由衰老體細胞克隆的動物中的端粒恢復和細胞壽命延長的製作方法

2023-12-08 23:27:11

專利名稱：由衰老體細胞克隆的動物中的端粒恢復和細胞壽命延長的製作方法
相關申請書的交叉引用本申請書是美國系列號09/527,026和09/520,879的部分繼續申請，並要求臨時申請60/152,340和60/153,233的權利。
本發明也可用於復壯由於逐漸變老或由於與加重的細胞衰老有關的病症(如肌營養不良或動脈粥樣硬化、免疫衰老、BPH、神經變性疾病、巴雷特食道硬化、AMD骨關節炎和皮膚潰瘍)而衰老或老化的細胞。通過核移植或有關技術可重新編程或恢復患者或動物的細胞，使其再生並恢復為全能性。這些全能細胞可用於生產以下細胞型，包括但不限於多能性細胞，如間質或前間質幹細胞、造血細胞、血管細胞等，它們能移植到患者或動物或合適的供體中。這些細胞將在患者或動物組織中「播種」多種類型的健康可增殖細胞，包括骨、血液、肌肉、神經元、免疫細胞和其它類型。
本發明的方法也包括由復壯的細胞和畸胎瘤產生分化的細胞，該畸胎瘤含有來自任一個或全部三個胚層的細胞，並可用於製備與目的原代細胞有相同基因型的不同類型的原代細胞。這些新產生的原代細胞在組織工程和器官移植治療領域具有重要意義。也包括再克隆克隆的哺乳動物的方法，特別是與克隆親代相比，克隆哺乳動物的後代遺傳學改變的方法。
本發明也涉及鑑定可調節細胞老化和衰老的化合物和與之相關的基因的試驗，特別是可影響端粒長度、EPC-I活性、tPA、膠原酶活性、gas基因、有絲分裂指數和細胞老化和增殖能力的其它指標的化合物。
可以用來自成年分化細胞的核產生胚胎細胞或胚胎幹細胞這一事實對於器官、細胞和組織移植領域具有重要的意義。例如，可以由取自需要移植的患者的細胞的核產生胚胎幹細胞，誘導分化為移植需要的細胞型。利用組織工程領域的技術，能由可用於移植的克隆分化細胞設計組織和器官。因為用於移植的細胞和組織與患者有相同的核基因型，將避免或減少移植物排斥的問題和使用免疫抑制藥物所固有的危險。而且，工程細胞和組織可用異源DNA容易地修飾，或修飾使有害基因失活，使得移植的細胞和組織在必要時遺傳學相關或改進。與本發明共有並同時申請的美國專利系列號＿＿討論了遺傳修飾供體核DNA和受體線粒體DNA的方法，在此完整引用作為參考。
然而，近來有一些關於克隆細胞的遺傳年齡的擔心。最近Shiels等人(Nature(1999)399316)關於克隆羊多利的報導提示，核移植也許不能恢復端粒長度，在由胚、胎及成年細胞克隆的動物中發現的末端限制片段(TRF)大小反映了移植的核的死亡率。這些發現的含義與用於人類移植的置換細胞和組織的克隆特別有關(Lanza等人(1999a)NatureMed.5975；Lanza等人(1999b)Nature Biotechnol.171171)。經歷未成熟衰老的移植器官對於體內周圍組織將成為破壞性的，實際上能加重置換細胞所要治療的疾病。Shiels等人的報導也提出了關於核移植產生的細胞是否經歷未成熟衰老及核移植產生的克隆動物是否壽命減少的問題。這對高質量家畜的克隆和再克隆又具有嚴重的影響，而在該報導之前認為克隆優於傳統的繁殖技術，後者依賴於在繁殖另一代之前達到交配年齡的動物。
至少二十年來，科學家們假定端粒丟失與老化過程有關。參見，Harley，「端粒丟失有絲分裂時鐘還是遺傳定時炸彈？」Mutation Res.(1991)256271-282。這一假說，最初被稱為「marginotomy理論」，即，染色體末端或端粒的逐漸丟失導致細胞周期退出，結果細胞衰老。參見，Olovnikov，「Marginotomy理論」J.Theor.Biol.(1973) 41181-190。這一假說最早提出了DNA聚合酶由於需要RNA引物複製後隨鏈，因此不能完全複製染色體末端的預測。這一預測最後通過分子研究得到證實，研究表明人成纖維細胞染色體的末端限制片段的平均長度在體外以依賴複製的方式降低。參見，Harley等人，「在人成纖維細胞老化過程中端粒縮短」，Nature(1990)345458-460。
支持端粒理論的進一步的證據與端粒酶有關。人細胞中的端粒酶活性於1989年第一次鑑定。參見，Morin，「人端粒末端轉移酶是合成TTAGGG重複的一種核糖核蛋白」Cell(1989)59521-529。端粒酶用來在染色體末端建立，恢復端粒長度。其它研究表明，儘管端粒酶活性在體細胞分化過程中被抑制，但端粒酶在種系細胞複製的某些階段有活性，因此在代與代之間在種系細胞中保持端粒長度。另外，顯示端粒酶在轉化細胞中也有活性。參見，Harley(1991)的綜述。
曾經提出，分化細胞中端粒酶的抑制可能限制體細胞以不受控制的方式克隆擴充(象在癌症中一樣)的能力。但某些腫瘤細胞系顯示端粒酶陰性的永生性，這被稱為「ALT」途徑。發明者提出，這一備選途徑，象腫瘤發生中端粒酶活性的獲得一樣，是種系性狀的再現。發明者提出，受損的端粒在種系中被修復，不僅是通過端粒酶添加端粒重複，而且通過DNA聚合酶引起的同源鏈侵入和延伸。 因為核移植繞過了有性繁殖，即使用與種系細胞不同的體細胞作為核DNA的來源，當前關於克隆的假說是，克隆的端粒永遠不會再生，克隆動物與它的親代是同一「遺傳年齡」的。事實上，已經注意到，在用於核移植之前的一定時間內與該技術有關。參見，BBC新聞，「多利比她的年齡更老嗎？」1999年5月27日，星期四。如果這一理論是正確的，將意味著克隆的細胞可能比通過有性繁殖產生的相同年齡的動物有更短的平均壽命，也許動物可能具有比其親代更短的壽命。
這一理論不僅對於器官移植領域有嚴重的影響，而且對可以對用於核移植的體細胞進行的遺傳操作程度提出了懷疑。例如，核移植技術的一個主要優點是體細胞可以比胚胎幹細胞更容易地在培養中保存和用轉基因轉染。這一特性有利於產生可產生治療蛋白的動物，即，例如，由允許在牛奶中產生治療蛋白的乳腺特異啟動子表達轉基因的母牛。同樣，如果用於核移植的細胞由於老化的染色體而不能經受一系列遺傳操作，則實際上不可能用多種遺傳操作產生動物、細胞和組織。然而，進行這些複雜遺傳操作的能力可能是必要的，例如，在這些細胞用於核移植和器官移植之前，改正來自具有有害突變的患者的供體細胞中的遺傳異常。
