異種移植軟組織植入物及製造和使用的方法

2023-11-04 08:44:32 3

異種移植軟組織植入物及製造和使用的方法
【專利摘要】本申請涉及用於在人體植入中使用的包括軟組織的植入物領域。優選從異種移植物來源獲得本申請的軟組織植入物。本申請提供了中和、去除或基本減少來自異種移植植入物的抗原以及滅菌和/或強化異種移植植入物的化學方法。本發明技術產出了具有優異的結構、機械和/或生化完整性的軟組織植入物。本申請也涉及用於處理包括軟組織如肌腱和韌帶的異種移植植入物的方法，並且涉及由這些方法生產的植入物。
【專利說明】異種移植軟組織植入物及製造和使用的方法
[0001] 相關申請
[0002] 本申請涉及並要求於2012年5月11日提交的題為"異種移植軟組織植入物及制 備和使用方法"的美國臨時專利申請序列號61/646, 229的優先權。該229臨時申請通過引 用將其整體結合於此。
[0003] 聯邦政府資助的研究或開發
[0004] [不適用]

【技術領域】
[0005] 本申請涉及用於移植，優選移植至人體的組織植入物和組織植入物處理領域。組 織植入物優選是異種移植軟組織植入物，但是本申請某些方面可以適用於骨組織或硬組 織，以及更複雜的結構，如結合骨或硬組織植入物或者甚至來自同種異體移植（allograft) 或異種移植來源的器官。本申請提供了中和、去除或基本減少來自異種移植植入物 (xenograft implants)的抗原並且滅菌和/或強化異種移植植入物的化學方法。本發明技 術產出了具有優異結構、機械和/或生化完整性的軟組織植入物。本申請還涉及用於處理 包括軟組織如肌腱和韌帶的異種移植植入物的方法，並且涉及由這些方法生產的植入物。

【背景技術】
[0006] 當病人面對骨科創傷時，如前交叉韌帶（ACL)的損傷，對這種疾病的理想的解決 方法是修復這種結構或以重建損傷前的形態的方式增加自然癒合過程。遺憾的是，目前ACL 修復和再生已經顯示是基本不成功的，這是由於缺少天然組織自然地癒合/再生；因此，全 置換（total r印lacement)已經成為了護理的標準。已經證明通過捐贈者的遺體（即，同 種異體移植）肌腱的ACL置換是有效的選擇，使患者可以回到他們受傷前的生活質量。然 而，由於原材料具有巨大的可變性以及有限的可獲得性，同種異體移植的選擇背負著挑戰。 外科醫生通過限制捐贈者的標準（例如，只接受來自45歲以下捐贈者的移植物）努力減輕 移植的可變性；然而，這類限制也加劇了可獲得性的挑戰。
[0007] 因此，目標是發現具有相似的基因、物理的和生理屬性的捐贈者組織的充足的庫， 這可以減輕或消除上面的問題。這可以通過利用異種移植組織完成。用異種移植組織來 源，通過育種和群落管理，可以選擇和控制供體的基因組成，可以監視和控制生產以確保最 佳的健康和肌肉張力，並且可以計劃和選擇供體的年齡。這類供體因此具有用於創建高質 量的移植物的優越的生物機械結構，這些移植物可以在它們的巔峰年齡恢復。
[0008] 包括軟組織的植入物可以植入受體中以置換和/或修復存在的軟組織。例如，遺 傳缺陷、疾病、和/或創傷可以損壞軟組織，使得置換和/或修複合乎需要。這些植入物可 以是同種異體移植物、自體移植物或異種移植物，而受體可以是人、哺乳動物、或動物受體。 經常使用植入物，其中，受體是人類患者。包括人類患者在內，已使用包括軟組織的植入物 來置換心臟瓣膜、韌帶、肌腱和皮膚等其他組織中。
[0009] 期望的是處理植入物，特別是自體移植物、同種異體移植物、和異種移植物以中 和、去除或基本減少一種或多種不需要的組分和/或逐漸獲得（instill) -種或多種需要 的組分。例如，可以鈍化植入物或處理植入物以去除或滅活細菌、病毒、真菌以及其他病原 體和抗原組分。
[0010] 可以用清潔劑和/或Y射線處理包括軟組織的植入物。然而，現有技術受到一個 或多個缺點的制約。不期望的來自輻射的結果可包括自由基、氫和低分子量烴的形成；升高 的不飽和度；褪色和氧化。一些化學滅菌劑（例如，戊二醛）的使用增加了引發毒性反應的 危險。此外，一些化學滅菌劑（例如，過氧化物）可以破壞植入物，尤其是軟組織，某種程度 上，其傾向於比骨和硬組織更脆弱。關於包括軟組織的植入物的鈍化的特別關注是處理的 軟組織可能經受增加的鬆弛、降低的硬度、降低的強度或降低的生物相容性，其可以導致植 入物可變的性能。包括用於鈍化的方法在內，期望具有不引起過度的鬆弛或軟組織的硬度 或強度或生物相容性下降的處理方法。
[0011] 為了確保破壞病原體，如人免疫缺陷病毒（HIV)，已經使用劑量的γ輻射， 其導致組織的破壞（如，3. 5Mrad ;參見例如，Rasmussen, et al.，J. Arthroscopic and Related Surgery,10(2):188-197, (1994) ；Goertzen, et al.,British Soc. of Bone and Joint Surg.,77:204-211 (805) ；Loty,et al., International Orthopaedics, 14:237-242, (1990))。已經發現使用環氧乙燒導致植入物產生 炎症反應（Kudryk,et al.,J. Biomedical Materials,26:1477-1488, (1992); Thoren, et al. , Clin. Orthopaedics, 318:259-263, (199 5) ； Simonian, et al., Clin.Orthopaedics, 302:290-296, (1994) ；Jackson,et al., Am.J.Sports Medicine, 18:1-9,（1990))。標準的化學溶液處理，雖然能有效地對與引入的化學溶液接觸 的表面滅菌，但是傾向於不能充分滲透至其中可能殘留潛在的致病生物的組織間隙中。有 關軟組織的滅菌，通過輻射、環氧乙烷或化學溶液處理對軟組織破壞的潛力尤其受到關注， 因為軟組織比骨組織更容易被破壞。甚至更溫和的滅菌劑，如過氧化物，由於組織的腫脹以 及殘留的反應副產物的存在可以引起損傷。
[0012] 期望的處理過程包括一個或多個下列特徵：有效地去除或滅活各種各樣的細菌、 病毒和真菌病原體；無移植毒性；保留或改善期望的組織特徵，如生物機械強度或生長誘 導特性；對各種各樣的操作修改和/或用於多種多樣的組織類型的有效性；在最終的植入 物組織容器中終止過程的能力，以確保用於移植的滅菌包裝和運輸；應用自動化控制和監 視系統以及開發自動化和有效過程的能力。
[0013] 與開發異種移植植入物相關的挑戰是充分去除外來的異種抗原。這類表位，特別 是Galal_3Gal_l -4GlcNAc-R(通常稱為α-gal)的存在對於中和、去除或基本上降低是重 要的，因為人體具有特異性靶向這類複合糖的抗體。來自外來異種移植來源的移植物，其包 括這種異種抗原，一旦植入，就會被人體劇烈排斥。


【發明內容】

[0014] 一方面，本申請涉及用於人類患者使用的異種移植組織植入物。
[0015] 本申請進一步涉及軟組織植入物，優選用於ACL置換，優選設計自異種移植組織。 異種移植來源材料是受控的並且沒有牛海綿狀腦病（BSE)，或可能對人類受體造成威脅的 其他異種移植特異性或非特異性疾病。處理後獲得的移植物在人類受體中是生物兼容的， 沒有由於異種基因抗原引起的實質上有害的免疫反應或排斥。在一些實施方式中處理後獲 得的移植物是有生物活性的，具有改善的癒合、重塑和結合。
[0016] 本申請另外涉及用於製造包括更適合用於受體植入的軟組織的植入物的方法。根 據本發明技術處理的軟組織（如，肌腱和韌帶），通過與清潔劑，如包含任何氧化滅菌劑（例 如，過氧化氫）、一種或多種去汙劑、鹽水、碳水化合物、醇、酸或鹼組分和/或它們的組合的 溶液接觸而完全或部分鈍化。優選獲得自異種移植來源的組織用於人體移植。在一些實施 方式中，使用至少一種碳水化合物（如，糖）的處理步驟是優選的。
[0017] 優選的方法包括在各種清潔溶液的存在下，含有植入物材料的室中的壓力振蕩， 可選的使用超聲。進行特定的處理步驟以中和、去除或基本減少異種抗原，同時還增強機械 特性並且優選改善植入物的癒合速度。獲得的植入物甚至可以比天然組織更強壯，具有降 低的生物負荷水平，並且相比其他可用的組織移植物，還具有更快的植入後的結合。
