醌類化合物在製備抗結核菌藥物中的應用的製作方法
2023-11-03 22:31:57
專利名稱：醌類化合物在製備抗結核菌藥物中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及藥物化合物應用領域，具體涉及醌類化合物在製備抗結核菌藥物中的應用。
背景技術：
自從20世紀60是年代從海洋真菌中發現頭孢菌素以來，海洋微生物的代謝產物 日益成 為了藥物的豐富來源。根據John教授在1010年《Natural Product R印orts》的報 道，2008年發現海洋天然產物新化合物首次超過1000種，海洋微生物是主要來源之一(約 佔 23% )。由於海洋微生物的特殊環境，能代謝結構新穎的化合物，並且具有良好的藥理活 性，已經發現大量的抗腫瘤，治療心血管疾病，免疫調節劑等活性化合物。此外，海洋微生物 易於採集和培養，人工發酵產生的代謝產物比高等生物所含的物質更易提純，成本更低，符 合可持續發展的資源開發原則，所以從中篩選到的活性化合物更利於工業化生產。因此海 洋微生物被認為是尋找藥理活性物質的新源泉。近年來全球結核病的發病呈增高趨勢，據世界衛生組織(WHO)估計，目前全球受 結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)感染的人口佔世界人口的三分之一，其 中5 10%的感染者成為結核病患者。我國每年出現活動性肺結核病人130萬例，其中傳 染性肺結核約60萬例，是全球結核病高負擔國家之一。自抗結核藥物相繼問世，使結核病的治療起到劃時代的變化。然而由於結核病患 者的治療管理尚不十分規範，不規則化療，濫用抗結核藥物，使結核病耐藥情況日益嚴重， 且耐藥性的變化更趨向於多種藥物同時耐藥，這給結核病的防治工作造成極大困難。因此 尋找新的抗結核藥物，尤其是抗多藥耐藥性的抗結核藥物對保護人民身體健康，具有重要
眉、ο來源於南海海洋真菌Halorosellinia sp. 1403 (以下簡稱真菌1403)醌類化合物 1403B和1403C，其結構式如式(I) 其中(I)R = H 時，化合物為 1403B。
(2)R = 0H，化合物為 1403C。夏雪奎，中山大學博士學位論文(2007年)和佘志剛，陳省平，林永成等專利， 醌類化合物Bostrycin及其製備方法與抗腫瘤應用，申請號=200810028628. 3，公開號 CN101544556,已經給出了 1403B和1403C的提取方法，結構分析方法及其抗腫瘤應用。目 前尚未見1403B和1403C具有抗結核活性的相關報導。
發明內容
本發明的目的在於根據現有醌類化合物研究中未發現其具有抗結核活性的報導 的現狀，提供了醌類化合物在製備抗結核菌藥物中的應用。本發明目的通過以下技術方案予以實現 本發明醌類化合物可從南海紅樹林真菌Halorosellinia sp. 1403的發酵培養液 中提取分離得到。所述醌類化合物的結構通式如式(I)所示，其中，當R為H時，醌類化合 物為1403B ；當R為OH時，醌類化合物為1403C 上述醌類化合物製備方法的具體步驟如下(1)真菌 Halorosellinia sp. 1403 (CCTCC NO :M 201018)的種子培養培養基按重量比為葡萄糖0.5 1.5，酵母提取物0.05 0. 15，蛋白腖0. 1 0. 3，瓊脂1 1. 5，氯化鈉3 5，水100，製成試管斜面，挑取菌株接入斜面，30 35°C培養 5-7 天;(2)真菌 Halorosellinia sp. 1403 的發酵培養發酵培養基按重量比為葡萄糖5 15，酵母提取物1 4，蛋白腖0. 