解釋為何一些研究人員發現端粒在核移植之後無法再生的一個假說是，端粒再生依賴於供體體細胞型的選擇。最近的研究表明，端粒酶活性的重建導致端粒延長和正常人成纖維細胞和視網膜上皮細胞的無限增殖(Bodnar等人(1998)Science 279349；Vaziri和Benchimol(1998)Curr.Biol.8279)，而使用乳房上皮細胞的類似實驗不能導致端粒的延長和複製壽命的延長(Kiyono等人(1998)Nature 39684)。細胞在端粒酶延長端粒的能力上或在適應培養後激活的信號傳導途徑上的差異用來解釋這些不同(de Lange和DePinho(1999)Science 283947)。
一些研究人員提出，端粒酶活性可能是細胞周期依賴的。例如，在1996年，Dionne報導了端粒酶活性細胞在靜止期(G0期)端粒酶活性的下調，並假定端粒酶活性可能是細胞周期依賴的。見http//telomeres，virtualave.net/regulation.html。類似的，Kruk等人報導了當與細胞周期的其它時點相比時，在S早期有較高水平的端粒酶(Biochem.Biophys.Res.Commun.(1997)233717-722)。然而，其他研究人員報導了與之矛盾的結果，另外提出端粒酶活性與生長速率而不是與細胞周期有關(Holt等人，(1996)Mol.Cell.Biol.16(6)2932-2939；參見同上文的網址，參考Holt，1997和Belair，1997)。另外其他人提出，端粒酶激活由其它細胞激活信號介導，體外B細胞中端粒酶響應CD40抗體/抗原受體結合和接觸白介素-4上調證明了這一點(同上文的網址，引用Weng，1997；參見Hiyama等人(1995)J.Immunol.155(8)3711-3715)。但儘管對端粒酶和它在老化和細胞轉化過程中的作用的興趣越來越大，但對端粒酶活性的調節仍然所知甚少。參見，例如，Smaglik，「轉向端粒酶當反義策略出現時，基本問題仍然存在」TheScientist，1999年1月18日，13(2)8。
調節端粒酶活性的能力在醫學界具有廣泛的影響，並可能深深地影響比克隆動物中端粒再生更多的技術。具有調節端粒的能力將能夠治療許多年齡相關的和其它類型的疾病。例如，調節端粒的能力對於提高與癌症化療有關的骨髓移植的效能可能是重要的；端粒酶治療可用於替換免疫系統中的老化細胞，例如在眼睛視網膜中，在治療血管層中，以利於預防心臟病發作或中風，延長肝細胞的壽命，治療肝硬變，或延長成肌細胞的壽命，治療肌營養不良。另外，調節端粒酶的能力可允許控制癌細胞。最後，端粒和端粒酶調節的體外模型，特別是細胞老化逆轉的模型，將能夠設計鑑定端粒調節、老化和癌症的分子機制的試驗和篩選法。因此，對端粒酶調節的更深入了解除了保證克隆組織對於組織工程和移植的效能，並確保甚至提高克隆和非克隆動物的壽命外，還能導致廣泛的治療。
目前認為端粒縮短導致雙鏈不可區分的染色體末端斷裂，從而發出DNA損傷關卡的信號(W.E.Wright和J.S.Shay 2000，Nat.Med.6(8)849-851)。 然而，端粒可能含有含量越來越多的從端粒向著絲粒的簡併或非端粒重複DNA。 這些非端粒重複序列的出現引起暫時的DNA損傷關卡。修復(如通過核酸外切酶活性)後，細胞能再次進入細胞周期。利用隨後的核移植使致死細胞生長為末期衰老引起自然中不總是存在的均勻端粒重複序列延伸陣列的合成。 含有具有這些延伸和均勻端粒重複序列的染色體的細胞和/或動物將被復壯，並且具有超年輕的獨特特性，因為大量細胞在任一時間段在DNA損傷關卡有較少的細胞。
本發明基於如下發現核移植技術可通過激活內源(細胞)端粒活性延長體細胞(例如衰老或接近衰老或關卡停滯的細胞)的壽命，通過修復串聯重複DNA序列損傷增強基因表達的年輕模式。這與最近為解決核移植產生的動物中發現的端粒丟失提出的方法相比，具有特別的優點，其焦點在於克隆的端粒酶基因的外源表達，以解決克隆哺乳動物中的端粒縮短。
在這點上，Geron公司和Roslin研究所的研究人員最近合作，用核移植合併了Geron克隆的端粒酶基因(hTERT)，以期解決克隆中的端粒縮短。參見，例如，Bussiness Wire，1999年5月26日。這一宣布先於5月27日Roslin研究所的研究人員在Nature上的報導，該報導稱用核移植克隆的(多利之後的)另外兩隻綿羊也顯示端粒短於年齡相當的對照。麻薩諸塞州大學參與克隆牛的研究人員也認為，用外源端粒酶基因轉染的供體細胞可能在克隆動物的壽命上有優勢，儘管他們發現核移植似乎使衰老的供體細胞復壯。參見http//abcnews.go.com/sections/science/Dailv News/clones980522.html(1998)。
本發明優於為了由轉染的端粒酶基因表達端粒酶而提出的方法，因為激活端粒酶和在克隆細胞、組織和動物中再生端粒長度不需要遺傳操作。另外，用本發明達到的端粒酶活性的上調是短暫的，當它足以延長端粒長度時，不能給予組成型的無限增殖。假定發現端粒酶在許多類型的癌症細胞中組成型上調，並且報導組成型端粒酶表達導致原癌基因c-MYC的上調，則這一優點特別重要(D.Bead的文章)。因此，導入端粒酶之外的基因也引起了誘導細胞轉化的可能性，並將有可能需要隨後旨在控制由轉染基因表達端粒酶的措施。因此一種可用細胞自身調節機制控制端粒酶活性的方法優選地用來插入端粒酶基因的外源拷貝。
另外，本發明優於端粒酶的外源表達，因為導致端粒縮短及隨後用核移植延長端粒的體細胞培養產生一群復壯的細胞，它們全都具有一致的端粒重複性狀。因此，從這一群體中分離的個體細胞具有能增強增殖的較大可能性，該群體將具有比天然細胞有更少關卡停滯細胞的獨特性質，從而是「超年輕的」。