[0018] 在某些實施方式中，加工（處理，processing)可以發生在開放或封閉的容器中。 例如，本申請的某些方面可以完全或部分在具有光滑邊緣的金屬、玻璃或聚合物燒杯或皿 中進行用於緩和處理組織以及在容器中注入和排出化學藥品。本申請的某些方面還可以使 用具有螺紋或壓縮安裝蓋（其擰緊或卡入以提供封閉來阻止在組織的加工、處理、運輸或 儲存中的濺出或汙染）的容器實施。加工的一些或全部元件可以在具有或不具有壓力循 環，以及具有或不具有超聲下進行。
[0019] 可以預期，組織可以原地保留，而不同的化學藥品或化學藥品溶液通過注入或流 過器皿或超過或流過組織，或通過在開放或封閉的器皿、室或容器中加入和去除溶液或處 理化學藥品被引入而接觸。可以預期，在一個或多個加工步驟之前、之間或之後容器從開放 改變到封閉，以及在任何一個或多個加壓步驟之前、之間或之後，可以應用或從處理中去除 加壓循環、張力（tension)或超聲。進一步預期，組織可以穿過或置於溶液中，隨後從溶液 中去除或穿過並且進入另一溶液中用於加工中的下一步驟。
[0020] 進一步預期，本申請的某些實施方式可以應用至或結合至不要求或不設計圍繞任 何特定存儲或處理器皿的加工場景（processing scenarios)，依賴處理化學劑流過包括骨 或硬組織和肌腱或其他組織的組織的方法，發生在開放或封閉的超聲浴中的方法，用於組 織的清創的方法，以及前述的各種組合，如以下那些教導的，例如，在美國專利6, 837, 907、 6, 024, 735、5, 977, 432、5, 977, 034、5, 976, 104、5, 820, 581、5, 797, 871 和 5, 556, 379 中，其 全部結合於此。
[0021] 特別地，應該注意，對於多種組織類型的異種移植物的生產，可以實施涉及受控的 異種抗原的去除或降低的本申請的加工方法，並且該方法對於多種組織類型的異種移植物 的生產是有用的，這些移植物包括軟組織移植物，如肌腱、韌帶、皮膚、硬腦膜物質、筋膜和 其他結締組織，並且還包括硬組織移植物，如骨和骨衍生的組分，如皮質骨、松質骨、脫鈣骨 基質，組裝的骨移植物和天然存在的或硬組織和軟組織裝配組合的移植物，如骨-肌腱或 骨-肌腱-骨植入物。
[0022] 本申請的方法提供用於植入物加工，憑藉此，骨髓、血液、蛋白質和顆粒物質充分 中和、去除或基本減少，使得殘留的基本是組織基質、鈍化的組織基質、生物惰性組織基質 或生物活性組織基質，其中可以達到任何形式的內源材料和可用的組織的降低。如以下更 詳細的描述，優選通過採用引起有效地互相滲透基質的各種清潔和滅菌溶液的壓力循環或 振蕩的方法實現。通過重複的循環和改變清潔溶液，基本上清堵和淨化任何多孔基質通 道。使用定義的程序化的（可選的，預定義的、預程序化）清洗循環，優選用同時超聲處理 (concurrent sonication)(也稱為超聲轟擊）以達到植入物的穿透滅菌。應該相信，震蕩 液壓和超聲能量的組合加速了溶液互相滲透以及內源物質的去除。
[0023] 另外地，在處理中使用滲透梯度，其在組織內外產生流。這還稱為滲透循環（從低 滲溶液轉換至高滲溶液）。這是另一種方法，通過該方法可以有效中和、去除或基本減少骨 髓、血液、蛋白質、異種抗原和顆粒物質。
[0024] 優選的方法包括在清潔過程中使用運動學限制。將運動學限制（優選張力）施加 至植入物，而它與清潔劑（如，例如，去汙劑、醇、或過氧化物等）接觸可以生產更有效的清 潔，並且減少由於清潔劑引起的任何損害。
[0025] 優選的方法也可以包括將移植物的最終pH增加至鹼性水平（pH大於7,優選8左 右）的步驟。不希望被理論束縛，具有鹼性PH的軟組織移植物可以有助於移植物加強的愈 合。應該相信，至少部分是由於鹼性環境增加成骨細胞活性的事實。在一些實施方式中還 可以考慮，可以去掉增加 pH的步驟。沒有增加步驟的移植物的pH是在5與7之間、優選約 6〇
[0026] 優選的植入物在表現出至少一種異種抗原的約60%的受控下降，小於約10%的 胰蛋白酶消化，以及大於或等於約1800N的基於分選數據的預測的極限抗拉力（UTF)。
[0027] 在其他實施方式中，植入物表現出至少一種異種抗原的大於或等於約55%的受控 下降，小於約10%的胰蛋白酶消化，以及於大於或等於約2020N的基於分選數據預測的極 限抗拉力（UTF)。
[0028] 在一些實施方式中，本申請以有效和經濟的方式提供了用於生產安全和有效的軟 組織（優選異種移植物）的方法。在一些實施方式中，本申請提供了用於清潔、灌注或鈍化 植入材料的方法，同時，不危害起始植入材料的期望的生物學性能。在一些實施方式中，本 申請生產了降低的抗原性的植入材料，以及優選加強的生物活性的植入物。
[0029] 本申請的一個實施方式是包括用糖溶液處理的異種移植肌腱的異種移植肌腱植 入物，與可比較的同種異體移植植入物或自體移植植入物相比，其表現出加強的術後癒合 和/或強度。
[0030] 該異種移植植入物可以由大量可接受的異種移植來源獲得。例如，植入物可以是 牛來源的。植入物可以取自聖熱特魯迪斯牛（santa gertrudi s cow)中。
[0031] 異種移植肌腱可以選自存在於體內的多種不同的肌腱。例如，植入物可以包括 前伸肌腱（anterior extensor tendon)。例如，植入物可以包括指內伸肌（Extensor Digitorum Medialis)〇
[0032] 在植入前，異種移植肌腱可以表現出可以接受的pH。例如，在植入前，植入物可以 表現出pH為約8。可替換地，在植入前植入物可以表現出約8的pH。
[0033] 糖可以是任何可以接受的糖。這類糖的實例包括葡萄糖、右旋糖、結晶葡萄糖、醛 糖、酮糖、半縮醛、吡喃糖、呋喃糖、赤蘚糖、蘇糖、核糖、阿拉伯糖、甘露糖、阿洛糖、阿卓糖、 木糖、來蘇糖、古洛糖、艾杜糖、半乳糖、塔羅糖、蔗糖和果糖。
[0034] 在一個實施方式中，植入物表現出至少一種異種抗原的約60%的受控減少，小於 約10%的胰蛋白酶消化，和大於或等於約1800N的基於分選數據的預測的UTF。減少的異 種抗原可以是a-Gal。在可替換的實施方式中，植入物表現出至少一種異種抗原的約60% 的受控減少，小於約10%的胰蛋白酶消化，和大於或等於約2020N的基於分選數據的預期 的 UTF。
[0035] 本申請的一個實施方式是加工異種移植肌腱的方法，包括：從肌腱中去除異種抗 原，增強肌腱的強度、肌腱滅菌、化學漂洗肌腱、可選地分解來自肌腱的殘留的過氧化物以 及可選地提高（促進，promoting)肌腱的鹼性。這些步驟可以以這種順序或另外的順序進 行。
[0036] 該方法可以進一步包括一個或多個使特定的處理化學溶液接觸肌腱的步驟。
[0037] 異種抗原去除的一個階段或多個階段可以具有大於或等於約1的水與化學藥品 比率（WCR)。分子強度增強的一個階段或多個階段可以具有小於約1的水與化學藥品比率 (WCR)。滅菌的一個階段或多個階段可以具有小於或等於約1的水與化學藥品比率（WCR)。 整個方法可以具有大致約〇. 90的水與化學藥品比率（WCR)。
[0038] 本申請的一個實施方式是牛肌腱置換移植物（graft)，包括回收自以下的經加工 的（經處理的，processed)前伸肌腱：（1)純種的聖熱特魯迪斯（Santa Gertrudis)、婆羅 門（Brahman)、安格斯（Angus)(即，100%的這些中的僅一種）；（2)具有25%至100%的聖 熱特魯迪斯牛、婆羅門或安格斯或這些的組合的雜交種；（3)具有50%至100%的聖熱特魯 迪斯牛、婆羅門或安格斯或這些的組合的雜交種；或（4)包括選自聖熱特魯迪斯牛、婆羅門 或安格斯的至少一個祖先的任何雜交種；移植物回收自年齡在約18個月至約36個月之間 的、並且在回收前至少約200kg熱標準胴體重（HSCW)的動物。
[0039] 移植物可以用於人的前交叉韌帶（ACL)的置換。移植物可以是具有大於平均的天 然人ACL的失效強度的移植物。
