和吸水墊，從而形成緊 密連接且部分重疊的多層膜結構。
[0019] 進一步地，所述步驟1中，取l.Og四甲基氫氧化銨五水合物，加入lmL巰基丙酸 和10mL氯仿，搖均靜置去除上層液體，然後加入100 μ L的量子點溶液，溶液中有紅色沉澱 析出後取出紅色懸浮物，以氯仿純化後，溶於水溶液中，得到表面官能團為羧基的量子點， 量子點相轉移前後螢光特性無明顯變化，向磷酸緩衝液中加入60pmol量子點、10 μ gEDC、 15 μ gNHS溶液和20 μ g降鈣素原特異性抗體或量子點標記的C反應蛋白特異性抗體I或量 子點標記的兔IgG抗體溶液，混合均勻並於室溫下反應，加入lmg甘氨酸封閉，用色譜柱或 層析柱分離純化，得到降鈣素原特異性抗體I或量子點標記的C反應蛋白特異性抗體I或 量子點標記的兔IgG抗體修飾的量子點；或者，將量子點與lmg/mL的降|丐素原特異性抗體 I或量子點標記的C反應蛋白特異性抗體I或量子點標記的兔IgG抗體混合，並在新鮮配 制的N-羥基琥珀醯亞胺和碳化二亞胺鹽酸鹽作用下室溫反應，加入甘氨酸封閉，並用色譜 柱或層析柱分離純化，得到降鈣素原特異性抗體I或量子點標記的C反應蛋白特異性抗體 I或量子點標記的兔IgG抗體修飾的量子點。
[0020] 進一步地，所述步驟2之製備結合墊工藝中，是將量子點標記的降鈣素原特異性 抗體I、量子點標記的C反應蛋白特異性抗體I和量子點標記的兔IgG按摩爾比1:10:10 比例混合，加入質量百分數1 %的牛血清白蛋白，3%的蔗糖，1%的吐溫20,0. 1%的吐溫80、 0. 2%的曲拉通X-100,之後均勻噴塗在結合墊的基體膜上，每ml溶液鋪3cm2,製成結合墊， 37°C乾燥後密封，低溫保存；結合墊的基體膜為玻璃纖維素膜或聚酯膜；所述步驟2之製備 層析膜工藝中：層析膜基材為硝酸纖維素膜，使用含3. 0%BSA、0. 1%吐溫-20的0. 01M PBS 封閉液處理2小時後，用含0. 1%吐溫-20的0. 01M PBS清洗，然後在氮氣中乾燥後低溫保 存。
[0021] 本發明再提供降鈣素原和C反應蛋白的檢測方法，包括以下步驟： 將血清、血漿或全血樣本滴加到加樣孔中進行層析反應； 對觀察窗中的檢測線和質控線上的螢光強度以螢光定量儀檢測，根據不同檢測線上的 螢光強度，依據標準曲線獲得降鈣素原和C-反應蛋白的含量； 其中，當使用標準濃度的PCT溶液和標準濃度的CRP溶液作為樣本分別進行檢測時獲 得標準曲線XI和X2 ;檢測過程中，質控線在入射光照下會產生螢光光強為C ;當待測溶液 中含有PCT時，PCT檢測線在入射光照射下會產生螢光光強T1，該螢光光強比值T1/C與待 測溶液中PCT含量成正相關特性；當待測溶液中還有CRP時，CRP檢測線在入射光照射下會 產生螢光光強T2,該螢光光強比值T2/C與待測溶液中CRP含量成正相關特性；分別測定檢 測線和質控線上量子點產生螢光光強的T1/C和/或T2/C比率，分別與標準濃度的PCT溶 液形成的校正線XI、與標準濃度的CRP溶液形成的校正線X2比照，從而定量檢測待測溶液 中的PCT和CRP。
[0022] 進一步地，在樣本進行層析反應之前，還包括預潤的步驟：具體是在層析膜上滴加 緩衝液進行層析反應；所述緩衝液體積為2(Γ80 μ 1，潤溼時間為10秒~2分鐘；所述緩衝液 為包含牛血清白蛋白和吐溫20的pH 9. 0的磷酸緩衝液。