5 4，氯化 鈉3 5，水100，將斜面中培養好的菌株挑入發酵培養基，於室溫25 35°C靜置1 2個 月；(3)將上述培養好的發酵液過濾除去菌體得到培養液；(4)真菌的培養液加熱濃縮(溫度不超過50°C)至原液體積的1/20 1/5，用乙酸 乙酯萃取多次，濃縮乙酸乙酯萃取液，在矽膠柱中進行色譜分離，以石油醚-乙酸乙酯-甲 醇為洗脫劑梯度洗脫；(5)培養液浸膏經過柱層析後，收集30 80%的乙酸乙酯/石油醚洗脫液，45% 乙酸乙酯/石油醚為洗脫液，再以聚醯胺柱層析分離，重結晶純化，即得到紅色顆粒狀晶體 1403B，65%的乙酸乙酯/石油醚為洗脫液，再以聚醯胺柱層析分離，重結晶純化，即得到紅色顆粒狀晶體1403C。發明人先用卡介苗做應試菌株，採用紙片擴散法對1403B和1403C的抗結核菌活 性進行初步試驗，根據初步試驗的結果，本發明再用固體培養基稀釋法測定了該化合物對 卡介苗、結核分枝桿菌標準株H37Rv株和耐多藥結核分枝桿菌(MDR MTB)三種結核菌的最 小抑菌濃度，實驗結果證實1403B和1403C具有很強的抗結核菌和抗耐藥性結核菌活性，可 作為治療結核菌感染疾病的先導化合物，也可用於製備治療結核病藥物。當R為H時，對卡介苗的最小抑菌濃度為20μ g/mL ；當R為OH時，對卡介苗的最 小抑菌濃度為39 μ g/mL。當 R 為 H 時，對結核分枝桿菌標準株 H37Rv (Mycobacterium tuberculosis H37Rv)的最小抑菌濃度為小於7.5 yg/mL;當R為OH時，對結核分枝桿菌標準株 H37Rv (Mycobacterium tuberculosis H37Rv)的農貞力7]、^· 7· 5 μ g/mL。當 R 為 H 時，對耐多藥結核分枝桿菌(multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis (MDR MTB))的最小抑菌濃度為小於5 μ g/mL ；當R為OH時，對耐多藥結核分 feff (multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis (MDR MTB))
為小於5 μ g/mL。當R為H時，對結核分枝桿菌臨床分離株(INH，異煙胼Isoniazid)的最小抑菌濃 度為小於15 μ g/mL ；當R為OH時，對結核分枝桿菌臨床分離株(INH，異煙胼Isoniazid)的 最小抑菌濃度為小於30 μ g/mL。當R為H時，對結核分枝桿菌臨床分離株(耐SM(硫酸鏈黴素Str印tomycin Sulfate)和EMB (乙胺丁醇Ethambutol))的最小抑菌濃度為小於5 μ g/mL ；當R為OH時， 對結核分枝桿菌臨床分離株(耐SM(硫酸鏈黴素Str印tomycin Sulfate)和EMB (乙胺丁 醇Ethambutol))的最小抑菌濃度為小於10 μ g/mL。當R為H時，對結核分枝桿菌臨床分離株(敏感株)的最小抑菌濃度為小於10 μ g/ mL;當R為OH時，對結核分枝桿菌臨床分離株(敏感株)的最小抑菌濃度為小於15 μ g/mL。與現有技術相比，本發明具有如下有益效果(1)本發明提供了一種可用於抗結核病治療的醌類化合物1403B和1403C，從而擴 大了抗結核菌藥物的種類；(2)針對目前結核病發病率高、結核桿菌多重耐藥菌株及人體免疫缺陷病毒雙重 感染的出現，使結核病發病率和死亡率呈上升趨勢的現狀，本發明發現1403B和1403C具有 抗結核菌和耐藥性結核菌活性的特點，可用於抗結核藥物的製備，具有非常廣闊的應用前
旦
足；(3) 1403B和1403C來源於海洋紅樹林內生真菌，從真菌中提取化合物的方法簡 單，而優化培養方法將使大量發酵生產本化合物的成本低廉。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明做進一步地描述，但具體實施例並不對本發明做任 何形式的限定。