因此，本發明包括用核移植復壯或提高正常體細胞壽命的方法。得益於所公開的方法的體細胞包括任何體細胞，例如由於達到群體倍增的自然限制，或由於對複雜遺傳改變或條件的苛刻選擇條件，使細胞暴露於高氧壓力或可損傷端粒DNA的其它條件下，而接近衰老的細胞。如上所述，這特別包括來自具有年齡相關缺陷或病症的患者或動物的細胞，如年齡相關的黃斑變性、免疫衰老神經變性疾病，如帕金森氏症或阿爾茨海默氏病，骨關節炎、肌營養不良、皮膚老化、肺氣腫、動脈瘤、冠心病、動脈粥樣硬化、高血壓、白內障、成年發作的糖尿病。本發明也可用於與加速的細胞更新有關的病症，如肌營養不良、帶狀皰疹、AIDS和肝硬化。這些方法適用於任何目的體細胞，和這些細胞作為核移植供體的用途。
本發明的方法允許人們將晚期傳代的體細胞的核重新編程為胚胎狀態。通過使胚胎細胞分化並發育為許多不同的細胞型，人們可重新分離復壯或「年輕」狀態的目的原代細胞。並且，由於本發明的方法需要製備分化為所有不同細胞型的胚胎幹細胞，所以用任何目的原代細胞可產生任何類型的細胞，只要體細胞的基因組未改變得以至影響細胞發育。因此，本發明提供一種有價值的方法，用以分析體外不同細胞型的等基因背景(即基因敲除或異源基因的表達)中相同遺傳改變的影響。
例如，患者的體細胞可以用核移植相關技術重新編程、再生並恢復成全能性。由這些復壯的全能細胞能獲得多能幹細胞，如前間質、間質、enangioblasts、造血幹細胞。能將這些多能細胞或由它們衍生的細胞移植到供體中，將在患者的組織中「播種」健康的可增殖細胞，如免疫細胞、血細胞、骨、肌肉、神經和其它類型。
本發明的方法也通過用所述細胞、它們的核或染色體作為核移植供體，提高希望的細胞(優選地哺乳動物細胞，更優選地是人細胞，例如需要復壯的細胞)的壽命。優選地，該方法可重複，從產生的克隆胚胎中獲得的細胞、核或染色體自身將用作核移植供體。另外，供體細胞優選地是轉基因的。
本發明的方法通過用所述細胞、由它們衍生的核或染色體作為核移植供體或使這些細胞的DNA暴露於胚胎細胞型，進一步使人們能恢復希望的細胞中的重複DNA，並激活或調節(降低或增強表達)那些參與老化的基因，包括希望的細胞中的端粒酶，例如需要復壯的哺乳動物細胞和關卡停滯的細胞。如下文所詳述，這是一個不平行的發現，因為本發明可提供一種鑑定參與細胞老化並調節細胞壽命的特異分子的方法。具體而言，本發明提供鑑定可恢復重複DNA(如端粒)、激活或抑制細胞老化過程中改變的基因的化合物(如端粒酶、gas、tPA等)的試驗。
鑑於發明者關於核移植可用來復壯或延長哺乳動物細胞(例如衰老或接近衰老的細胞)的壽命的發現，不再擔心克隆的哺乳動物、胎、畸胎瘤或胚或內細胞團或胚泡具有其親代的遺傳年齡。因此，本發明也包括用核移植技術再克隆克隆的哺乳動物、胎、畸胎瘤或胚等的方法。這些再克隆方法特別可用於產生表達一種以上的異源基因或一種以上基因被敲除的轉基因哺乳動物，因為能通過克隆技術產生這些動物，產生具有相同遺傳背景的克隆的和再克隆的哺乳動物。這些方法不需要交配或繁殖，它們常產生其它遺傳差異，並且不可能獲得含有在基因組上緊密連鎖從而一起遺傳的改變基因的雙敲除或雙轉基因哺乳動物。
圖2。由衰老體細胞克隆的正常母牛。(A)5個月大的CLS3-8、CL53-209、CL53-10、CL53-11和CL53-12(暱稱分別為Lilv、Daffodil、Crocus、Forsythia和Rose)；(B)10個月大的CL53-1(Persephone，insert)。
圖3。核移植恢復衰老供體細胞增殖壽命的能力。(A)原初BEF細胞株(*)的生長曲線與由晚代BEF細胞(CL53細胞)克隆的胎(ACT99-002)(o)衍生的細胞的生長曲線相比較。(B)CL53供體細胞的生長曲線，表明培養物中仍有大約2次群體倍增。(C)晚代CL53細胞(n＝97)以克隆密度接種，比較1個月後的增殖能力。(D)與由晚代細胞衍生的克隆相反，來自前代BFF培養物(原初)和前代ACT99-002(克隆)的單細胞克隆顯示增殖擴充的能力。
圖4。端粒長度分析。(A)具核血細胞。來自克隆的和對照動物的外周血樣在雙盲實驗中通過流式FISH分析(N.Rufer，W.Dragowska，G.Thornbury，E.Roosnek，P.M.Lansdorp(1998)Nature Biotechnol.16743)。用氯化銨滲透裂解紅細胞後獲得的雙份具核細胞樣品(合併的粒細胞和淋巴細胞)如述通過流式FISH分析(N.Rufer等人(1999)J.Exp.Med.190157)。通過用FITC-標記端粒探針獲得的平均螢光減去平均背景螢光，計算單核細胞的平均端粒螢光。注意正常母牛中端粒螢光值的年齡相關的降低，和克隆動物中相對較長的端粒。(B)末端限制片段的分析。從對照細胞(轉染前BFF牛成纖維細胞)、衰老CL53細胞和通過核移植用衰老CL53細胞獲得的7周齡克隆胎(ACT99-002)細胞的成纖維細胞中分離的基因組DNA。用HinfI/RsaI消化後獲得的DNA片段的TRF分析如述在0.5％瓊脂糖凝膠上進行12小時(端粒長度測定試劑盒，Pharmingen，San Diego，CA)。道1來自CEPH類淋巴母細胞人細胞系134105的對照DNA；道2生物素化的標記(Pharmingen)；道3TeloLow對照DNA(Pharmingen，平均TRF長度為3.3kb)；道4衰老CL53細胞；道5BFF成纖維細胞轉染前；道6ACT99-002(克隆的)細胞。(C)在0.5％瓊脂糖凝膠上電泳24小時後如B的TRE分析，道1ACT99-002細胞(平均TRF長度為19.3kb)；道2BFF056H成纖維細胞轉染前(平均TRF長度為17.9kb)；道3衰老CL53細胞(平均TRF長度為16.2kb)；道4TeloHigh對照細胞(Pharmingen，平均TRF長度為11.3kb)；道5來自CEPH類淋巴母細胞人細胞系134105的對照DNA；道6用HindIII酶切的生物素化的λDNA(分子量標記物)。(D)對轉染前BIT牛成纖維細胞、衰老CL53細胞和ACT99-002成纖維細胞的流式FISH分析。在與或不與FITC-3TA2)3肽核酸探針雜交後分析細胞(分別為灰色和黑色直方圖)。單細胞根據光散射性質門控。注意用作核供體的衰老CL53細胞的較高自身螢光。以線性等級測量螢光。在減去背景螢光後，ACT99-002(克隆的)細胞具有最高的螢光，隨後是BFF(原始)細胞。衰老CL53細胞似乎具有最低的特異螢光。