[0023] 上述技術方案至少具有如下有益效果： 本發明的檢測試紙和方法可同時檢測待測血樣中的PCT和CRP，給臨床帶來及大的便 利，減少多次取樣；有利於準確診斷病情。通過同時檢測CRP和PCT，可以區分是急慢性炎 症、細菌性感染，局部細菌性感染、和病毒性感染等情況，並評估相關疾病的嚴重性。
[0024] 進一步地，本發明的檢測試紙或檢測方法是通過檢測線和質控線的比值來獲得檢 測結果，因此抗溫度幹擾強，檢測結果更準確可靠。
[0025]

【專利附圖】

【附圖說明】
[0026] 圖1是本發明實施例的檢測試紙帶有外包殼的正面結構示意圖。
[0027] 圖2是本發明實施例的檢測試紙去掉外殼後的側面剖視圖。
[0028] 圖3是本發明實施例的檢測試紙去掉外殼後的正面結構示意圖。

【具體實施方式】
[0029] 請參照圖廣圖3,本發明提供一種同時定量檢測降鈣素原和C反應蛋白的檢測試 紙10,其為一種量子點標記免疫定量檢測試紙，大致呈長條狀，外層進一步設置有外包裝 20 〇
[0030] 所述試紙10包括底襯1以及依次搭接地粘貼在底襯1上的樣品墊2、過濾墊3、結 合墊4、層析膜5和吸水墊6等多層膜結構，且各層膜結構之間部分重疊。其中，結合墊4上 包被有量子點標記的降鈣素原特異性抗體I、量子點標記的C反應蛋白特異性抗體I，以及 量子點標記的兔IgG (發射螢光波長550-590nm)。層析膜5上有一條包被降鈣素原特異性 抗體II的檢測線8、一條包被C反應蛋白特異性抗體II的檢測線9,以及在檢測線8、9後 側的一條包被羊抗兔IgG抗體的質控線7。
[0031] 其中，降鈣素原特異性抗體I、II配對，C反應蛋白特異性抗體I、II配對，該配對 的特異性抗體I和特異性抗體II可分別識別對應抗原的不同位點。
[0032] 作為本發明的實施例，降鈣素原的特異性抗體I、II可以分別為：抗抗鈣素單克隆 抗體和抗降鈣素多克隆抗體。當然，配對的降鈣素原特異性抗體Ι、Π只要可分別識別抗原 的不同位點即可，並不限於抗抗鈣素單克隆抗體和抗降鈣素多克隆抗體。
[0033] 同樣地，配對的C反應蛋白特異性抗體1、11為可分別識別抗原的不同位點的C反 應蛋白特異性抗體。
[0034] 作為本發明的實施例所述CRP的特異性抗體I、II可以分別為但不局限於：鼠抗人 CRP單克隆抗體7C1/OT1。
[0035] 女例如，CRP的特異性抗體I、II可選自：可與位點N-terminal結合的CRP單抗、 可與位點19-108結合的CRP單抗、可與位點FL結合的CRP單抗或可與C-terminal位點結 合的CRP單抗等抗體中的兩種可識別抗原不同位點的抗體。
[0036] 上述外包裝20上對應於該試紙10適當位置設置有加樣孔21、觀察窗2 ;還可以進 一步設置預潤孔23。所述加樣孔21以及預潤孔23為貫穿外包裝20的通孔，以利於待測血 清、血漿或全血樣本滴加到加樣孔21後滲至位於其正後方的試紙10的樣品墊2,以及自預 潤孔23中滴加的緩衝液滲透至其正後方的試紙10的層析膜5。通常設計中，所述加樣孔 21以及預潤孔23為圓形或橢圓形，當然其它形狀也可適用。所述觀察窗22為透明窗體，或 者可以直接設置為通孔，以通過觀察窗22可以讀取檢測結果，一般設計中，該觀察窗22為 長方形，且位於加樣孔21及預潤孔23之間。可以理解，該觀察窗22也可設計為其它形狀， 其位置及面積與位於其正後方的試紙10上層析膜5的檢測線8、9以及兩條質控線7相對 應。可以理解，預潤孔23也可以不設置。