實施例1 1403B和1403C的製備本發明的醌類化合物1403B和1403C，可從海洋真菌Halorosellinia sp. 1403的發酵培養液中提取分離得到，製備方法的具體步驟如下(1)真菌Halorosellinia sp. 1403 CCTCC NO :M 2OlOl8 的種子培養培養基按重量比為葡萄糖0. 5-1. 5，酵母提取物0. 05-0. 15，蛋白腖0. 1-0. 3，瓊脂1-1. 5，氯化鈉3_5， 水100，製成試管斜面，挑取菌株接入斜面，30-35°C培養5-7天；(2)真菌Halorosellinia sp. 1403 CCTCC NO =M 201018 的發酵培養發酵培養基 按重量比為葡萄糖5-15，酵母提取物1-4，蛋白腖0. 5-4，氯化鈉3-5，水100，將斜面中培 養好的菌株挑入發酵培養基，於室溫25-35°C靜置1-2個月；(3)將上述培養好的發酵液過濾除去菌體得到培養液；(4)真菌的培養液加熱濃縮(溫度不超過50°C )至原液體積的1/20-1/5，用乙酸 乙酯萃取多次，濃縮乙酸乙酯萃取液，在矽膠柱中進行色譜分離，以石油醚-乙酸乙酯-甲 醇為洗脫劑梯度洗脫；(5)培養液浸膏經過柱層析後，收集20 % -100 %的乙酸乙酯/石油醚洗脫液，50 % 乙酸乙酯/石油醚為洗脫液，再以聚醯胺柱層析分離，重結晶純化，即得到紅色顆粒狀晶體 1403B，70%的乙酸乙酯/石油醚為洗脫液，再以聚醯胺柱層析分離，重結晶純化，即得到紅 色顆粒狀晶體1403C。1403C的試驗數據紅色顆粒狀晶體，mp232 0C · FABMS 337 (M+1)，m/z 55. EA (ψ/%, ) :C56. 56，H 4.617。計算直(C16H16O8) :C 57.14，H 4. 76, IRv/cm_1 (KBr) :3514，3479，3374，3029，2987， 2938,2896,1595，1475，1440，1398，1370，1300，1200，1208，1138，1082，997，948，864，821， 632,554,491. 1HNMR(500Mz, CDCl3, TMS.) :13· 35 (s, 0H-9)，12. 62 (s, 0H-10)，6· 46 (s, H_3)，
4.77 (t, 4. 5,4. 5Hz, H_7，OH)，3. 92 (s，CH3_16)，3. 54 (t, 4. 5,4. 5Hz, H_5)，2. 74 (d, 18Hz, H-8a), 2. 67 (d, 18Hz, H_8b)，1. 24(s, CH3-15). 13CNMr(CDCI3) :183. 3 (C_4)，176. 5 (C-I)， 160. 9 (C-IO) , 160. 9(C-2) , 160. 2 (C_9) , 139. 5(C_11) , 136. 8 (C-12) , 109. 8(C_14)， 109. 6 (C-3)，107. 3 (C-13)，76. 3 (C_7)，69. 2 (C_6)，68. 2 (C_5)，56. 8 (C-16)，34. 8 (C_8)， 25. 5(C-15).1403B 的試驗數據紅色粒狀晶體，mp 222-225 "C。FABMS m/z 321 [M+1] +。 1Hnmr(Dmso-C^soomHz) δ η 13. 20(1Η, s)，12. 67(1Η，s) ,6. 43 (1Η, s)，4. 71(1Η，dd，2. 5，