[0040] 在一個實施方式中，前伸肌腱可以是指內伸肌（趾內伸肌，Extensor Digitorum Medialis) (EDM)。在一個實施方式中，動物的年齡可以是在約18個月和約24個月之間。在 一個實施方式中，回收前，動物是至少約295kg HSCW。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0041] 圖1示出了用於分選肌腱的單股相關性的計算方法。
[0042] 圖2示出了環狀植入物的拉力數據。示出了通過本申請的方法生產的肌腱，相對 於無菌處理的牛肌腱，相對於對比的人肌腱。
[0043] 圖3A-圖3C示出了 3個月的屍體解剖的，40x的不同組織。圖3A示出了，在狒狒 中植入後由本申請的方法產生的牛肌腱。圖3B示出了未處理的牛肌腱（對照）。圖3C示 出了用於比較的天然ACL。
[0044] 圖4A-圖4C示出了不同的組織學比較。圖4A示出了，在狒狒中植入後，通過本申 請的方法產生的牛肌腱（3個月，40x)。圖4B示出了用於參考的人胭繩肌腱自體移植（5個 月，200x (現有技術：Marumo 2005))。圖4C示出了狒狒天然ACL (40x)。
[0045] 圖5A-圖5F示出了用於比較的股骨隧道的不同的組織學切片。圖5A示出了在狒 狒中植入後，通過本申請的方法生產的牛肌腱（4x)。圖5B示出了指定區域的放大圖（20x)。 圖3C示出了用於比較的，3個月後的人自體移植400x(Scranton 1998)。圖示出了在狒 狒（IOx)中移植後，通過本申請的方法生產的牛肌腱。圖5E示出了指定區域（40x)的放大 圖。圖5F示出了用於比較的在6個星期的人自體移植400x(Scranton 1998)。
[0046] 圖6A-圖6F示出了用於比較的脛骨隧道的不同的組織學切片。圖6A示出了在狒 狒（4x)中植入後，通過本申請的方法生產的牛肌腱。圖6B示出了指定區域（20x)的放大 圖。圖6C示出了用於比較的，在3個月的的人自體移植400x(Scranton 1998)。圖6D示出 了在狒狒（4x)中植入後，通過本申請的方法生產的牛肌腱。圖6E示出了指定區域（40x) 的放大圖。圖6F示出了用於比較的在6周的人自體移植，400x(Scranton 1998)。

【具體實施方式】
[0047] 一方面，本申請涉及包括用於在人體植入中使用的軟組織的植入物領域。優選從 異種移植物來源獲得本申請的軟組織植入物。本申請提供了用於加工植入物材料的新方 法，包括，但不限於，自體移植、同種異體移植或異種移植材料，包括骨和軟組織，優選軟組 織，如韌帶或肌腱。具體地，根據本申請的方法處理的異種移植軟組織材料允許移植物被充 分地清潔、機械製造/成型/修整、滅菌、包裝隨後以迄今不可能的經濟的尺度植入。進行外 來異種抗原的充分清除，使得本申請的植入物一旦置入，不會被人體強烈排斥。本申請的異 種移植軟組織植入物提供了足夠的結構、機械和/或生化完整性以作為，如ACL置換使用。 這些植入物具有用於增強的機械性能和增強的癒合性能的潛力（相比現有ACL移植選擇）。 術語"移植物"和"植入物"在本文中可互換地使用。
[0048] 如本文使用的，術語"鈍化"意在涉及從植入物中去除潛在的致病生物和免疫原物 質。因此，該術語意指無菌度和下降的抗原性二者，雖然該術語並不旨在排除植入物的有益 的生物學性能，如成骨性能（骨傳導和骨誘導；骨融合），天然組織功能，以及植入物的期望 的結構強度。術語"鈍化"優選是指術語"滅菌"，因為當滅菌是目標時，該術語具有絕對的 含義，於其而言，確定性測試的能力由進行這類測量的技術狀態和/或由對於伴隨的組織 破壞的需要限制。此外，雖然根據本申請的方法生產的植入物可能並不完全沒有任何抗原 性或致熱源性，但是極大地降低了這些不需要的方面，而這也是如本文使用的術語"鈍化" 意指的。
[0049] 如本文使用的術語"生物惰性"意指不被宿主身體排斥或強烈攻擊的鈍化的植入 物。
[0050] 如本文使用的術語"生物活性"意指具有改善的癒合、重塑和/或結合的植入物或 組織，其相比非生物活性的植入物或組織，以更高的速率，更快，具有更高的質量或具有更 高的堅固性（robustness,魯棒性）表現出至少一種或多種癒合或生長現象。
[0051 ] 如本文使用的，術語"灌注的"或"灌注"旨在暗示將清潔溶液充分互相滲透進入 並且穿過旨在用於植入受體的材料的通道和裂縫。
[0052] 如本文使用的，術語"快速"或"快速地"，如它們應用至根據本申請的壓力循環的 方法時，是指秒到分，而不是小時或天的數量級的時幀。
[0053] 如本文使用的術語"超聲"或"超聲處理"是指在允許超聲能量充分轉移至植入物 的條件下，在根據本申請的方法進行加工時，通過植入物的容器應用超聲或超聲能量。也稱 為超聲轟擊。超聲能量可以穿過液體轉移至工件，使得達到充分的清潔和細菌或細胞破壞， 而不導致對工件的整個超結構損害。
[0054] 如本文使用的"軟組織"是指除了骨以外的任何生物組織，包括但不限於，肌腱、韌 帶、筋膜、全部關節、硬腦膜（dura)、皮膚、心包膜、心臟瓣膜、靜脈、神經組織、黏膜下層組織 (submucosal tissue)(例如，腸組織）和軟骨。
[0055] 本文描述的"軟組織"典型地是膠原材料，其是自體移植物、同種異體移植物或異 種移植物，優選異種移植物。軟組織可以是預定長度的肌腱、相同或不同長度的肌腱束、預 定長度的韌帶、相同或不同長度的韌帶束、一段或多段心包膜、真皮、筋膜、硬腦膜、皮膚、粘 膜下層組織（例如，腸組織）、軟骨或它們的組合。優選地，軟組織的來源是異種移植肌腱。
[0056] 如本文使用的"植入物"（或"移植物"）是指認為其植入人或動物是有益的任何 材料。因此，植入物可以是組織衍生的材料，如骨、皮膚等，或它可以是可能需要清潔、滅菌 或鈍化的具有外表面和內部結構的金屬或合成材料。植入物可以包括自體移植組織、同種 異體移植組織、異種移植組織或它們的組合，並且，對於礦物化組織，如骨，植入物可以包括 礦物化組織、部分去礦物化組織、完全去礦物化組織和它們的組合。植入物可以包括單一的 或整體的移植物材料，組裝的骨材料，如在美國專利申請序列號09/782, 594和09/941，154 中描述的那些，成形的植入物，如在美國專利號6, 440, 444和6, 696, 073中描述的那些，以 及同種異體基因生物相容基質，如在美國專利申請序列號10/754, 310和10/793,976中描 述的那些。本發明的方法和設備也可以在美國專利號D461，248、6, 290, 718、6, 497, 726、 6, 652, 592、6, 685, 626和6, 699, 252中描述的那些植入物的處理中使用。全部的前述專利 和專利申請通過引用結合於此。
[0057] 根據定義，"肌腱"是膠原束，其通常將肌肉的起點連接至骨。根據定義，"韌帶"是 膠原組織的帶，其連接骨或支撐內臟。然而，某種程度上這類術語在植入物領域可互換使 用，而且對於肌腱的引用，還旨在包括韌帶的使用。
[0058] 雖然僅包括軟組織的移植物是優選的，但是還包括包含軟組織和骨的植入物，如 骨-肌腱-骨移植物。骨-肌腱-骨-移植物包括一個或多個骨塊以及附接至一個或多個 骨塊上的肌腱（或韌帶）。還包括了本申請的某些方面應用至骨或硬組織移植物。本申請 的某些方面可以進一步適用於包括化合物組織、全關節和器官的更複雜的結構。
[0059] 提供了新的方法用於加工包括軟組織的植入物，其包括但不限於，骨和軟組織、礦 物質化或去礦物質化的組織和包括前述組織類型的組合。具體地，根據本方法處理的軟組 織允許軟組織充分地清潔、滅菌和/或鈍化，沒有對軟組織過度的結構或化學損傷。雖然同 種異體移植或自體移植軟組織可受益於根據本發明方法的加工，但異種移植軟組織因其高 可用性和低成本而是優選的。
[0060] 在這種用於生產在人體中是安全和有效的異種移植物的新方法中，本申請提 供了特定的步驟以有效去除外來異種抗原。來自包括外來表位，特別是包括但不限於， Galal-3Gal_l-4GlcNAc-R(常稱為α-gal)的異種來源的移植物，一旦植入，通常被人體 強烈排斥。本發明的發明人已經確定了從異種移植軟組織植入物中受控的去除α-gal(和 其他外源表位）的重要因素之一是在加工中滲透梯度的受控且集中的使用。