[0037] 底板1為低螢光特性塑料，承載前述各層膜結構，其根據試紙10的形狀對應裁剪 而成，如本實施例為長條形。
[0038] 樣品墊2是一種玻纖膜或聚酯膜，為待檢樣品收集區，其前端搭接粘貼於底襯1前 端上，過濾墊3夾設於樣品墊2與底襯1之間，且靠近樣品墊2後端。
[0039] 過濾墊3為紅細胞過濾膜，作用是濾過紅細胞。紅細胞過濾膜3的設置使得試紙 10能適用於測量血清、血漿或全血等各種血樣中的降鈣素原以及C反應蛋白，適用性提高。 過濾墊3位於樣品墊2與底襯1之間，其前端搭接粘貼於底襯1上，後端自樣品墊2後端下 方延伸出一定長度。
[0040] 結合墊4的基體材料為玻璃纖維素膜或聚酯膜，結合墊4上包被有量子點標記的 降鈣素原特異性抗體I、量子點標記的C反應蛋白特異性抗體I、量子點標記的兔IgG。
[0041] 其中，量子點標記的降鈣素原特異性抗體I、量子點標記的C反應蛋白特異性抗體 I以及量子點標記的兔IgG等均應使用發射波長在550nm以上的量子點，以避免底板及層析 膜的螢光幹擾；且較佳地，三種量子點要求波長範圍不相同。但螢光發射的波長範圍是可以 根據需要進行調整的，檢測時設備檢測量子點螢光光強時需要使用對應的濾光片。
[0042] 作為一種具體實例，分別調節量子點標記的降鈣素原特異性抗體I發射波長為 620-650nm，量子點標記的C反應蛋白特異性抗體I發射波長為590-620nm，量子點標記的兔 IgG的發射波長為550-590nm。
[0043] 結合墊4位於過濾墊3與底襯1之間，其前端搭接粘貼於底襯1上，後端自過濾墊 3後端下方延伸出一定長度。
[0044] 層析膜5要求低螢光特性，其材料為硝酸纖維素膜，層析膜5上包被有一條抗降鈣 素多克隆抗體的檢測線8、一條包被C反應蛋白特異性抗體的檢測線9,以及在檢測線8、9 後側有一條包被羊抗兔IgG抗體的質控線7。層析膜5的前端插設於結合墊4與底襯1之 間且搭接粘貼於底襯1上，並平鋪至底襯1的後端。
[0045] 吸水墊6為吸水玻纖膜。其搭接於底襯後端覆蓋於層析膜5後端上一定長度。
[0046] 其中，樣品墊2、過濾墊3、結合墊4、層析膜5、吸水墊6寬度與底襯1寬度齊平，依 次搭接粘貼於底襯1上，各層之間緊密連接且部分重疊。各膜層的上表面在該試紙10上表 面（即正面結構）依次平鋪展開一定區域。如圖3所示，該試紙10的正面上各膜層平行連 接，側面對齊，自試紙10的前端開始，依次為樣品墊2、過濾墊3、結合墊4、層析膜5、吸水墊 6等的正面區域沿試紙10 (或底襯1)的長度方向依次鄰接且相互平行，檢測線8、9和質控 線7平行設置於層析膜5且位於結合墊4和吸水墊6正面區域之間。檢測線8、9位於質控 線7之前。
[0047] 該試紙10整體呈長條狀，相應地，外包裝20也呈長條狀。在一【具體實施方式】中， 所述樣品墊2、過濾墊3、結合墊4長度均為7_，寬度4mm ;層析膜5、吸水墊6長度為15_， 寬度為4_ ;樣品墊2、過濾墊3、結合墊4、層析膜5之間的重疊區域為2mm長度，層析膜5 和吸水墊6之間的重疊區域為3_長度。層析膜5上檢測線和質控線的寬度為1. 5_，間隔 為 5mm η