5.0)，4· 38 (1Η, d，2. 5)，3· 92 (3Η, s)，3· 62 (1Η，m)，1. 19 (3Η, s) ； 13CWR(DMS0_d6，125MHz) δ C 184. 3 (C)，183. 0 (C)，175. 9 (C)，161. 7 (C)，160. 3 (C)，138. 8 (C)，136. 4 (C)，109. 4 (CH)， 109. 0 (C)，106. 8 (C)，70. 1 (CH)，68. 8 (C)，56. 8 (CH3)，35. 5 (CH2)，29. 9 (CH2)，25. 2 (CH3)。實施例2固體培養基稀釋法測定1403Β和1403C抗卡介苗(BCG)絕對濃度從斜面上刮取卡介苗培養物，加入到3ml Middlebr00k7H9肉湯培養基中，加入 少量玻璃珠，旋緊試管蓋，於渦旋振蕩器上劇烈振動研磨，與標準麥氏比濁管(MacFarland No. 1)比濁，即配成lmg/ml的卡介苗(BCG)菌懸液。將1403B和1403C分別用DMSO配成高濃度的原液，用含5%的吐溫-80無菌超純 水稀釋原液至所需濃度，將稀釋好的1403B和1403C按所需劑量加入到4ml Middlebrook 7H11瓊脂培養基(該培養基已經121°C高壓蒸汽滅菌15分鐘、冷卻至50 55°C )，混勻， 製成含 1403B 和 1403C，濃度分別為 60 μ g/mL, 40 μ g/mL, 30 μ g/mL, 20 μ g/mL, 15 μ g/mL， 10 μ g/mL, 7. 5 μ g/mL, 5 μ g/mL 等的斜面培養基。
將濃度為lmg/ml的卡介苗(BCG)菌懸液用接種環蘸取數環，分別接種於含1403B 和1403C系列濃度的培養基和空白對照培養基斜面上，置於37°C培養4 8周，觀察實驗結 果，結果如表1所示。本實施例中所用Middlebrook 7H9肉湯培養基和Middlebrook 7H11瓊脂培養基 為本領域技術人員進行結核菌培養時的常用培養基，其配方採用常規配方即可。實施例3固體培養基稀釋法測定1403B和1403C抗結核分枝桿菌標準株H37Rv株 絕對濃度從斜面上刮取結核分枝桿菌標準株H37Rv株培養物，加入到3mlMiddlebr00k 7H9 肉湯培養基中，加入少量玻璃珠，旋緊試管蓋，於渦旋振蕩器上劇烈振動研磨，與標準麥氏 比濁管(MacFarland No. 1)比濁，即配成lmg/ml的H37Rv株菌懸液。將1403B和1403C分別用DMSO配成高濃度的原液，用含5%的吐溫-80無菌超純 水稀釋原液至所需濃度，將稀釋好的1403B和1403C按所需劑量加入到4ml Middlebrook 7H11瓊脂培養基中(該培養基已經121°C高壓蒸汽滅菌15分鐘，並冷卻至50 55°C )， 混勻，製成含 1403B 和 1403C 分別為 60 μ g/mL、40 μ g/mL、30 μ g/mL、20 μ g/mL、15 μ g/mL、 10 μ g/mL、7. 5 μ g/mL、5 μ g/mL等濃度的斜面培養基。將濃度為lmg/ml的H37Rv株菌懸液用接種環蘸取數環，分別接種於含1403B和 1403C系列濃度的培養基和空白對照培養基斜面上，置於37°C培養4 8周，觀察實驗結 果，結果如表1所示。實施例4固體培養基稀釋法測定絕對濃度從斜面上刮取結核分枝桿菌臨床分離耐ISRE MTB株(耐異煙胼、鏈黴素、利福 平、乙胺丁醇結核分枝桿菌臨床分離株)培養物，加入到3ml Middlebr00k7H9肉湯培養 基中，加入少量玻璃珠，旋緊試管蓋，於渦旋振蕩器上劇烈振動研磨，與標準麥氏比濁管 (MacFarland No. 1)比濁，即配成lmg/ml的菌懸液。將1403B和1403C分別用DMSO配成高濃度的原液，用含5%的吐溫-80無菌超純 水稀釋原液至所需濃度，將稀釋好的1403B和1403C按所需劑量加入到4ml Middlebrook 7H11瓊脂培養基中(該培養基已經121°C高壓蒸汽滅菌15分鐘，並冷卻至50 55°C )，混 勻，製成含 1403B 和 1403C,濃度分別為 60 μ g/mL、40 μ g/mL、30 μ g/mL、20 μ g/mL、15 μ g/ mL、10 μ g/mL、7. 