[0061] 本發明人已經確認了製造有生存力的異種軟組織植入物的重要步驟之一是使用 至少一個碳水化合物處理的步驟，優選使用葡萄糖溶液處理。異種移植軟組織的葡萄糖的 處理允許非酶糖化（glycation)。不希望被理論限制，應該相信，糖化生產"硬化"或"強化" 的組織，這在整個清潔過程中對允許組織保留其機械強度和結構是有益的。本發明人已經 確定如果不進行葡萄糖處理，膠原在相對短的持續（約小於6分鐘）時間內對於化學攻擊 是敏感的。在一些實施方式中，沒有葡萄糖以及糖化現象，在清潔/鈍化過程中肌腱可能不 會完全存活（即，失去結構完整性）。對於最初葡萄糖步驟的暴露持續時間，提供給組織最 少約70分鐘並且上達至90分鐘或更多的暴露時間，對於所使用的濃度是有效的。
[0062] 另外，在該方法中使用了在組織內外產生流的滲透梯度。這還稱為滲透循環（從 低滲溶液轉換至高滲溶液）。作為非限制性實施例，清潔溶液可以從DI水循環到生理鹽水 並且回到DI水。這也可以表達為水與化學藥品比率（WCR)。WCR是指在整個方法中，全部 暴露於DI水相對於暴露於化學藥品和化學藥品混合物（包括生理鹽水）。該參數提供了與 去除異種抗原以及去除生物負擔是相關的全面的方法梯度。取決於整個方法中設定的步驟 的預期的行為，WCR值設定在不同的水平。最佳使用1. 5至2的數量級的值以從植入物中 去除不需要的材料。然而，如果參數設置過高則可以對植入物結構產生有害作用。在一些 實施方式中，優選設置是〇. 6至1. 05之間以在給定的加工步驟中平衡競爭的設計說明。
[0063] 對於真空壓力對正壓力的總暴露可以以真空對壓力比率（VPR)的方式定義，還發 現其是對於去除植入物中不需要的材料的重要因素。VPR還對植入物的機械性能有影響。 在4的數量級的值對於改善植入物張力（strain)和極限延長（增加）具有有益的作用，同 時還防止膠原組成的分子損傷，這將使得植入物在植入後更容易受到酶降解。然而，如果設 置過高，該參數可以影響可以從植入物中去除不需要材料（即，異種抗原）的相對效率。在 一些實施方式中，優選的設置是位於1. 90和2. 40之間以平衡競爭設計說明。
[0064] 通常，WCR如下計算：
[0065] 在組織僅暴露於DI水的過程中的總時間=水暴露（分）
[0066] 在組織暴露於任何其他化學藥品或化學藥品的組合而不是水（對於該計算，認為 鹽水是化學藥品）的過程中的總時間=化學暴露（分）
[0067] "水暴露" / "化學暴露" =WCR
[0068] 可以對整個過程計算該比率，也可以在每個過程步驟計算。如本文使用的，過程步 驟表示意味著在最終產品中產生特異性設計特性的配方區域（recipe region)。每個過程 步驟包括多個過程階段或由它們組成。每個階段由在指定的條件，如接觸時間、溫度、壓力、 真空、壓力循環和超聲下暴露至組織的特定化學溶液組成。
[0069] 高的WCR表明在整個過程中或在過程的特定步驟中，水暴露比化學劑暴露更多。 例如，2的值將表明對於給定的步驟或對於整個過程，存在比化學多達2倍的水暴露。已經 測定WCR對全部的利益因素具有大的影響（如，a-gal去除，強度等），並且還對變化非常 敏感。在一些情況下，在說明中的重要的區別、產率等可以通過改變該參數少至約0.01單 位達到。這表明流體運動（即滲透循環）在該過程中是非常重要的以達到期望的植入物屬 性。
[0070] 已經在相關的a -gal去除中觀察到WCR的重要作用。在高比率（如，1. 5至2. 0 或更高）時，它改善a-gal的去除，但更高的值傾向於"弱化"肌腱。在低值（如，小於1. 0) 時，具有殘留化合物毒性水平的可能性增加。因此，整個過程中，對於本申請的某些實施方 式，WCR優選設置在約1.0。
[0071] 一般地，VPR如下計算：
[0072] 在組織暴露於真空的過程中的總時間=真空暴露（分鐘）
[0073] 在組織暴露於壓力的過程中的總時間=壓力暴露（分鐘）
[0074] "真空暴露" / "壓力暴露" =VPR
[0075] 也在每個過程步驟計算該比率。高的VPR值表示相比壓力暴露，存在更多的真空 暴露（對於整個運行或對於特定的步驟）。發現該參數不僅影響機械特性還影響a -gal的 去除。
[0076] 在清潔、滅菌和/或鈍化包括軟組織的植入物中可以採用前述方法。前述方法通 常將包括在可選的超聲處理下，在清潔劑和植入物接觸期間，通過循環上升和/或下降的 壓力用清潔劑灌注植入物。此外，在該過程期間使用在組織內和組織外產生流的滲透梯度。 在優選的實施方式中，包含要處理的植入物的處理室用清潔劑填充（通常提供作為包含某 種濃度的清潔劑的溶液）。當植入物浸入清潔劑溶液中時，在清潔劑與植入物接觸期間，處 理室中的壓力循環地增加和下降，可選地用並存的超聲。通過循環增加和降低壓力，使清 潔劑灌注至植入物。因此，在各階段內或各階段之間、在各步驟內或各步驟之間以及貫穿整 個過程，通過壓力循環的速率、循環的事實和壓力循環的幅度，以及進一步通過WCR和PVR 比率的大小、這些比率的變化和這些比率的排序，實現植入物或其部分的深度的、穿透的清 潔、滅菌和/或鈍化。因此，整個過程可以成功地在一個大氣壓之上或之下的壓力下成功地 進行。優選地，整個過程在室中進行，該室在整個過程中或過程的特定階段允許其內含物的 超聲處理。此外，優選地，整個過程在電腦的可編程系統或可編程邏輯電路控制下進行整個 過程，使得手動加工最小化並使加工的可再現性最大化。其中，經加工的組織是任何形式的 同種異體移植或異種移植組織，適當溶劑的選擇具有的另外的優點是，與如果不包括這類 處理相比產生甚至更低抗原性的經加工的組織，在一些實例中可以具有增強的強度、硬度 或其他機械性能以及增強的癒合、重塑或其他生物或生化性能的另外優點。
[0077] 當採用循環的壓力時，升高的壓力可以高達高於環境壓力約200磅每平方英寸 (PSI)，可替換地高於環境壓力約150 PSI、可替換地高於環境壓力約100 PSI，並且可以低 至高於環境壓力約75 PSI、可替換地高於環境壓力約50 PSI、可替換地高於環境壓力約25 PSI、可替換地高於環境壓力約15 PSI、可替換地高於環境壓力約5 PSI。通過該方法可以預 期更高的壓力，雖然避免由於這類壓力導致的設備故障或組織損傷的壓力是合乎需要的。 該下降的壓力或真空可以高至約環境壓力，可替換地低於環境壓力約4 PSI、或可以低至低 於環境壓力約8 PSI、可替換地低於環境壓力約12 PSI、可替換地低於環境壓力約14 PSI、 可替換地低於環境壓力約14. 7PSI。如上面指明的，任何高壓和低壓可以結合以限定一系 列壓力，只要選擇的最小值等於或小於選擇的最大值。術語環境壓力適用於該方法進行的 地點的標稱大氣壓或任何合適的參考壓力，對於該方法給定的實例，該參考壓力可以作為 參考用於反應室內壓力的測量。當使用快速循環增加的或降低的壓力時，壓力循環的速率 可以是至少約1秒，可替換地至少約2秒、可替換地至少約5秒、可替換地至少約10秒、可 替換地至少約20秒、可替換地至少約30秒、可替換地至少約50秒、可替換地至少約60秒、 可替換地至少約120秒、可替換地至少約180秒、可替換地至少約240秒。當使用快速循環 的壓力時，壓力循環的速率可以是最多約5分鐘、可替換地最多約4分鐘、可替換地最多約 3分鐘、可替換地最多約2分鐘、可替換地最多約110秒、可替換地最多約100秒、可替換地 最多約90秒、可替換地最多約60秒、可替換地最多約45秒、可替換地最多約30秒、可替換 地最多約20秒、可替換地最多約10秒。如上面指明的，任何最大和最小速率可以結合以限 定一系列的速率，只要選擇的最小值小於或等於選擇的最大值。
[0078] 在一個大氣壓之上或之下的壓力下可以成功進行處理過程。25英寸汞柱（約 85kPa或約12. 5PSI)和室中溶液的蒸汽壓之間的排空壓是適當的。約40和100PSI之間 (約276kPa和690kPa之間或約80和200英寸汞柱之間）的後填充壓是合適的。在美國專 利號6, 482, 584、6, 613, 278和6, 652, 818中描述了快速循環的壓力的使用；每篇均頒發給 本受讓人，並且每篇都通過引用結合於此。