[0048] 外包裝20與試紙10二者形狀相適配。包裝後，外包裝20上設置的加樣孔21正 對樣品墊2的正面區域，觀察窗22正對層析膜5的正面區域且使得檢測線8、9和質控線7 部分長度位於觀察窗22後方，預潤孔23也正對層析膜5的正面區域。
[0049] 本發明檢測降鈣素原和C反應蛋白的檢測試紙10的製備方法，主要包括以下步 驟： 步驟1，量子點標記抗體的製備 用化學交聯或生物分子間特異性作用將降鈣素原特異性抗體I連接到量子點表面，得 到其修飾的量子點，發射波長為620-650nm ;同理將C反應蛋白特異性抗體連接到量子點表 面，得到其修飾的量子點，發射波長為590-620nm ;同理將兔IgG連接到量子點表面，得到其 修飾的量子點，發射波長為550-590nm。
[0050] 本發明實施例的量子點為單一化合物形成的量子點或幾種化合物組成的複合量 子點。所述化合物為選自 ZnS、CdS、HgS、MgS、CdSe、MgSe、ZnSe、PbSe、PbSe、CdTe、MgTe、 ZnTe、HgTe、InAs、InP中的任意一種或幾種，而且可摻雜Cu、Μη和Hg。
[0051] 具體製作過程舉例： 取1. 〇g四甲基氫氧化銨五水合物，加入lmL巰基丙酸和10mL氯仿，搖均，靜置30分鐘 後，去除上層液體，然後加入1〇〇μ L的CdSe/ZnS量子點溶液。溶液中有紅色沉澱析出，48 小時後取出紅色懸浮物，以氯仿純化後，溶於水溶液中，得到表面官能團為羧基的CdSe/ZnS 量子點。量子點相轉移前後螢光特性無明顯變化。向磷酸緩衝液中加入60pmol量子點、 10 μ gEDC、15 μ gNHS溶液和20 μ g降鈣素原特異性抗體I溶液，混合均勻並於室溫下反應 4h，加入lmg甘氨酸封閉。用色譜柱或層析柱分離純化，得到降鈣素原特異性抗體I修飾的 620-650波長的量子點。同理獲得兔IgG修飾的550-590nm波長的量子點和C反應蛋白特 異性抗體I修飾的590-620nm波長的量子點。製備後用19Γ5%的牛血清白蛋白封閉並4°C 保存。
[0052] 作為另一實例，將發射波長為600nm的量子點與lmg/mL的降鈣素原特異性抗體I 混合，並在N-輕基琥拍醯亞胺（NHS，lmg/mL)和碳化二亞胺鹽酸鹽（EDC，lmg/mL)作用下室 溫反應4至5小時，加入lmol/L甘氨酸封閉，並用色譜柱或層析柱分離純化，得到降鈣素原 特異性抗體I修飾的620-650波長的量子點。同理獲得兔IgG修飾的550-590nm波長的量 子點和C反應蛋白特異性抗體I修飾的590-620nm波長的量子點。製備後用19Γ5%的牛血 清白蛋白封閉並4°C保存。
[0053] 步驟2,試紙製作，進一步包括： 1)製備結合墊4 將量子點標記的降鈣素原特異性抗體I、量子點標記的C反應蛋白特異性抗體I和量子 點標記的兔IgG按摩爾比1:10:10比例混合，加入1% (質量百分數，下同）的牛血清白蛋 白，3%的蔗糖，1%的吐溫20,0. 1%的吐溫80、0. 2%的曲拉通X-100等，之後均勻噴塗在結合 墊4的基體膜上，每ml溶液鋪3cm2,製成結合墊4, 37°C乾燥後密封，4°C下保存。結合墊4 的基體膜為玻璃纖維素膜或聚酯膜，其上包被有量子點標記的降鈣素原特異性抗體I、量子 點標記的C反應蛋白特異性抗體I、量子點標記的兔IgG。