5 μ g/mL、5 μ g/mL 等的斜面培養基。將濃度為lmg/ml的結核分枝桿菌臨床分離耐ISRE MTB株菌懸液用接種環蘸取數 環，分別接種於含1403B和1403C系列濃度的培養基和空白對照培養基斜面上，置於37°C培 養4 8周，觀察實驗結果，結果如表1所示。實施例5固體培養基稀釋法測定1403B和1403C抗結核分枝桿菌臨床分離株 (INH，異煙胼Isoniazid)絕對濃度從斜面上刮取結核分枝桿菌臨床分離株(INH，異煙胼Isoniazid)培養物，加入到 3ml Middlebrook 7H9肉湯培養基中，加入少量玻璃珠，旋緊試管蓋，於渦旋振蕩器上劇烈 振動研磨，與標準麥氏比濁管(MacFarland No. 1)比濁，即配成lmg/ml的菌懸液。
將1403B和1403C分別用DMSO配成高濃度的原液，用含5%的吐溫-80無菌超純 水稀釋原液至所需濃度，將稀釋好的1403B和1403C按所需劑量加入到4ml Middlebrook 7H11瓊脂培養基中(該培養基已經121°C高壓蒸汽滅菌15分鐘，並冷卻至50 55°C )，混勻，製成含 1403B 和 1403C,濃度分別為 60 μ g/mL、40 μ g/mL、30 μ g/mL、20 μ g/mL、15 μ g/ mL、10 μ g/mL、7. 5 μ g/mL、5 μ g/mL 等的斜面培養基。將濃度為lmg/ml的結核分枝桿菌臨床分離株(INH，異煙胼Isoniazid)菌懸液用 接種環蘸取數環分別接種於含1403B和1403C系列濃度的培養基和空白對照培養基斜面 上，置於37°C培養4 8周，觀察實驗結果，結果如表1所示。實施例6固體培養基稀釋法測定1403B和1403C結核分枝桿菌臨床分離株(耐 SM(硫酸鏈黴素Str印tomycin Sulfate)和EMB (乙胺丁醇Ethambutol))絕對濃度從斜面上刮取結核分枝桿菌臨床分離株(耐SM和EMB)培養物，加入到3ml Middlebrook 7H9肉湯培養基中，加入少量玻璃珠，旋緊試管蓋，於渦旋振蕩器上劇烈振動 研磨，與標準麥氏比濁管(MacFarland No. 1)比濁，即配成lmg/ml的菌懸液。將1403B和1403C分別用DMSO配成高濃度的原液，用含5%的吐溫-80無菌超純 水稀釋原液至所需濃度，將稀釋好的1403B和1403C按所需劑量加入到4ml Middlebrook 7H11瓊脂培養基中(該培養基已經121°C高壓蒸汽滅菌15分鐘，並冷卻至50 55°C )，混 勻，製成含 1403B 和 1403C,濃度分別為 60 μ g/mL、40 μ g/mL、30 μ g/mL、20 μ g/mL、15 μ g/ mL、10 μ g/mL、7. 5 μ g/mL、5 μ g/mL 等的斜面培養基。將濃度為lmg/ml的結核分枝桿菌臨床分離株(耐SM和EMB)菌懸液用接種環蘸取 數環，分別接種於含1403B和1403C系列濃度的培養基和空白對照培養基斜面上，置於37°C 培養4 8周，觀察實驗結果，結果如表1所示。實施例7固體培養基稀釋法測定1403B和1403C結核分枝桿菌臨床分離株(敏感 株)絕對濃度從斜面上刮取結核分枝桿菌臨床分離株(敏感株)培養物，加入到 3mlMiddlebrook 7H9肉湯培養基中，加入少量玻璃珠，旋緊試管蓋，於渦旋振蕩器上劇烈振 動研磨，與標準麥氏比濁管(MacFarland No. 1)比濁，即配成lmg/ml的菌懸液。