圖5。在重建的胚胎中而不是在供體牛成纖維細胞中表達端粒酶。端粒酶活性用端粒重複擴增方法(TRAP)測定試劑盒(Pharmingen，SanDiego，CA)測定。成年供體衰老(CL53)成纖維細胞和第7天重建的牛胚(n＝15)的裂解物在TRAP測定中獲得並使用。道1來自4000個K562人紅白血病細胞的提取物；道220bp標記；道3無細胞提取物；道4熱處理的胚(n＝1)提取物；道5n＝10；道6n＝1；道7n＝0.1；道8n＝0.01；道9來自4000個供體CL53成纖維細胞的提取物；道10-11成纖維細胞提取物對照(分別無TS模板和熱滅活的提取物)；道1220bp標記。所有道都含有內部控制TRAP反應物(36bp)。
發明詳述本發明包括復壯正常體細胞的方法。「正常」體細胞是指屬於體細胞系的這些細胞不是腫瘤產生的或轉化的，在該細胞或這種細胞的核或該細胞的染色體被移植到無核卵母細胞中或以其它方式接觸種系細胞中存在的因子之後，能被重新編程或利於胚胎發育。正常體細胞可以或可以不遺傳修飾。「復壯」，本發明是指至少下列之一所述體細胞的可能的群體數量倍增；EPC-1活性或細胞老化的其它標記逆轉為年輕狀態；端粒酶上調，和/或端粒增多。「超年輕」是指細胞群體具有比正常細胞年輕的細胞老化標誌。「畸胎瘤」是指一組分化細胞，含有由全能細胞產生的中胚層、內胚層或外胚層衍生物。
在本發明的一個優選實施方案中，將要用於本發明的正常體細胞是衰老細胞、關卡停滯的細胞或接近衰老的細胞。然而，這些方法適用於任何希望的正常體細胞，優選地人類細胞。複製衰老是與由血清飢餓或年輕細胞生長的密度依賴的抑制引起的靜止不可區分的一種生理狀態(West等人(1989)Exp.Cell Res.184138；West等人(1996)Exp.Gerontol.31175；和Pignolo等人(1998)Exp.Gerontol.3367)，似乎包括細胞周期中接近G1/S邊界的G1晚期的阻斷(Cristofalo和Pignolo(1996)Exp.Gerontol.31111；Gorman和Cristofalo(1986)Exp.Cell Res.16787；和Cristofalo等人(1992)老化和細胞防禦機制，Franceshi等人編(紐約科學院，紐約)187-194頁)。
衰老細胞可以用本領域周知的多種方法鑑定。例如，可以用相差光學顯微鏡和電子顯微鏡的超微結構分析證實成纖維細胞複製衰老的特徵，包括與年輕細胞相比，明顯的和活躍的高爾基體，內陷的和葉狀的增多的核，大溶酶體，和細胞質微絲的增多(Lipetz和Cristofalo(1972)J.Ultrastruct.Res.3943)。另外，衰老細胞進入S期的能力降低，這通過3H胸苷摻入減少和衰老相關β-半乳糖苷酶染色顯著增加確定(G.P.Dimri等人(1995)Proc.Natl.Acad.USA 929363)。衰老細胞也顯示與前代細胞相比EPC-1(早期群體倍增水平cDNA-1)(Pignolo等人(1993)J.Biol.Chem.2688949)mRNA水平降低，與靜止細胞相比gasI基因表達下調(Cowled等人(1994)Exp.Cell Res.211197-202)。
能通過繁殖細胞直到達到不可逆的生長停滯來分離衰老細胞。對於「接近衰老」，本發明者是指這些細胞具有分裂不超過約3-6次的能力，優選地距複製衰老不到2或3次群體倍增。儘管產生用於核移植的衰老細胞的優選含義是傳代正常體細胞直到完成壽命的約90％-95％以上，衰老和衰老樣狀態也能通過將細胞接觸不同試劑(包括基因毒劑和Cdk抑制劑)誘導(McConnell等人(1998)Current Biol.8351-354)。基因毒劑誘導類似於衰老的、不同於被稱為DNA損傷關卡停滯的靜止的生長停滯。此外，接近衰老的細胞也能從(例如，具有老化相關病症的)人或動物中獲得。
本發明的方法可使用細胞復壯產生克隆的動物，或者可用來為了其它目的復壯正常目的體細胞。這些方法可包括a.將所述體細胞、體細胞的核或體細胞的染色體移植到受體卵母細胞或卵或其它合適的受體細胞中，以產生胚胎；b.使用該胚胎獲得至少含有一種細胞的胚胎、內細胞團、胚盤和/或幹細胞；c.使胚胎、內細胞團、胚盤和/或幹細胞分化為希望的細胞或組織類型；d.分離得到的細胞或組織；e.將所述細胞或組織移植到患者中。
根據本發明分離的分化的細胞畸胎瘤、內細胞團、胚盤和/或胚胎幹細胞將具有即便不長於供體體細胞也至少與它一樣長的端粒，這也是本發明的一個方面。這些分化的細胞也應具有年輕或超年輕的細胞老化標誌。也預見了一種方法，該方法用分化的細胞或組織、畸胎瘤細胞、內細胞團、胚泡細胞或胚細胞作為隨後的核供體。這種方法特別適用於分離具有多種轉基因或遺傳改變的正常體細胞、畸胎瘤、ES細胞等，可無限重複直到達到希望數量的遺傳改變。
本發明的方法使用的正常體細胞可以是任何細胞型。合適的細胞包括免疫細胞，如B細胞、T細胞、樹突細胞，皮膚細胞，如角質細胞、上皮細胞、軟骨細胞、丘細胞、神經細胞、心細胞、食道細胞、皮膚成纖維細胞、不同器官(包括肝、胃、腸、肺、胰、角膜、皮膚、膽囊、卵巢、睪丸、其它生殖器官、腎等)的細胞。最合適的細胞一般是容易在組織培養中繁殖並能容易地轉染的細胞。優選地，用於轉染異源DNA和進行核移植的細胞型是成纖維細胞。
美國專利號5,945,577；1997年7月3日申請的美國系列號08/888,057；1997年7月3日申請的美國系列號08/888,283；1997年9月22日申請的美國系列號08/935,052；和1999年9月13日申請的美國系列號09/394,902公開了實現核移植的方法和方案，所有專利和申請書都在此引用作為參考。
體細胞可以來自任何類型的動物或哺乳動物，如豬、山羊、貓、狗、大鼠、小鼠、牛、水牛、綿羊、馬、人、非人靈長類動物，但優選地是有蹄類動物細胞，最優選地是牛細胞。用於核移植的卵母細胞或卵將來自相似的來源，並且可以與供體細胞或DNA是相同或不同的種。
無免疫應答的動物可以是能支持畸胎瘤形成的任何動物，無免疫應答到不發生發育的畸胎瘤排斥的程度。例如，無免疫應答的動物可以是SCID或裸鼠。此外，細胞也可以是體內分化的或禽卵中的細胞。