[0054] 2)製備層析膜5 層析膜的基材為硝酸纖維素膜，使用含3. 0%BSA、0. 1%吐溫-20的0. 01M PBS封閉液處 理2小時後，用含0. 1%吐溫-20的0. 01M PBS清洗3次，每次5分鐘，然後在氮氣中乾燥1 小時後低溫4°C保存。使用XYZ3000點膜儀在處理過的層析膜上從近到遠依次噴塗以1 μ L/ cm噴塗降鈣素原特異性抗體II形成PCT檢測線8, C反應蛋白特異性抗體II形成CRP檢 測線9、羊抗兔IgG抗體形成質控線7,作為一實施例，噴塗線寬1. 5_，線間隔5_。層析膜 5製成後乾燥封袋並低溫4°C保存。
[0055] 3)層疊 製作免疫層析試紙條，在底板1上依次搭接地粘貼樣品墊2、過濾墊3、結合墊4、層析膜 5和吸水墊6。樣品墊2為玻璃纖維素膜或聚酯膜，作為待檢樣品收集區；過濾墊3為紅細 胞過濾膜，作用是濾過紅細胞，使得試紙可以測量血清、血漿或全血中的降鈣素原；吸水墊 6為吸水玻璃纖維膜。各膜層按現有技術的方法製備或直接從市場上獲得。
[0056] 包括步驟3,提供外包裝20,所述外包裝20上設有所述加樣孔21、觀察窗22,或者 進一步包括預潤孔23。
[0057] 本發明的試紙用於同時檢測降鈣素原和C反應蛋白的含量的檢測原理及方法如 下：採用雙抗夾心模式，待測溶液滴加到樣品墊2時，由於毛細作用、滲透和虹吸作用，待測 溶液可以迅速溼透結合墊4並溶解結合墊4上的量子點標記特異性抗體I、量子點標記的 CRP特異性抗體I和量子點標記兔IgG。如果待測溶液中存在目標PCT和CRP，那麼待測溶 液中的PCT就會和溶解的量子點標記抗抗鈣素單抗(簡稱QDotl-Abl)發生特異性免疫反 應，形成QDotl-Abl-PCT免疫複合物；待測溶液中的CRP就會和溶解的量子點標記的CRP 特異性抗體(簡稱QDot2-Ab2)發生特異性免疫反應，形成QD 〇t2-Ab2-CRT免疫複合物。然 後這些免疫複合物、量子點標記兔IgG (簡稱QD〇t3-Ab3)和剩餘未結合的量子點標抗體隨 著測試溶液，在層析膜上由層析作用和吸水墊的虹吸作用下向前遷移。測試溶液流經層析 膜上的檢測線8、9和質控線7,測試溶液中的QDotl-Abl-PCT和檢測線8上的抗降鈣素多克 隆抗體(簡稱Ab4)形成免疫複合物QDotl-Abl-PCT-Ab4 ;同理在檢測線9上形成免疫複合 物QDot2-Ab2-CRT-Ab5 ;在質控線7上形成免疫複合物QDot3-Ab3-Ab6。還有剩餘極少量免 疫複合物可能沒有被測試線或質控線捕獲而最終進入吸水墊6。由此無論待測溶液中是否 含有PCT或CRT，質控線7在入射光照下會產生螢光光強為C ;當待測溶液中含有PCT時，檢 測線在入射光照射下會產生螢光光強T1，該螢光光強比值T1/C與待測溶液中PCT含量成 正相關特性；當待測溶液中還有CRP時，檢測線在入射光照射下會產生螢光光強T2,該螢光 光強比值T2/C與待測溶液中CRP含量成正相關特性。因此通過分別測定免疫層析試紙10 上檢測線8、9和質控線7上量子點產生螢光光強的T1/C和T2/C比率，分別與標準濃度的 PCT溶液形成的校正線XI、與標準濃度的CRP溶液形成的校正線X2比照，可以定量檢測待 測溶液中的PCT和CRP。如果在檢測過程中，免疫層析試紙條上的質控線沒有出現螢光時， 則表示該試紙條已經失效，檢測結果無意義。