[0079] 在一個實施方式中，整個過程在處理室中進行，該處理室在整個過程中或過程的 特定步驟中允許其內含物的超聲處理。此外，優選地，整個過程在電腦的可編程系統中或可 編程邏輯電路控制下進行，使得手動加工最小化並且使加工的可再現性最大化。在植入物 置於處理室後，用清潔溶液將室填充至充分浸沒溶液中的植入物的水平（雖然在室內保留 了一些預留空間以促進快速的壓力循環）。
[0080] 本方法包括用於異種移植軟組織處理的清潔劑的新的順序。在本方法優選的實 施方式中，一種或多種清潔劑與包括軟組織的植入物接觸以中和、去除或基本減少血液、月旨 肪、細胞、蛋白質、抗原、細菌、病毒、真菌或其他材料。在美國專利號6, 482, 584、6, 613, 278 和6, 652, 818中描述了某些清潔劑（和使用這些清潔劑的方法），其全部通過引用結合於 此。清潔劑包括但不限於，去汙劑、消毒劑（有時稱為消毒試劑）、淨化劑（有時也稱為淨化 試劑）、抗生素、殺病毒化合物等。可以使用特定的試劑（如碳水化合物）以增強組織性能 和/或用於組織保護。另外，可以使用高滲溶液或低滲溶液以建立滲透梯度。
[0081] 可以以溶液或其他混合物的形式提供清潔劑。優選，清潔劑作為水溶液（優選使 用DI水）提供。例如，可以使一種或多種以下清潔劑與包括軟組織的植入物接觸：包含任 何氧化殺菌劑（例如過氧化氫），一種或多種去汙劑，鹽水，碳水化合物，與水混溶的醇，如 乙醇或異丙醇，碳酸氫鈉和/或它們的組合的溶液。
[0082] 用於本方法中使用的合適的醇包括甲醇、乙醇、丙醇（包括異丙醇）和丁醇（包括 異丁醇和叔丁醇）。異丙醇是目前優選的。以溶液或混合物提供醇，具有按重量計（wt%) 約0. 1 %至約100 %，可替換約5 %至約95 %，可替換約20 %至約90 %的優選的濃度範圍。 優選的醇是具有低分子量（例如，在約32g/mol至約360g/mol的範圍，可替換地具有分子 量等於或小於約61g/mol、可替換地約90g/mol、可替換地約120g/mol、可替換地約240g/ mol、可替換地約360g/mol的醇）和/或具有低於本方法使用的實施方式的操作條件下的 熔點的那些。可以期望可以使用其他保護試劑代替醇，例如多元醇。優選的多元醇是具有 相對低的分子量（例如，從約32g/mol至約360g/mol範圍）的那些。
[0083] 在本方法中使用的氧化滅菌劑包括過氧化物、氧化物、次氯酸鹽，過羧酸和臭氧。 用於在本方法中使用的優選的過氧化物是過氧化氫。可以以溶液或混合物提供氧化滅菌 齊U，具有優選的按重量計（Wt% )約1%至約15%的濃度範圍。
[0084] 碳水化合物（或通常稱為"糖"）可以是二糖或單糖或更複合糖。例如，那些可以 在本方法中使用的包括，但不限於，葡萄糖或右旋糖或結晶葡萄糖或醛糖或酮糖或半縮醛 或吡喃糖或呋喃糖或赤蘚糖或蘇糖或核糖或阿拉伯糖或甘露糖或阿洛糖或阿卓糖或木糖 或來蘇糖或古洛糖或艾杜糖或半乳糖或塔羅糖。也可以考慮二糖（如蔗糖或果糖）。優選 的是葡萄糖。可以考慮"D"糖（天然存在的）以及"L糖"，"D"構象是優選的。
[0085] 可以以溶液或混合物提供碳水化合物，具有按重量計（wt % )約40 %至約50 %的 優選的濃度範圍。使用DI水作為溶劑，優選45wt %。可替換地，碳水化合物濃度是可預期 的，包括更低的濃度如，20 %或30 %和更高的濃度如55 %、57 %、60 %或70 %。在某些優選 的實施方式中，約40至50wt %之間的過飽和葡萄糖溶液是優選的。當飽和溶液的條件變化 時，例如升高溫度、降低飽和液體的體積（如通過蒸發），或升高壓力，製備或得到過飽和溶 液。
[0086] 在方法中使用的鹽水溶液包括但不限於有機和無機鹽溶液。無機鹽的實例是熟知 的，並且包括但不限於，NaCl、NaF、NaBr、KC1、KF和KBr。有機鹽的實例包括但不限於乙酸 鈉（CH 3COONa)、檸檬酸鉀（C6H5K3O7)、乙酸銨（NH 4+CH3C00_)、乳酸鈉（NaC3H5O3)或由有機羧酸 與無機鹼的反應產物得到的其它鹽。考慮用於與本申請使用的鹽度的濃度範圍為約〇. 6% 至35%。特定的實施方式可以使用27%的鹽水，其他實施方式可以使用5. 9%的鹽水，其他 實施方式可以使用0.7%的鹽水，其他實施方式可以使用0.9%的鹽水，其他實施方式可以 使用1%的鹽水，其他實施方式可以使用6%的鹽水，其他實施方式可以使用10%的鹽水， 其他實施方式可以使用20%的鹽水。
[0087] 在本申請方法的一些實施方式中還使用碳酸氫鈉 （Sodium bicarbonate or sodium hydrogen carbonate)(通常為小蘇打；化學式NaHCO3)。碳酸氫鈉是結晶的白色 固體，但通常作為細粉末出現並且在水中是可溶解。它通常也被稱為麵包蘇打、烹調蘇打 和小蘇打。在口語的使用中，它的名稱簡稱為碳酸氫鈉鹽（sodium bicarb)、碳酸氫鹽蘇打 (bicarb soda),或者乾脆是碳酸氫鹽（bicarb)。
[0088] 可以製備包括非離子去汙劑、陰離子去汙劑或二者的去汙劑溶液。考慮用於本申 請的方法中使用的非離子去汙劑包括，但不限於，醇乙氧基化物、烷基酚乙氧基化物、烷基 多糖苷、聚氧乙烯醚、聚氧乙烯山梨糖醇、或任何的Triton?, Tween?或Brij?系列去汙 齊U (如Triton? X-100)。考慮用於本申請的方法中使用的非離子去汙劑包括但不限於烷 基苯橫酸鹽、燒基橫酸鹽、燒基憐酸鹽或燒基硫酸鹽，如十-燒基硫酸納鹽、十四燒基硫酸 鈉鹽、十六燒基硫酸鈉鹽、固醇（steryl)硫酸鈉鹽和油基（oleyl)硫酸鈉鹽（例如，十二燒 基硫酸鈉 （SDS ;也稱為SLS))。Triton? X-100和SDS(SLS)是優選的。已經使用Triton? X-100和SDS處理骨和軟組織許多年。（參見例如，美國專利號4, 801，299)。使用的濃度是 按重量計約0. 5或1% (wt% )，雖然可以使用其他的濃度，例如約0. 1至10wt%之間。還 可以混合去汙劑與過氧化物用於更有效的清潔。
[0089] 十二燒基硫酸鈉（SDS或NaDS)，也被稱為月桂硫酸鈉 （sodium Iaurilsulfate或 sodium lauryl sulfate) (SLS)是具有式CH3 (CH2)11OSO3Na的有機化合物。它是在許多清潔 和衛生產品中使用的陰離子表面活性劑。該鹽是由連接至硫酸根基團的12-碳尾（tail) 組成的有機硫酸鹽，給予材料去汙劑需要的兩親的性能。Triton X-IOO(C14H22O(C2H4O) n)是 非離子表面活性劑，其具有親水的聚氧化乙烯鏈（它平均具有9. 5個氧化乙烯單元）以及 芳族烴親脂或疏水集團。該烴基是4-(1，1，3, 3-四甲基丁基）-苯基基團。這涉及去汙劑 的普郎尼克範圍。普郎尼克是氧化乙烯和氧化丙烯的三嵌段共聚物。形成自氧化乙烯的部 分比形成自氧化丙烯的部分更親水。Triton? X-100也是通常使用的去汙劑。
[0090] 優選的特定的清潔劑是過氧化氫、異丙醇、Cali mu lse? SLS、Triton? X-100 (TNBP)、氯化鈉溶液、葡萄糖和NaHC03。
[0091] 不希望受制於特定的理論，相信在一些實施方式中，碳水化合物，優選葡萄糖的處 理，提供給移植物分子強度。通過非酶解糖化，膠原輕微反應。該"老化"組織的步驟使得 它在生化上更成熟，同時在後續步驟中還保護它免於化學分解。使用過氧化物和去汙劑，以 及鹽水處理用於異種抗原的去除。通過空化、化學分解和滲透梯度，從組織從去除不需要的 抗原和細胞。通過暴露於氧化劑和去汙劑下滅菌，連同空化使任何外來生物負荷變形，隨後 從組織中洗出。醇處理改善了機械強度（主要增加剛度）。化學藥品漂洗（如，水）用於 膨脹組織以去除並稀釋之前步驟留下的殘留化學藥品。可選地，進行分解殘留過氧化物的 步驟。在該步驟中可以加入小蘇打（NaHCO 3)以便活躍地降解過氧化物的超氧化物鍵。小 蘇打將移植物的最終PH從酸性增加至鹼性。在一些實施方式中，最終pH是約8,可替換地 至少約7. 0,可替換地至少約7,可替換地至少約7. 5,可替換地至少約8. 5,可替換地至少約 9。但不希望受到理論束縛，移植物的鹼性pH還有助於增強移植物的癒合。應該相信由於 這個事實，即鹼性環境增加了成骨細胞的活性。