該方法特別可用於分離具有複雜或複合操作(即一個以上的轉染異源基因和/或基因敲除)的體細胞，可能難以將體細胞在培養中保持長得足以影響所有希望的遺傳改變的時間。首先，體細胞，優選地通過核移植成為超年輕的細胞，用作基因打靶的底物。因此，能對體細胞進行第一次遺傳操作，然後能按照本發明的方法復壯，然後可在遺傳時鐘「復位」後進行第二次遺傳操作。因此，根據遺傳操作的複雜性和復壯過程的時間長度，根據本發明復壯的體細胞可具有基因組的至少一個改變。也包括用本發明的方法產生的復壯的、遺傳改變的細胞。
本發明也包括製備與不同細胞型的第一種細胞有相同基因型的體細胞的方法。復壯方法使這種方法成為可能，其實現方法是將第一種體細胞、第一種原代細胞的核或第一種原代細胞的染色體轉移到去核受體卵母細胞或其它合適的受體細胞中，或者使體細胞接觸卵母細胞中的蛋白質，以產生畸胎瘤或其它分化細胞團，其中含有外胚層、中胚層和內胚層之任一種的衍生物。也可使用在受精後立即去核的卵。因此，實際上可從畸胎瘤分離任何類型的細胞，或由畸胎瘤的細胞發育分化。特定目的細胞型獨特的特異細胞標記在本領域中周知，可用來鑑定克隆的原代細胞。
製備與用於核移植的細胞不同類型的體細胞的方法一般包括a.將第一種細胞、每一種細胞的核或第一種細胞的染色體移植到受體卵母細胞或卵或其它合適的受體細胞中，以產生胚胎；b.使用該胚胎獲得至少含有一種細胞的胚胎、內細胞團、胚盤和/或幹細胞；c.將內細胞團、胚盤和/或幹細胞注射到無免疫應答的動物血細胞培養物或禽卵中，形成畸胎瘤；d.分離得到的畸胎瘤；e.為了鑑定特異細胞型，分離不同的胚層；f.分離與第一種細胞不同類型的細胞。
在供體細胞、核或染色體來自人體的實施方案中，可修飾原代細胞的基因組，使細胞不能產生活的胚胎。其實現方法包括滅活或敲除形成三種胚層之一所需的一種或多種基因，或者從發育調節啟動子表達在非目的胚層所含細胞型中特異表達的「自殺」基因。此外，基因敲除或自殺基因表達可針對哺乳動物子宮附著或發育特別需要的基因。
如上所述，優選地，第一種(核供體)細胞是一種成纖維細胞。該方法可以用任何細胞種構成，特別可在人類治療克隆中用於產生用於移植的克隆器官和組織。因此，該方法可用人細胞施行，可以用分離的原代細胞產生一種組織(用於向需要移植的患者中移植)。
通過公開的方法產生的優選原代細胞類型是神經元、骨骼成肌細胞、心肌、皮膚胰腺β細胞、內皮細胞、造血細胞、皮膚細胞、毛囊細胞、腎細胞和神經細胞。該方法進一步包括從畸胎瘤中分離細胞，和在生長因子存在下培養該細胞，以促進進一步的分化。特別是，在核移植之前改變第一種細胞的基因組，使得新的原代細胞和產生的工程組織表達至少一種治療蛋白，或者不能表達可能對供體患者有害的天然蛋白質。也包括由公開的方法產生的細胞和組織。
由此處公開的方法產生的細胞和組織的優選用途包括產生神經元、胰島細胞、肝細胞、心肌細胞、造血細胞和其它希望的分化細胞型和組織。
這些細胞和組織(任選地可以是轉基因的)可用於細胞、組織和器官移植，例如，bum的治療、毛髮移植、癌症、慢性痛、糖尿病、侏儒症、癲癇、心臟病如心肌梗塞、血友病、不育症、腎病、肝病、骨關節炎、骨質疏鬆症、中風、情感障礙、阿爾茨海默氏病、酶缺陷、亨廷頓舞蹈症、低膽固醇血症、甲狀旁腺功能減退症、免疫缺陷、Lou Gehrig病、黃斑退化、多發性硬化症、肌營養不良、帕金森氏病、類風溼關節炎、脊髓損傷和其它創傷。
因為核移植技術在產生克隆哺乳動物以及克隆細胞和組織中有用，本發明的方法也可用於產生具有複雜或複合遺傳改變的克隆哺乳動物。另外，本發明也可用於生產年輕、更優選地超年輕的動物。特別是，本發明包括一種再克隆克隆動物的方法，其中再克隆的動物相比克隆動物遺傳改變。該方法在本發明的發現之前未曾嘗試，這顯示核移植可復壯晚代細胞並恢復端粒長度。如果再克隆的哺乳動物與克隆的遺傳動物有相同的遺傳年齡(即，與第一種核供體相同的遺傳年齡)，根據克隆代數，該方法的可行性將降低。發明者迄今獲得的結果表明這不是事實，實際上再克隆能隨意進行多次，並將產生「超年輕的」動物、胚胎和細胞。超年輕的動物一般具有可產生抗體的增強的免疫系統，和增強的表層色素沉著。
根據本發明的一種優選的再克隆方法包括下列步驟，並且可用來產生至少具有兩個遺傳修飾的克隆動物a.從目的動物中獲得原代細胞，b.通過插入異源DNA和/或缺失天然DNA對原代細胞進行第一次遺傳修飾，c.使用第一次遺傳修飾的原代細胞作為核供體，用於向去核卵母細胞或卵或其它合適的受體細胞中核移植，d.獲得具有第一種遺傳修飾的克隆胚、胎或動物，e.由克隆胚、胎或動物獲得克隆的原代細胞，f.通過插入異源DNA和/或缺失天然DNA對克隆的原代細胞進行第二次遺傳修飾，g.使用第一次和第二次遺傳修飾的克隆原代細胞作為核供體，用於向去核卵母細胞或卵或其它合適的受體細胞中核移植，h.獲得具有第一種和第二種遺傳修飾的再克隆的胚、胎或動物。
該方法可以重複任意多次。優選地，至少一個再克隆步驟使用繁殖為衰老或接近衰老或關卡停滯的供體細胞，使得再克隆的細胞的端粒在核移植後再生或恢復。特別是，本發明的方法進一步包括以下步驟再次克隆再克隆的胚、胎或動物，進行第三次遺傳修飾，使再克隆具有第一種、第二種和第三種遺傳修飾。因此，該方法可用來產生大量基因被敲除、插入或置換的動物，並且可用來產生整個細胞系統被替換或修飾(即人免疫系統被替換為牛的免疫系統)、涉及複雜酶途徑(如與凝集因子有關的途徑，或補體級聯等)的基因置換的動物。
本發明的再克隆方法將能產生複雜的動物模型，用於研究與多種基因和/或細胞型有關的疾病，也許不能被表達單轉基因或目的單基因被敲除的典型動物模型複製。而且，可以用這些動物模型研究複雜遺傳背景中治療基因的作用。也可以用這些動物模型產生和檢測可調節不同基因表達的產物，敲除參與引發免疫應答的基因，用同源相應物置換膠原基因或其它結構蛋白基因，等等。