[0058] 本發明的檢測方法包括以下步驟： 1. 在層析膜5上對應的預潤孔23中滴加50 μ L的緩衝液以潤溼層析膜，該緩衝液 為包含牛血清白蛋白和吐溫20的pH 9. 0的磷酸緩衝液，層析反應lmin ;目的是預潤溼 層析膜，封閉非特異性結合位點，以使量子點標記物均勻通過層析膜，且減少在層析膜上的 非特異性吸附，並減緩樣本流動速度，從而增加特異性結合，其中緩衝液體積一般為20? 80 μ 1，潤溼時間一般為10秒?2分鐘； 2. 將150 μ 1血清、血漿或全血樣本滴加到加樣孔21中，層析反應20min ; 3. 對觀察窗22中的檢測線8、9和質控線7上的螢光強度以螢光定量儀檢測，根據不 同檢測線上的螢光強度，依據標準曲線獲得降鈣素原和C-反應蛋白的含量，檢測下限分別 為0. 5ng/mL和50ng/mL，標準曲線的獲得方法與上述步驟相同，此時待測樣品是用標準濃 度的PCT溶液和標準濃度的CRP溶液進行檢測。
[0059] 檢測過程中，質控線7在入射光照下會產生螢光光強為C ;當待測溶液中還有PCT 時，檢測線8在入射光照射下會產生螢光光強T1，該螢光光強比值T1/C與待測溶液中PCT 含量成正相關特性；當待測溶液中還有CRP時，檢測線9在入射光照射下會產生螢光光強 T2,該螢光光強比值T2/C與待測溶液中CRP含量成正相關特性。通過分別測定免疫層析試 紙10上檢測線8、9和質控線7上量子點產生螢光光強的T1/C和T2/C比率，分別與標準濃 度的PCT溶液形成的校正線XI、與標準濃度的CRP溶液形成的校正線X2比照，可以定量檢 測待測溶液中的PCT和CRP。
[0060] 可以理解，上述檢測步驟1也可以選擇性地去掉，直接操作步驟2和3。
[0061] 本發明的檢測試紙10可同時檢測待測血樣中的PCT和CRP，給臨床帶來及大的便 利，減少多次取樣；有利於準確診斷病情。急性反應蛋白CRP，多種因素均可引起其升高，包 括在心血管疾病中也會導致其升高，所以臨床單憑CRP-項標誌物，大大限制了輔助診斷 作用。PCT作為一種的感染標誌物，水平不受非感染因素影響。因此PCT對細菌感染的診斷 價值明顯高於WBC計數及CRP，是一項靈敏度好，特異性高的具有鑑別診斷意義的新指標。 鑑別細菌性感染和非細菌性感染的能力明顯的優於CRP，而且PCT還可以輔助臨床診斷重 症感染和敗血症的需求。PCT對細菌感染發生的局部感染或全身感染在臨床指導上比CRP 更具意義，CRP目前對全身感染有一定的敏感性，在針對局部細微感染其作用是受限制的。 PCT比CRP在抗生素治療效果上更具有的指導性，PCT可避免抗生素亂用。
[0062] 通過同時檢測CRP和PCT，可以區分是急慢性炎症、細菌性感染，局部細菌性感染、 和病毒性感染等情況，並評估相關疾病的嚴重性。
[0063] 以上所述是本發明的【具體實施方式】，應當指出，對於本【技術領域】的普通技術人員 來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也視為 本發明的保護範圍。
【權利要求】
1. 降鈣素原和C反應蛋白的檢測試紙，其特徵在於，其為一種量子點標記免疫定量檢 測試紙，包括底襯以及依次搭接地粘貼於底襯上的樣品墊、過濾墊、結合墊、層析膜和吸水 墊從而形成多層膜結構，各層膜結構之間部分重疊；所述結合墊上包被有量子點標記的降 鈣素原特異性抗體I、量子點標記的C反應蛋白特異性抗體I、以及量子點標記的兔IgG ;所 述層析膜上有一條包被降鈣素原特異性抗體II的檢測線、一條包被C反應蛋白特異性抗體 II的檢測線，以及一條包被羊抗兔IgG抗體的質控線；所述降鈣素原特異性抗體I、II配 對，所述C反應蛋白特異性抗體1、11配對，所述配對的特異性抗體I和特異性抗體II可分 別識別對應抗原的不同位點。