[0092] 然而，中還考慮在一些實施方式中可以刪除上面增加 pH(和/或分解過氧化物的 超氧化物鍵）的步驟。沒有增加步驟的移植物的PH是在5與7之間、優選約6。
[0093] 本方法可以包括用試劑處理植入物的一個步驟或多個步驟，該試劑能增加用於加 工的組織的表面面積（如，通過膨脹該組織）。例如，可以在期望的PH下用溶液處理組織， 和/或可以在一個或多個加工時期維持期望的pH。
[0094] 另外，根據本發明的技術，在清潔試劑應用至軟組織之前、之間和/或之後，軟組 織由張力運動學地限制（kinematically restrained)(如下面描述的）。運動學限制可以 作為單個限制或作為多個限制應用。運動學限制可以以常態的方式或可變的方式應用，例 如穩定的狀態或時間變化的方式。
[0095] 更具體地，用包括軟組織的植入物裝載可加壓處理室，可選地，將壓力施加至軟組 織。將進一步理解，植入物可以包括單獨的軟組織或軟組織和骨和/或合成材料的組合。 [0096] 將清潔劑引入至處理室。通常將足量的清潔劑引入以浸沒植入物（換言之，該植 入物浸沒在清潔劑中）。在清潔劑以及可選地超聲的存在下，使用升高的和下降的壓力的一 系列的"η"循環將清潔劑壓入植入物基體。植入物的基體通道（包括軟組織的內部）被重 復填充並排空清潔劑，以及振蕩壓力的結果是將組分去除。該步驟循環的次數可以是1至 約150次（其中，η = 1-150)可替換地，約10至約50次，可替換地約2至約30次）。
[0097] 清潔劑在此接觸的合適的溫度部分取決於清潔劑及其濃度。在一些實施方式中， 轉移溫度設置在20°C，並且不進行液體的主動加熱。化學藥品流/超聲的行為可以將試劑 "加熱"至高達39°C。通常處理室溫度在約27至35°C之間。在一些實施方式中，更高的溫 度（40°C及以上）可以開始使組織的化學性能退化。對於肌腱，50°C及以上可以開始使組織 的結構退化。
[0098] 在不同的階段，清潔劑可以與植入物接觸合適的時間段，例如，約1分鐘至約150 分鐘；可替換地，約4分鐘至約60分鐘；可替換地，約60分鐘至約130分鐘。前述時間段可 以是連續的分鐘，或它們可以被植入物與其他清潔劑、漂洗液、或其他溶液接觸的時間段分 隔或間隔開。雖然壓力處理是優選的並且壓力循環是特別優選的，但還考慮本方法可以應 用於在恆定的壓力，如環境壓力、升高的壓力或下降的壓力或真空下處理組織。
[0099] 作為本申請的另外的方面，提供方法和設備用於將運動學限制（包括張力、壓縮 或固定）施加至植入物，特別是施加至包括軟組織，如肌腱的植入物。已經發現，當包括軟 組織，如肌腱、骨-肌腱-骨移植物和其他軟組織的植入物進行包括與一種或多種清潔劑接 觸的處理過程（例如，清潔、鈍化、和/或滅菌）時，在處理過程的至少一個或一些部分期 間，對移植物的損害（特別是對軟組織的損害）可以通過將張力施加至植入物（特別是軟 組織）降低。通過將運動學限制，如張力，施加至軟組織，由該處理方法（或它的一個或多 個單獨的步驟）引起的損害可以降低、最小化或排除。此外，將張力施加至軟組織可以改善 處理過程的有效性和一致性。
[0100] 用於骨和軟組織植入物的常規的加工方法包括，例如在美國專利號：5, 333, 626、 5, 512, 662、5, 556, 428、5, 769, 893、5, 797, 871、5, 976, 104、6, 024, 735、6, 293, 970 中描述的 那些，其全部通過引用結合於此；以及其他的專利和出版物。在常規的方法中，包括軟組織 的植入物經受處理室，而沒有植入物的張力處理或植入物的運動學限制。在這類常規方法 中，在該方法中的軟組織的定位和定向可以通過在該過程中使用的清潔劑、工具和方法改 變。該改變的定位或定向可以導致不同的植入物樣品之間的不一致性，因為不同的植入物 樣品可以具有不同的對清潔劑的暴露（例如，因為重疊的組織或包裹它們周圍的組織）。同 樣，可以發生不一致的清潔和清潔試劑進入單個組織，因為組織的一個區域可以過度暴露， 因為它在外部，而組織的另一區域成團狀，捕獲或不恰當地限制在內部，接受了少量的對清 潔劑的暴露。由於與軟組織使用常規的滅菌方法可以產生的另一問題是軟組織可能萎縮， 導致不期望的外觀和結構改變，其可以隨後導致過多的術後鬆弛。而在軟組織處理的另一 關注是過多的術後炎症。組織炎症可以通過不同的清潔劑與血液、脂肪、或軟組織內的其他 材料的相互作用引起。例如，過氧化物與內源材料的反應可以引起組織膨脹並導致組織損 傷。這些反應通常稱為發泡反應，如在過氧化物局部應用至傷口表面所觀察到的。對癒合 過程有害的水平的過氧化物反應剩餘的副產物最終可以導致術後炎症反應。當組織未被拉 伸時，（如果在處理期間未被限制）發泡反應可以引起更多傷害，由於泡沫和副產物更有可 能在組織內被捕獲。
[0101] 本發明方法可以降低、最小化或排除一個或更多前述問題。在處理過程期間，使用 清潔劑通過將張力施加至包括軟組織的植入物，可以以期望的方式維持軟組織在室中的定 位，並且清潔劑不可能用足夠的力施加以改變定位。因為清潔劑更均勻並更可預測地接觸 植入物（特別是軟組織），在不同的植入物之間和單個植入物內具有更好的一致性。軟組織 將具有更小的萎縮傾向，並且因此將具有更小的產生不期望外觀的植入物的可能性。通過 在處理過程中將張力施加至軟組織，可以降低來自內部發泡反應的炎症和損傷，因為在拉 伸組織外部存在發泡反應的機會更大，而不是保留在組織內以引起更多的損傷。另外，在加 工期間施加的張力將保護移植物免受術後鬆弛，在常規加工期間，術後鬆弛可以由移植物 的收縮和萎縮引起。
[0102] 期望提供的用於施加運動學限制的設備具有很少的部件，容易使用並且可以經受 遇到化學藥品和環境。對於設備不期望具有過量的約束和致動的部件。此外，設備應該由能 夠經受使用和清潔環境的材料製造。例如，期望的設備能夠經受具有約120°c (約250° F) 的區域的溫度的高壓釜中的溫度。在高壓釜中，蒸汽應當接觸並滅菌設備的各種部件。因 此，如果設備具有大量的工件、螺釘、急轉彎或小零件，不太肯定該高壓釜可以充分滅菌設 備的所有的部件，使得它可以再次使用。
[0103] 用於施加運動學限制的設備應該設計成將大部分或基本上全部的組織暴露於處 理過程中使用的清潔劑。或在處理過程中，通常期望使設備覆蓋大量的組織，或者限制清 潔或漂洗溶液的流。設備不僅在用於清潔、鈍化、和/或滅菌植入物的過程中有用，而且也 可以有用並適於在貫穿以下的一個或多個步驟中給植入物提供運動學限制：回收、加工、包 裝、運輸、儲存、植入物的術前製備、植入物的術中製備、以及植入物的術中處理。
[0104] 因此，組織張力應該設計成在一個或多個以下範圍中施加一定量的張力。用於組 織張力裝置（tissue tensioner)的材料應該是強勁的、生物惰性的（換言之，它們不與生 物組織相互作用）並且能夠經受預期用於它們的使用和清潔的化學藥品和溫度環境。用於 組織張力裝置的合適的材料包括（但不限於）聚合物、陶瓷，和非腐蝕金屬。優選的金屬包 括不鏽鋼、鈦、和合金，如鎳類合金、或通過用鎳或鉻鍍鋼獲得的材料。在一個優選的實施方 式中，張力裝置的所有部分由合適的廉價滅菌材料，如不鏽鋼、或其他常見的金屬板，或塑 料製作，使得張力裝置可以在貫穿加工、包裝、運輸、儲存、和術前準備的一個或多個步驟中 伴隨移植物。
[0105] 當將張力施加至牛異種移植肌腱軟組織植入物時，施加至肌腱的張力的量期望是 約60-75磅的力之間（約267至約334牛之間）。
[0106] 肌腱是堅韌的纖維結締組織帶，其通常將肌肉連接至骨，並且能夠承受張力。肌腱 與韌帶和筋膜相似，因為它們都是由膠原製造的，除了韌帶是將一塊骨連接至另一塊骨，而 筋膜是將肌肉連接至其他肌肉。肌腱是粘彈性的結構並且充當中間體以驅動從肌肉到骨的 傳輸。當拉伸時，肌腱具有軟組織機械行為。多個研究已經證明肌腱對生長以及重塑過程 中的機械負荷做出反應，非常像骨。不希望被理論束縛，應該相信在處理期間的肌腱的張力 允許組織的加工處於其更"自然的狀態"並且允許更有效的清潔以及保存它的機械結構。設 置使用的張力的量使得隨著時間的鬆弛（同時在張力裝置中）最小化。優選的鬆弛量是在 約100N以下，更優選是在90N以下，並且優選在50N以下。保持在上面的鬆弛範圍允許更 有效的軟組織加工。