本發明包括令人驚奇的發現衰老細胞可以被復壯，EPC-1活性和與老化有關的其它細胞標記可以提高，端粒酶可以被激活，端粒可以被延長，串聯重複可以被修復，所有這些都是通過核移植方法。因此，本發明包括激活端粒酶活性和/或EPC-1活性的新途徑的發現，其用途遠遠超出延長端粒和複製壽命。我們也預測對串聯重複DNA序列的其它修復。特別是，本發明提供了一種分離端粒酶激活、EPC-1激活或其它老化相關基因激活機制的方法，以及用鑑定的機制調節端粒酶或EPC-1或其它基因的方法。
例如，能分級分離卵母細胞的細胞質，使其與致死細胞或致死細胞核或端粒結合，測定端粒酶激活、EPC-1激活(或與老化有關的其它細胞標記)和端粒延長。通過這種測定，能鑑定和分離卵母細胞中負責重新激活端粒酶、EPC-1活性和/或其它年齡相關細胞標記的活性成分。類似地，能從卵母細胞中分離RNA或cDNA，並轉染致死細胞，或在用於檢測端粒酶活性的無細胞系統中表達，並且可以鑑定證明有端粒酶活性的轉染細胞或無細胞系統。這些方法能結合扣除雜交技術，以富集在胚胎形成過程中而不是在衰老過程中表達的RNA。這樣，可以鑑定編碼可能與端粒酶激活有關的酶的基因。
恰好在受精後階段內的卵母細胞或卵可能含有一種以上的參與端粒酶激活的基因或蛋白質。不希望拘泥於任何特定理論，發明者認為，在卵母細胞或在卵母細胞發育產生的ES細胞或生殖細胞中存在至少一種調節蛋白或RNA，它參與端粒酶活性的調節，和ALT途徑，特別可響應衰老細胞環境的某些方面。這些蛋白質或RNA直接激活端粒酶或端粒酶基因表達是可能的，但這些蛋白質或RNA通過抑制端粒酶抑制劑或衰老或接近衰老細胞中存在或表達的ALT途徑起作用也是可能的。一種可能的端粒酶激活劑是Oct4或Rex。
例如，Xu等人證明，腫瘤細胞中成視網膜細胞瘤蛋白的再次表達誘導衰老並抑制端粒酶活性(Oncogene(1997)152589-2596)。最近的報導也表明，染色體3上的一個基因可能參與hTERT(端粒酶的催化亞基)的轉錄抑制。參見http//claim.springer.de/EncRef/CancerResearch/samples/0001.htm。也已經鑑定了幾種可與端粒酶直接相互作用的蛋白質，如p23/hsp90(分子伴侶)和TEP1(端粒酶相關蛋白1)。LawrenceBerkeley國立實驗室的研究人員宣稱克隆了另外兩種人端粒相關蛋白(Tin1和Tin2)。Federal Technology Report，1999年12月30日，Partnership Digest，Technology Watch，第9頁。因此，本方法確定的調節機制可通過結合或抑制端粒酶結合蛋白或端粒酶抑制劑的表達起作用，從而提高端粒酶活性，但也能通過上調基因表達或增強蛋白質穩定性調節端粒酶活性。
本發明包括鑑定至少一種可直接或間接增強端粒酶活性或ALT途徑的基因的方法。這些方法包括針對可增強衰老或接近衰老的細胞中端粒酶或ALT活性的成員，篩查由胚胎或胚胎幹細胞產生的cDNA或mRNA文庫。這些方法也可包括鑑定至少一種可直接或間接抑制端粒酶或ALT活性的基因，包括，針對可抑制胚胎幹細胞中的端粒酶活性的成員，篩查由衰老或接近衰老的細胞產生的cDNA或mRNA文庫。端粒酶活性可以通過本領域周知的任一種方法測定，包括測定報導基因表達(如hTRT基因)或融合蛋白。一種優選的報導分子是綠色螢光蛋白(GFP)。端粒酶活性也可以用TRAPeze試驗測定。篩查方法可以與其它周知的方法結合，以提高篩查方法的效能，例如，如果測試文庫由卵母細胞或ES細胞產生，則在文庫篩查之前，使cDNA或mRNA文庫與來自衰老細胞的cDNA或mRNA文庫扣除雜交，反之亦然。
本發明也包括鑑定可提高端粒酶、年輕基因表達模式或ALT活性的蛋白質的方法，包括(a)收集卵母細胞、胚胎或胚胎幹細胞的細胞質的級分，(b)將其加入為衰老或接近衰老的細胞設計的無細胞系統中，和(c)測定接觸特異卵母細胞或ES細胞質級分引起的端粒酶、年輕基因表達或ALT活性的改變。也包括篩選可抑制端粒酶或年輕基因表達的化合物的方法，包括使通過核移植技術用衰老或接近衰老的供體細胞產生的胚胎幹細胞接觸一種化合物，以確定該化合物是否抑制端粒酶、年輕基因表達或ALT活性。
本發明也包括生產已經用年輕基因或調節序列(優選地與合適的標記連接)轉染的細胞，和用這些細胞鑑定可上調年輕基因表達的化合物的方法。這些篩選法鑑定可調節細胞增殖或老化的化合物。假設幾種基因可能在調節細胞增殖和周期中起作用，包括EPC-1、gas基因(Ciccarelli等人，Mci.Cell.Bid.10(4)1525-1529(1990)，如gas-2、-3、-5、-7)、PI-3激酶(Tresini等人，Cancer Res.58(i)1-4(1998))、膠原酶、tPA。
另一種篩選是修飾含有標記基因(即GFP)的體細胞，更優選地一種老化體細胞，其中標記基因與其表達隨細胞老化改變的基因即端粒酶融合或結合。端粒酶基因和/或啟動子可以與標記基因以一系列截短的形式融合，然後可用標記構建體轉染衰老或接近衰老的細胞。然後可利用核移植鑑定端粒酶基因中的區域或基因啟動子或在核移植後參與激活端粒酶表達的上遊區。
此外，本發明也包括將EPC-1和其它年輕基因置於異源(如可調節的，優選地強)啟動子控制下，以及估計表達增強或降低對端粒酶活性和端粒的影響。
本發明也包括遺傳修飾的體細胞確定端粒調節和ALT途徑中基因作用的情況。例如，當在ALT之前在體細胞中敲除這些基因時，可根據ALT功能的喪失確定對於ALT功能關鍵的基因。
本發明也包括通過上述方法鑑定的調節化合物、蛋白質和核酸，和含有它們的藥用組合物，它們可以被分離，並用作根據本發明的外源端粒酶激活劑和用於此處所述的用途，即，用於年齡相關疾病的治療，老化組織(如視網膜細胞)的治療，癌症的治療，和提高骨髓移植的效能。
通過公開的實施例說明了本發明的範圍和精神。
實施例1——胎供體細胞這一初步試驗表明，能用體細胞核移植恢復原代培養細胞的壽命。當將來自6周齡胎的成纖維細胞培養至衰老時，它們經歷約30次群體倍增，平均細胞周期為28-30小時。為了檢驗通過核移植是否能拯救這些細胞不再衰老，用距衰老0.8次群體倍增的細胞產生40天的胎。來自該胎的成纖維細胞經歷31次群體倍增，與之相比，來自正常懷孕的同齡胎的成纖維細胞為33次倍增。數據表明，核移植能使衰老細胞復壯。