將1403B和1403C分別用DMSO配成高濃度的原液，用含5%的吐溫-80無菌超純 水稀釋原液至所需濃度，將稀釋好的1403B和1403C按所需劑量加入到4ml Middlebrook 7H11瓊脂培養基中(該培養基已經121°C高壓蒸汽滅菌15分鐘，並冷卻至50 55°C )，混 勻，製成含 1403B 和 1403C,濃度分別為 60 μ g/mL、40 μ g/mL、30 μ g/mL、20 μ g/mL、15 μ g/ mL、10 μ g/mL、7. 5 μ g/mL、5 μ g/mL 等的斜面培養基。將濃度為lmg/ml的結核分枝桿菌臨床分離株(敏感株)菌懸液用接種環蘸取數 環，分別接種於含1403B和1403C系列濃度的培養基和空白對照培養基斜面上，置於37°C培 養4 8周，觀察實驗結果，結果如表1所示。表1固體培養基稀釋法測定1403B和1403C抗結核菌絕對濃度結果
結核分枝桿菌標準株(H37Rv) 7.5 7.5 耐多藥結核分枝桿菌(MDR MTB) 5 5 結核分枝桿菌臨床分離株(INH,異煙胼Isoniazid) 15 30 結核分枝桿菌臨床分離株(耐SM (硫酸鏈黴素 . 10 Streptomycin Sulfate)和耐 EMB (乙胺丁醇 Ethambutol) 3 結核分枝桿菌臨床分離株(敏感株)_10_1權利要求
醌類化合物在製備抗結核菌藥物中的應用。
2.根據權利要求1所述醌類化合物的應用，其特徵在於所述醌類化合物的結構通式如 式⑴所示，其中，R為H或0H:式⑴。
3.根據權利要求2所述醌類化合物的應用，其特徵在於當R為H時，對卡介苗的最小抑 菌濃度為20 u g/mL ；當R為OH時，對卡介苗的最小抑菌濃度為39 u g/mL。
4.根據權利要求2所述醌類化合物的應用，其特徵在於當R為H時，對結核分枝桿菌標 準株H37Rv的最小抑菌濃度為小於7. 5 u g/mL ；當R為OH時，對結核分枝桿菌標準株H37Rv 的最小抑菌濃度為小於7. 5 u g/mL。
5.根據權利要求2所述醌類化合物的應用，其特徵在於當R為H時，對耐多藥結核分枝 桿菌的最小抑菌濃度為小於5 u g/mL ；當R為OH時，對耐多藥結核分枝桿菌的最小抑菌濃 度為小於5 ii g/mL。
6.根據權利要求2所述醌類化合物的應用，其特徵在於當R為H時，對結核分枝桿菌臨 床分離株的最小抑菌濃度為小於15 u g/mL ；當R為OH時，對結核分枝桿菌臨床分離株的最 小抑菌濃度為小於30 u g/mL。
7.根據權利要求2所述醌類化合物的應用，其特徵在於當R為H時，對結核分枝桿菌臨 床分離株和EMB的最小抑菌濃度為小於5 u g/mL ；當R為OH時，對結核分枝桿菌臨床分離 株和EMB的最小抑菌濃度為小於10 u g/mL。
8.根據權利要求2所述醌類化合物的應用，其特徵在於當R為H時，對結核分枝桿菌臨 床分離株(敏感株)的最小抑菌濃度為小於10ii g/mL ；當R為OH時，對結核分枝桿菌臨床 分離株(敏感株)的最小抑菌濃度為小於15 u g/mL。
全文摘要
本發明公開了醌類化合物在製備抗結核菌藥物中的應用。本發明所述醌類化合物的結構通式如式(I)所示，其中，R為H或OH。本發明針對當前結核病發病率高、結核桿菌多重耐藥菌株的出現，使結核病發病率和死亡率呈上升趨勢的現狀，根據醌類化合物具有抗結核菌和耐藥性結核菌活性的特點，將醌類化合物用於製備抗結核菌藥物。本發明醌類化合物來源於海洋微生物，提取簡便，成本低廉，用於製備抗結核菌藥物，具有廣闊的應用前景。
文檔編號A61P31/06GK101862314SQ20101020476
公開日2010年10月20日 申請日期2010年6月18日 優先權日2010年6月18日
發明者佘志剛, 林永成, 賴小敏, 陳伊, 陳洪, 陳省平, 黃宇虹 申請人:中山大學