[0107] 本申請優選涉及設計自牛組織的用於ACL置換的軟組織植入物。在一些實施方式 中，這類植入物來自牛肌腱，優選地，肌腱來自動物的下肢（伸肌）。可替換地，可以使用來 自不同解剖位置和不同動物的肌腱、韌帶或其他軟組織。例如，來自牛或其他異種移植來源 的頭、頸、背、尾的肌腱。由本申請的處理過程得到的異種移植軟組織植入物比天然組織更 強健，不含生物負荷，並且在植入後比現有ACL選擇具有更快的結合。
[0108] 在某些實施方式中，本申請的異種移植軟組織植入物具有下列特徵：
[0109] 1.優異的強度：限定為比來自脛骨前肌的人體植入物更強健。
[0110] 2.生物相容性：限定為一旦植入沒有由於外來抗原引起的明顯有害的免疫反應 或排斥。
[0111] 3.滅菌：限定為足夠的生物負荷的減少以防止來自受體的不利反應。
[0112] 為了確保該過程去除"有生存力"的生物負荷，可以進行14天破壞性無菌培養。該 測試給出了關於滅菌度水平的保障。
[0113] 加工後，可以進行胰蛋白酶消化測試以測量"生物相容性"。該測量確保了一旦移 植物植入，它不會"立即"（一個月內）吸收和/或降解致使強度不夠。該值來自大鼠的研 究，其研究了具有不同的胰蛋白酶和膠原酶消化值的植入物的吸收。發現30%的值與通過 體內機制的不接受的植入物降解高度相關。發現3-5%的值與通過體內機制的可接受的植 入物的降解相關。
[0114] 在加工後，也可以進行過氧化氫殘留化學藥品分析。該測量可以確保一旦移植物 植入，它不會具有過氧化氫的細胞毒性水平。之前的研究表明該化學藥品對於具有>3ppm 的值的組織是有毒性的，不符合ISO 10993-5MEM洗脫測試。然而，由於該測試產生假陽 性結果的歷史性質，當施加至組織衍生的移植物時，在一些情況下可以認為大於或等於 IOOppm的結果是可以接受的。
[0115] 異種移植物的一個特徵是確定去除外來異種抗原。移除、中和、或基本減少外來的 表位，如Gal a l-3Gal_l-4GlcNAc_R(常稱為a -gal)和其他是非常重要的，因為人體具有 特異性靶向這類複合糖的抗體。包括該異種抗原的來自異種移植來源的移植物，一旦植入 就會被人體劇烈排斥。因此測定a-gal的去除。實驗性的狒狒的研究表明低至60%去除 的植入物不會被排斥。在該研究中使用了具有40%的去除的陽性對照，其確實引起了大量 的免疫反應。為了測定該去除，採用來自相同的經加工的植入物的平均2個樣品。在一個 實例中，發現大於或等於55 %的a -gal的平均去除與可接受的移植表現相關。應該注意去 除的百分比表示相對的不是絕對的a-gal的測量。
[0116] 不希望被理論束縛，應該注意一些殘留水平的a -gal實際上可以是有益的。如果 實體充分減少或變性，應該相信異種移植物（其重新合併入人類宿主）中的殘留a-gar'片 段"（或其他外來的表位）實際上可以增強癒合。在本申請的牛肌腱移植物中已經發現增 強癒合的一些證據（被組織學支持）。對於該增強的/加速的異種移植植入物的癒合的可 能的解釋與疫苗（最特異性的亞單位疫苗）的行為模式是相似的。這類疫苗通過將受體暴 露至感染性細菌或病毒的一部分而發揮作用。這些部分通常是相對感染性生物的非感染性 抗原，其可以引起免疫反應而不引起該疾病的不利反應。據信，相似的反應是通過本申請的 牛肌腱植入物引起的。在ACL置換後的癒合級聯的第一階段是"炎症"階段（Woo 2000和 Scheffler 1998)。據信，由於"鼓勵"抗原或者抗原組合（其有有害作用已經變得更良性） 的存在，已經加速該階段，然而這些抗原仍然存在以允許受體的反應。因此，在本申請某些 優選的實施方式中，具有以某種下降水平的部分或不完全移除的a-gal認為是生物活性 的，而不是簡單的生物惰性。
[0117] 對於ACL置換，優選的移植構型是環狀的2股移植物。在該構型中，不考慮環狀直 徑（LD)尺寸，異種移植植入物具有大於平均天然ACL的失效強度的98. 6%的概率（根據 Woo 1991，天然ACL強度=2160N)。本 申請人:收集的數據表明，本申請的代表性的異種移植 肌腱植入物的平均t = 0拉力（pull strength)是6061N。統計學上該值比在文獻中發現 的4股天然胭繩肌的平均值（4590N根據Hamner 1999)大1200N。參見圖2和實施例1。
[0118] 肌腱（或韌帶）是纖維移植材料，其難於緊握（grip)。因此，使用肌腱移植物的 問題之一是植入時如何固定肌腱。使用的一個解決方法是用具有某種齒或螺釘的構件"咬 住"肌腱，提供在平的表面上改善的緊握。用於這樣做的方法使用了擠壓螺釘，其朝著它植 入其中的骨隧道壁壓縮移植韌帶。
[0119] 螺釘可以由非吸收性生物相容材料製造，如不鏽鋼、鈦、鈷鉻-鑰合金或其他合 金。可以使用其他非吸收性生物相容材料，如聚醯胺、聚乙烯、聚乙烯醇、聚丙烯腈、聚四氟 乙烯、聚酯以及它們的組合。這些螺釘在一端也可以具有孔眼用於附著縫合線。
[0120] 也可以使用生物吸收性螺釘。生物吸收性材料的實例包括：聚丙交酯、聚（L-丙 交酯）（PLLA)、聚（D，L-丙交酯）（PLA)、聚（乙交酯）（PGA)、聚（L-丙交酯-共-D，L-丙交 酯）（PLLA/PLA)、聚（L-丙交酯-共-乙交酯）（PLA/PGA)、聚（乙交酯-共-三亞甲基碳酸 酯）（PGA/PTMC)、聚二噁烷酮（PDS)、聚己酸內酯（PCL)、聚羥基丁酸酯（PHBT)、聚（磷腈）、 聚（D，L-丙交酯-共-己內酯）（PLA/PCL)、聚（乙交酯-共-己內酯）（PGA/PCL)、聚（磷 酸酯）、聚酐、聚乙烯醇、親水性聚氨酯，及它們的組合。吸收性螺釘也可以由生物複合物制 作。生物複合材料結合生物陶瓷和生物吸收性聚合物，並且改變螺釘的吸收和癒合曲線。生 物陶瓷包括磷酸三鈣和羥基磷灰石。
[0121] 另一種固定方法是用紐扣和縫合線將移植物固定在骨隧道中。另一種方法是使用 十字銷連接，其以垂直的方式使十字銷穿過隧道，以及在一些實施方式中，移植物隨後連接 至十字銷或套在十字銷上。另一種方法是使移植物穿過骨隧道並且從後端出去，隨後將移 植物韌帶附接至隧道的外部（例如，用螺釘和/或墊圈和/或卡釘）。
[0122] 鉬織來源/規格
[0123] 在一些實施方式中本申請包括優選用於ACL置換的軟組織植入物，設計自異種移 植組織，其可以利用現有的規劃政策以便能夠控制組織材料來源。產品包括詳細的牛規格 以確保一致的原材料。異種移植物可以是豬、羊、平胸鳥、馬、凱門鱷、牛或任何其它合適的 動物來源。在某些實施方式中，異種移植物優選是牛。
[0124] 植入物可以來自牛肌腱，優選肌腱來自動物的下肢（伸肌），其具有貫穿整個組 織長度的緻密的結構。沒有BSE的一致的可靠來源的牛組織是優選的。優選移植植入物 回收自來自澳大利亞或紐西蘭的牛。根據世界動物健康組織（0ΙΕ)，澳大利亞國家沒有 BSE(澳大利亞政府農業，漁業和林業的部門，04--06/40((八1181:四1丨3116〇￥6^111161^〇6卩1:· of Agriculture, Fisheries and Forestry. DAFF06/4D))。因此，相對來自美國生養的牛的 BSE的風險，澳大利亞來源是優選的。在一些實施方式中，可以使用可替換的地點，只要由 OIE或其他合適的權威組織確認這類材料沒有BSE，並且結構上等效或合適。肌腱回收自牛 的下肢。在一些實施方式中，在人體中用於ACL置換的優選使用的牛肌腱如下：
[0125] 指側伸肌（趾側伸肌，Extensor Digitorum Lateralis) (EDL)
[0126] 指總伸肌（趾總伸肌，Extensor Digitorum Communis) (EDC)
[0127] 指內伸肌（趾內伸肌，Extensor Digitorum Medialis) (EDM)