實施例2由衰老供體體細胞產生的克隆小牛一種體細胞株來自45天的雌性牛胎(BFF)，並用PGK引導的選擇盒轉染。用G418選擇細胞10天，分離出5個新黴素抗性菌落，並用全長cDNA探針通過Southern印跡分析穩定轉染。通過FISH分析確定一個細胞株(CL53)為63％[總核]轉基因陽性，挑選進行本研究中所述的核移植研究。
傳代CL53成纖維細胞(其特徵為細胞角蛋白陰性，波形蛋白陽性)直到完成其壽命的95％以上。利用光學顯微鏡的細胞相差照片顯示(

圖1A)，細胞的形態學與接近生命終點的細胞一致。用電子顯微鏡的更詳細的超微結構分析證明，這些細胞顯示複製衰老的其它特徵，包括與年輕細胞相比突出且活躍的高爾基體，增多的內陷和葉狀的核，大溶酶體，和細胞質微絲的增多(圖1B)(27)。另外，這些晚代細胞顯示衰老表型，顯示進入S期的能力降低，3H胸苷摻入減少(圖1C)和衰老相關β-半乳糖苷酶(SA-β-gal；數據未顯示)染色顯著增加(28)證實了這一點。而且，這些細胞與前代牛BEF細胞相比也顯示EPC-1(早期群體倍增水平cDNA-1)(29)mRNA水平降低，降低方式類似於WI-38細胞老化過程中觀察到的改變(圖1D)。
如上所述(13)通過核移植用衰老CL53細胞重建了總共1896個牛卵母細胞。培養1周後鑑定出87個胚泡(5％)。將大多數胚胎(n＝79)移植到孕激素同步化的受體中，移植40天後超聲波檢測32個受體中有17個(53％)懷孕。在妊娠的第7周選擇性取出1個胎牛(ACT99-002)，而剩餘的9個受體(29％)仍然妊娠直到妊娠12周。這些母牛中的3個在妊娠第252天(孿生)、第253天和第278天流產。剩餘的6個受體繼續發育至足月。將使用衰老CL53細胞的胚泡形成(5％)、早孕(53％)和足月妊娠(19％)的比率與使用由前代BFF細胞獲得的非衰老供體(CL57)細胞產生的對照胚胎(分別為5％、45％和13％)相比較。
小牛CL53-1、CL53-8、CL53-9、CL53-10、CL53-1 1和CL53-12分別在妊娠第280、273、273、273、266和266天通過選擇性剖宮產術分娩(圖2)。基因組分析證實在兩隻動物(CL53-1和CL53-12)中以及在妊娠第49天選擇性取出的胎牛中存在轉基因。出生時，克隆牛的表現與以前公開的報導一致(13，15，30，31)。出生體重(51.6±3.6kg)一般增加，幾隻小牛在出生時經歷了肺性高血壓和呼吸窘迫，以及在第4個月接種後的發熱。在前24小時後，牛已經精力充沛，沒有健康問題。然而，我們注意到在前2個月中有中度的多尿/多飲和乾料攝入減少。這些併發症的發生與供體細胞群體(分離株53或57)和轉基因整合的存在與否都無關。在大約2個月後，所有小牛都表現良好，類似於由體外受精和體骨胚胎移植產生的健康對照小牛。所有6隻克隆動物在出生5-10個月後都存活並且正常。
從克隆小牛中分離皮膚成纖維細胞，mRNA如圖1D所述製備。細胞表達EPC-1 mRNA的水平相當於或高於前代胎細胞。為了排除一小部分未衰老細胞產生克隆動物的可能性，以正常和克隆密度接種CL53供體細胞。如圖3B所示，細胞距複製衰老有2.01±0.11(SEM)的群體倍增。以克隆密度接種的不到12％(11/97)和3％(2/97)的細胞分別經歷1次或2次以上的群體倍增，而沒有細胞分裂超過3次(圖3C)。相反，前代(轉染前)BFF細胞經歷47.8±0.9次群體倍增，對數生長期中的平均細胞周期長度為17.8±0.7(圖3A)。
為了檢驗體細胞核移植方法是否能恢復衰老供體細胞的增殖壽命，我們培養了來自選擇性取出的7周胎牛(ACT99-002)的成纖維細胞。細胞株經歷了85.3±5.6次群體倍增，對數生長期中的平均細胞周期長度為17.7±0.8(圖3A)。單細胞克隆(n＝5)由克隆的(ACT99-002)和原始的(BFF)年齡相當的胎產生，並分離通過免疫組化染色表徵為成纖維細胞的培養物。這些單細胞克隆距克隆的和原始的胎分別31.2±3.4和25.9±2.9次群體倍增(圖3D)。這些數據表明，克隆能復原衰老細胞的壽命，胎的細胞年齡不反映核移植前供體細胞在培養中倍增的次數。
為了進一步研究核移植拯救衰老細胞的能力，在與直接FITC-標記的(CCCTAA)肽核酸探針(流式FISH)原位雜交後，用流式細胞分析將克隆動物的具核血細胞中的端粒長度與年齡相當的對照動物(新生小牛(＜2周齡)和老母牛(10-19歲))相比較(32，33)。兩個獨立實驗的結果(圖4A)表明，相對於年齡相當的對照，克隆動物中端粒長度完全恢復(63.4±1.7比51.0±3.1 kMESF[平均值±s.d.，P＜0.0001，實驗1]，和75.7±1.7比61.4±3.2 kMESF[P＜0.0001，實驗2])。確實，克隆動物的端粒在統計學上長於4隻新生小牛(實驗2)(75.3±1.2比66.9±1.4，P＜0.0002)。對於實驗1和實驗2，老牛的平均端粒長度分別為47.7±0.7kMESF和52.0±3.6 kMESF。
也利用末端限制片段的Southern分析(34)研究了衰老(CL53)、對照(轉染前BFF)和克隆(ACT99-002)細胞中的端粒長度動力學。結果(圖4B-D)與具核血細胞的流式FISH分析一致。來自克隆胚的細胞的端粒(19.3kb)長於衰老和前代供體細胞(分別是16.2和17.9kb)(比較道4、5、6，圖4B)。對相同細胞端粒長度的流式細胞分析(流式FISH，ref 32)證實了這些結果(圖4D)。通過TRAP測定，在重建7天的胚中也檢測到高水平的端粒酶活性(圖5，道5-8)，而在核移植實驗中用作供體細胞的牛成纖維細胞是陰性的(圖5，道9)。
討論以前未曾描述克隆動物中的端粒恢復。我們的結果明顯不同於Sheils等人的研究(20)，其中綿羊中的端粒侵蝕在核移植後似乎不能修復。發現3隻克隆動物——6LL3(多利，從成年供體細胞獲得)、6LL6(由胚供體細胞產生)和6LL7(由胎供體細胞產生)的端粒長度相對於年齡相當的對照動物降低。作者提出，由於這些動物的產生沒有種系參與，所以端粒長度的完全恢復不能發生。他們還提出，多利的較短的TRF與核移植前供體細胞培養花費的時間一致。這些發現具有重要意義，不僅是因為由衰老的體細胞產生了活的後代，而且因為核移植方法似乎延長了動物的端粒，超過新生和年齡相當的對照動物。還不知端粒的量度是否能反映這些動物的壽命，儘管發現來自克隆胎的細胞比由相同年齡的原始未操作胎獲得的細胞有更長的增殖壽命。實際上，在後者中觀察到的平均TRF大小符合這些發現。