2. 如權利要求1所述的試紙，其特徵在於，所述降鈣素原的特異性抗體I、II分別為： 抗抗鈣素單克隆抗體和抗降鈣素多克隆抗體；所述CRP的特異性抗體1、11分別為：鼠抗人 CRP單克隆抗體7C1/OT1。
3. 如權利要求1所述的試紙，其特徵在於，CRP的特異性抗體I、II選自：可與位點 N-terminal結合的CRP單抗、可與位點19-108結合的CRP單抗、可與位點FL結合的CRP單 抗或可與C-terminal位點結合的CRP單抗。
4. 如權利要求1所述的試紙，其特徵在於，所述量子點標記的降鈣素原特異性抗體I、 量子點標記的C反應蛋白特異性抗體I以及量子點標記的兔IgG三種量子點的發射螢光波 長均大於550nm，且三種量子點波長範圍不相同；所述質控線位於所述兩檢測線的後側。
5. 如權利要求1所述的試紙，其特徵在於，所述底板為低螢光特性；所述樣品墊是一種 玻纖膜或聚酯膜，為待檢樣品收集區，其前端搭接粘貼於底襯前端上；所述過濾墊為紅細胞 過濾膜，過濾墊位於樣品墊與底襯之間，其前端搭接粘貼於底襯上，後端自樣品墊後端下方 延伸出一定長度；所述結合墊的基體為玻璃纖維素膜或聚酯膜，結合墊位於過濾墊與底襯 之間，其前端搭接粘貼於底襯上，後端自過濾墊後端下方延伸出一定長度；所述層析膜為低 螢光特性的硝酸纖維素膜，其前端插設於結合墊與底襯之間且搭接粘貼於底襯上，並平鋪 至底襯的後端；所述吸水墊為吸水玻纖膜，其搭接於底襯後端覆蓋於層析膜後端上一定長 度。
6. 如權利要求1所述的試紙，其特徵在於，所述量子點選自ZnS、CdS、HgS、MgS、CdSe、 MgSe、ZnSe、PbSe、PbSe、CdTe、MgTe、ZnTe、HgTe、InAs、InP 中的任意一種或幾種化合物的 組合；所述量子點中進一步摻雜Cu、Mn、Hg中至少一種。
7. 製備一種如權利要求1-6中任一項所述的降鈣素原和C反應蛋白的檢測試紙的方 法，其特徵在於，包括以下步驟： 步驟1，量子點標記抗體的製備：用化學交聯或生物分子間特異性作用將降鈣素原特 異性抗體I連接到量子點表面，得到其修飾的量子點；將兔IgG連接到量子點表面，得到其 修飾的量子點；將C反應蛋白特異性抗體I連接到量子點表面，得到其修飾的量子點； 步驟2,試紙製作，進一步包括： 製備結合墊：將量子點標記的降鈣素原特異性抗體I、量子點標記的C反應蛋白特異 性抗體I和量子點標記的兔IgG混合，加入牛血清白蛋白，蔗糖，吐溫20,吐溫80、曲拉通 X-100,之後均勻噴塗在結合墊的基體膜上製成結合墊； 製備層析膜：對層析膜的基材使用PBS封閉液處理，清洗，然後在氮氣中乾燥；再噴塗 降鈣素原特異性抗體II形成PCT檢測線，C反應蛋白特異性抗體II形成CRP檢測線、羊抗 兔IgG抗體形成質控線； 層疊：在底板上依次搭接地粘貼樣品墊、過濾墊、結合墊、層析膜和吸水墊，從而形成緊 密連接且部分重疊的多層膜結構。