[0128] 這些肌腱中的每個是前伸肌（anterior extensor)，其具有充足的長度用作ACL 置換移植物。來自牛的四條腿中的每條包括這3種肌腱（來自牛的前肢的肌腱由於通常的 屠宰技術被砍短了一點）。優選沒有刻痕、傷口或眼淚的組織。優選進行連接至肌腱的外部 結締組織的重要的去除。在一些實施方式的原材料中，優選的260mm的最小長度是合乎需 要的。該優選的最小長度考慮了在加工期間用於張力調整需要的長度，並且隨後生產至少 80_的環狀植入物。只要滿足長度要求，可以考慮使用其他肌腱。
[0129] 優選使用具有貫穿其長度的一致強度和質量的肌腱，優選牛指內伸肌（EDM)。在 加工前，低溫儲存肌腱。發現某些牛品種具有優選的長的以及強壯的肌腱。這些牛品種優 選包括（1)純種的聖熱特魯迪斯、婆羅門、安格斯（即，100%的這些中的僅一種）；（2)具有 25%至100%的聖熱特魯迪斯牛、婆羅門或安格斯或這些的組合的雜交種；（3)具有50%至 100%的聖熱特魯迪斯牛、婆羅門或安格斯或這些的組合的雜交種；或（4)包括選自聖熱特 魯迪斯牛、婆羅門或安格斯的至少一個祖先的任何雜交種。為達到肌腱的最佳的相對強度 和成熟度，動物重量（熱標準胴體重，HSCW)優選大於或等於約295kg。然而，在某些實施方 式中，牛的HSCW可以是小於或等於約266kg，以及低至約200kg。
[0130] 為確保加工後更高的產率，以及確保植入物與植入物機械強度上的小的變化，在 原組織植入物參數和極限抗拉強度（UTF)之間發展相關性。在一些實施方式中，發現預計 的2020N的UTF是合乎需要的。在其他實施方式中，任何大於1800N的值可以是合乎需要 的，並且超過1725N的任何值都是可接受的。由於在劇烈活動期間的推測的天然人體ACL負 載，已經報導超過1000N的任何值都是臨床上可接受的，以及由於在日常生活的正常活動 期間的推測的天然人體ACL負載，大於445N的任何值都是臨床上可接受的。（Noyes 1976)
[0131] 具體參考牛，來自更老的牛的肌腱（例如，超過約18個月齡的牛）是合乎需要的， 因為它們通常更大（大於橫截面（CSA))以及更成熟（更好的結構完整性）。然而，已經發 現BSE的發病率在"更老的"牛中更流行，因此必需進行平衡。在一些實施方式中，至少12 個月齡的動物是可以接受的，優選至少18個月齡，可替換約18至24個月之間，可替換約18 至36個月之間，可替換約24至30個月之間，可替換約30至36個月之間，可替換大於36 個月。已知在畜牧業中，通過分析動物牙齒的發展和其他因素確定動物的年齡。例如，發現 小於18個月齡的牛可能沒有恆切牙，而發現直到30個月齡的牛可能具有不超過兩個恆切 牙。發現直到36個月齡的牛可能具有多達4個恆切牙。因此，通過牙齒的出現測定牛的可 接受性。在一些實施方式中，具有2至4個之間恆切牙的牛是可接受的。
[0132] 至於動物重量，基於歷史產出率確定規格。優選的肌腱產率是約80%。這表示接 收的80%的原肌腱具有可接受的尺寸以生產具有2020N或更大的單股（single strand) UTF的肌腱。重量小於約295kg的牛可以極大降低產出率。用於分選的單股相關性公式如 圖1所示。由於例如因素，如液體含量和纖維結構的異質性，利用生物材料的工作的許多挑 戰是材料性能變化的可能性。為考慮這些變化，如圖1描述的，相關性的某些實施方式可以 包括因素，如環狀直徑、寬度和厚度，它們不僅僅是組織形態的簡單的總測量。沿著肌腱的 長度在6個點上測量主要的（寬度）和次要的（厚度）尺寸。使用標準肌腱墊鐵（sizing block)測量環狀直徑（LD)。肌腱形狀的限定包括來主軸（長軸，major axis)的6個測量 的主要平均值和來自次軸（短軸，minor axis)的六個測量的次要平均值。用雙腳規製作 的主軸測量是優選的，用落差計製作的次軸測量是優選（施加的重量約200-215克）。
[0133] 實施例
[0134] 實施例1
[0135] 在一個實施方式中，移植物使用牛肌腱來源，回收自澳大利亞牛，其具有貫穿植入 物全部長度的緻密結構。生產的異種移植物優選在8.0和11. 5mm之間的環狀直徑（LD)尺 寸並且具有約270mm的平均長度。下表（表1)總結了用於這些移植物的其他相關的尺寸 特徵。
[0136] 表 1
[0137]

【權利要求】
1. 一種包括用糖溶液處理的異種移植肌腱的異種移植肌腱植入物，與可比較的同種異 體移植植入物或自體移植植入物相比，所述異種移植肌腱植入物表現出增強的術後癒合和 /或強度。
2. 根據權利要求1所述的植入物，其中，所述植入物是牛來源的。
3. 根據權利要求2所述的植入物，其中，所述植入物取自聖熱特魯迪斯牛。
4. 根據權利要求1所述的植入物，其中，所述植入物包括前伸肌腱。
5. 根據權利要求4所述的植入物，其中，所述植入物包括指內伸肌。
6. 根據權利要求1所述的植入物，其中，在植入前所述植入物表現出約8的pH。
7. 根據權利要求1所述的植入物，其中，所述糖選自葡萄糖、右旋糖、結晶葡萄糖、醛 糖、酮糖、半縮醛、吡喃糖、呋喃糖、赤蘚糖、蘇糖、核糖、阿拉伯糖、甘露糖、阿洛糖、阿卓糖、 木糖、來蘇糖、古洛糖、艾杜糖、半乳糖、塔羅糖、蔗糖和果糖。
8. 根據權利要求1所述的植入物，其中，所述植入物表現出至少一種異種抗原的約 60%的受控減少、小於約10%的胰蛋白酶消化、以及大於或等於約1800N的基於分選數據 的預測的UTF。
9. 根據權利要求8所述的植入物，其中，所述異種抗原是a -Gal。
10. -種加工異種移植肌腱的方法，包括： a. 從所述肌腱中去除異種抗原， b. 增強所述肌腱的強度， c. 將所述肌腱滅菌， d. 化學漂洗所述肌腱， e. 可選地分解來自所述肌腱的殘留過氧化物，以及 f. 可選地提高所述肌腱的鹼性。
11. 根據權利要求10所述的方法，其中，以a-f的順序進行各階段。
12. 根據權利要求10所述的方法，其中，各階段的一個或多個進一步包括一個或多個 使特定的處理化學溶液接觸所述肌腱的步驟。
13. 根據權利要求10所述的方法，其中，一個或多個所述去除異種抗原階段具有大於 或等於約1的水與化學藥品比率（WCR)。
14. 根據權利要求10所述的方法，其中，一個或多個分子強度增強階段具有小於約1的 水與化學藥品比率（WCR)。
15. 根據權利要求10所述的方法，其中，一個或多個所述滅菌階段具有小於或等於約1 的水與化學藥品比率（WCR)。
16. 根據權利要求10所述的方法，其中，整個方法具有基本上約0. 90的水與化學藥品 比率（WCR)。
17. -種牛肌腱置換移植物，包括回收自以下的經加工的前伸肌腱：（1) 純種的聖熱特魯迪斯、婆羅門、安格斯（即，100%的這些中的僅一種）；（2)具有25% 至100%的聖熱特魯迪斯牛、婆羅門、或安格斯或這些的組合的雜交種；（3)具有50%至 100%的聖熱特魯迪斯牛、婆羅門、或安格斯或這些的組合的雜交種；或（4)包括選自聖熱 特魯迪斯牛、婆羅門或安格斯的至少一個祖先的任何雜交種；所述移植物回收自年齡在約 18個月至約36個月之間的、並且在回收前至少約200kg熱標準胴體重（HSCW)的動物。
18. 根據權利要求17所述的移植物，其中，所述前伸肌腱是指內伸肌（EDM)。
19. 根據權利要求17所述的移植物，其中，所述動物的年齡在約18個月至約24個月之 間。
20. 根據權利要求17所述的移植物，其中，所述動物在回收前至少約295kg HSCW。
21. 根據權利要求17所述的移植物，其中，所述移植物用於人的前交叉韌帶（ACL)置 換。
22. 根據權利要求17所述的移植物，其中，所述移植物具有的失效強度大於平均的天 然人的ACL。
23. 根據權利要求1所述的植入物，其中，所述植入物表現出至少一種異種抗原的大於 或等於約55%的受控減少、小於約10%的胰蛋白酶消化、以及大於或等於約2020N的基於 分選數據的預測的UTF。
24. 根據權利要求1所述的植入物，其中，在植入前所述植入物表現出約6的pH。
【文檔編號】A61F2/38GK104519835SQ201380036946
【公開日】2015年4月15日 申請日期:2013年3月14日 優先權日:2012年5月11日
【發明者】丹尼爾·佩德羅索, 米凱萊·埃利 申請人:Rti外科手術有限公司