8. 如權利要求7所述的製備方法，其特徵在於，所述步驟1按下述兩種工藝中任意一 種進行：步驟1的工藝一：取四甲基氫氧化銨五水合物，加入巰基丙酸和氯仿，搖均靜置去 除上層液體，然後加入量子點溶液，溶液中有紅色沉澱析出後取出紅色懸浮物，以氯仿純化 後，溶於水溶液中，得到表面官能團為羧基的量子點，量子點相轉移前後螢光特性無明顯變 化，向磷酸緩衝液中加入量子點、EDC、NHS溶液和降|丐素原特異性抗體I或量子點標記的C 反應蛋白特異性抗體I或量子點標記的兔IgG抗體溶液，混合均勻並於室溫下反應，加入甘 氨酸封閉，用色譜柱或層析柱分離純化，得到降鈣素原特異性抗體I或量子點標記的C反應 蛋白特異性抗體I或量子點標記的兔IgG抗體修飾的量子點；步驟1的工藝二：將量子點與 降鈣素原特異性抗體I或量子點標記的C反應蛋白特異性抗體I或量子點標記的兔IgG抗 體混合，並在N-羥基琥珀醯亞胺和碳化二亞胺鹽酸鹽作用下室溫反應，加入甘氨酸封閉， 並用色譜柱或層析柱分離純化，得到降鈣素原特異性抗體I或量子點標記的C反應蛋白特 異性抗體I或量子點標記的兔IgG抗體修飾的量子點；所述步驟2之製備結合墊工藝中，是 將量子點標記的降鈣素原特異性抗體I、量子點標記的C反應蛋白特異性抗體I和量子點標 記的兔IgG按摩爾比1:10:10比例混合，加入質量百分數1%的牛血清白蛋白，3%的蔗糖， 1%的吐溫20,0. 1%的吐溫80、0. 2%的曲拉通X-100,之後均勻噴塗在結合墊的基體膜上，每 ml溶液鋪3cm2,製成結合墊，37°C乾燥後密封，低溫保存；結合墊的基體膜為玻璃纖維素膜 或聚酯膜；所述步驟2之製備層析膜工藝中：層析膜基材為硝酸纖維素膜，使用含3. 0%BSA、 0. 1%吐溫-20的0. 01M PBS封閉液處理2小時後，用含0. 1%吐溫-20的0. 01M PBS清洗， 然後在氮氣中乾燥後低溫保存。
9. 降鈣素原和C反應蛋白的檢測方法，包括以下步驟： 將血清、血漿或全血樣本滴加到加樣孔中進行層析反應； 對觀察窗中的檢測線和質控線上的螢光強度以螢光定量儀檢測，根據不同檢測線上的 螢光強度，依據標準曲線獲得降鈣素原和C-反應蛋白的含量； 其中，當使用標準濃度的PCT溶液和標準濃度的CRP溶液作為樣本分別進行檢測時獲 得標準曲線XI和X2 ;檢測過程中，質控線在入射光照下會產生螢光光強為C ;當待測溶液 中含有PCT時，PCT檢測線在入射光照射下會產生螢光光強T1，該螢光光強比值T1/C與待 測溶液中PCT含量成正相關特性；當待測溶液中還有CRP時，CRP檢測線在入射光照射下會 產生螢光光強T2,該螢光光強比值T2/C與待測溶液中CRP含量成正相關特性；分別測定檢 測線和質控線上量子點產生螢光光強的T1/C和/或T2/C比率，分別與標準濃度的PCT溶 液形成的校正線XI、與標準濃度的CRP溶液形成的校正線X2比照，從而定量檢測待測溶液 中的PCT和CRP。
10. 如權利要求9所述的檢測方法，其特徵在於，在將血清、血漿或全血樣本滴加到加 樣孔中進行層析反應的步驟之前，還包括預潤的步驟：具體是在層析膜上滴加緩衝液以預 潤溼層析膜；所述緩衝液體積為2(Γ80 μ 1，潤溼時間為10秒~2分鐘；所述緩衝液為包含牛 血清白蛋白和吐溫20的pH 9. 0的磷酸緩衝液。
【文檔編號】G01N33/68GK104122401SQ201410356367
【公開日】2014年10月29日 申請日期:2014年7月24日 優先權日:2014年7月24日
【發明者】餘皓, 徐良 申請人:深圳職業技術學院