在關於克隆的討論中，常常問到通過核移植產生的動物是否是使用某些稀有細胞而不是大多數培養細胞的結果。大量培養物含有可達到的最長細胞壽命不同的多個譜系(43)。實際上，本研究中使用的晚代細胞代表最初具有最大壽命的細胞。如果在晚代培養物中仍有20或更多群體倍增的年輕細胞亞組，則它們增殖培養，如同在常見自發無限增殖的小鼠細胞培養物中所看到時。預期到這一相反意見，我們將供體細胞以克隆密度接種，並對每個細胞的增殖壽命評分。347個細胞中的339個(98％)經歷少於3 PD，而347/347(100％)經歷4次或更低的PD。而且，細胞在高血清(15％)濃度中培養，年輕細胞將快速增殖，在平皿中易於觀察。樣品中年輕細胞的可能性因而＜1/347。仍然從衰老的胎細胞群中克隆了7隻動物(6隻足月動物和1隻胎)。因而偶然由不可檢測的年輕細胞克隆動物是不可能的(p＜0.001，卡方)。
本研究與Shiels等人的報導(20)的不同可能是由於選擇供體體細胞型上的不同。例如，Wilmut等人(12)使用靜止的(G0)供體乳房上皮細胞產生多利，而在本實驗中使用衰老的(G1)成纖維細胞。實際上，最近的研究顯示，端粒酶活性的重建導致端粒延長和正常人成纖維細胞的無限增殖(35，36)，而使用乳房上皮細胞的類似實驗不引起端粒延長和複製壽命延長(37)。提出用細胞在端粒酶延長端粒的能力上或在適應培養後激活的信號傳導途徑上的差異來解釋這些差異(38)。但是，其他研究者報導，hTERT的外源表達可延長端粒並使人乳房上皮細胞無限增殖化(J.Shay，個人通信)。
以前的研究證明在牛早期胚胎形成過程中端粒酶活性明顯上調(39)。本研究中端粒的延長提示，通過核移植重建的牛胚具有端粒長度再生和保持的機制，只要在附著前和附著後的發育全過程中染色體穩定。
實施例3利用成年供體細胞的核移植用胎成纖維細胞供體獲得的上述數據與用成年動物獲得的衰老細胞進行的實驗一致。皮膚成纖維細胞由3個Holstein steer培養。分離單細胞克隆，計數群體倍增直到衰老。用這些衰老或接近衰老的成纖維細胞進行核移植。在妊娠第6周從子宮中取出胎兒，從中分離成纖維細胞，培養直到衰老。細胞通過免疫組化分析，顯示是成纖維細胞。在核移植時成年動物(計數為衰老前的PD數)和由其產生的6周齡胎的原始細胞中群體倍增的次數在表1中列出。從克隆胎中分離的細胞株平均經歷89.4±0.9 PD，與之相比，由正常年齡相當(6周齡)的對照胎產生的細胞株為60.5±1.7 PD(P＜0.0001)。這些數據表明，克隆能復原(實際上延長)體細胞的壽命，胎的細胞年齡不能反映核移植前供體細胞在培養中倍增的次數。
表1來自正常胎和成年衰老細胞克隆群體產生的胎的成纖維細胞的群體倍增
實施例4成年供體細胞型的分析組織活檢從成年母牛的所有三個胚層中獲得(在屠宰時獲得)。特別是至少收集下列細胞外胚層—角質細胞中胚層—皮膚成纖維細胞內胚層—腸上皮立即評估上述三種細胞型的一部分，以確定端粒長度。這可通過不同方法實現。所有3種細胞型的剩餘部分培養直到衰老。在培養過程中，保留並凍存每一群體的一部分。根據特殊的群體倍增標記凍存的不同細胞樣品。
此後，評價不同細胞樣品的端粒長度，尤其包括在衰老時獲得的細胞。
實施例5由成年衰老供體體細胞產生的克隆小牛將用由實施例4獲得的細胞獲得克隆牛胎。特別是，用全部3種細胞型，並使用不同群體倍增的細胞，即離衰老0.8群體倍增的細胞，產生牛克隆。克隆牛胎基本上按照美國專利5,945,577所公開的方法產生，在此引用作為參考。在40天時取出克隆胎，從中分離全部3種類型的細胞，例如，角質細胞、皮膚皮纖維細胞和腸上皮細胞。
另外，也用兩個同齡(40天)野生胎回收同樣3種細胞作為對照。這些細胞，以及從克隆胎分離的細胞，培養至衰老。
此外，在從動物或從分離後冷凍的這些細胞中分離後，立即測量這些不同類型培養細胞的端粒長度。再次取出細胞，並從不同細胞群體中冷凍直到衰老。之後對在不同細胞群體倍增時獲得的不同細胞型，對來自克隆和野生型胚的培養細胞，計算端粒長度。
結果與實施例4的結果比較。這些實驗目前正在進行。
實施例6年輕細胞對比老細胞中的EPC-1表達比較年輕或老的人、牛細胞、克隆動物和對照中的EPC-1表達。結果如下。
結果表明，來自克隆動物的年輕細胞比從正常動物獲得的年輕細胞更年輕，如通過EPC-1表達測定的。在這些細胞中，作為一種標記的端粒長度也恢復到更年輕的水平。其解釋可能是，端粒在永生系中保持較長長度時具有缺陷的性質，端粒不能經常接近內部序列。因此，當從端粒向著絲粒閱讀序列時，(T2AG3)n重複的保真性破壞。這在下面用圖顯示。
衰老次要問題已經用3』5』核酸外切酶修飾，然後再次暴露可恢復TRF-2結合的T2AG3。然而，在某種程度上，損傷引發了所謂的末期細胞衰老。
Wilmut認為，由衰老細胞克隆在動物中可產生問題，因為端粒長度反映了體細胞供體核的端粒縮短。然而，我們的結果提示實際上相反。培養細胞至衰老或接近衰老，或關卡停滯，使細胞丟失T2AG3，用3』5』核酸外切酶消除次要損傷，可提供一個機會，即，將該基因移植到去核卵母細胞或其它胚胎細胞中，隨後是端粒酶活性的爆發，重建純T2AG3束(比正常存在的要長)。這些細胞將具有更長的壽命，而且，由於T2AG3的純度，在臨時細胞周期中很少有細胞停滯。這將導致高於正常有絲分裂細胞指數，包括基因擴充的「更年輕」模式。
為了更全面地研究，用年齡相當的哺乳動物的培養物和由年輕和衰老細胞和含或不含縮短的端粒的細胞克隆的克隆樣品進行實驗。這些細胞生長至衰老，每15pd冷凍。比較這些細胞的細胞衰老標記。通過周知的方法(例如Northern印跡或用合適的探針標記)比較這些細胞中的基因表達。
實施例7核移植產生的胚中升高的端粒酶水平為了研究端粒酶延伸的機制，在牛系統中檢測了核移植(NT)後早期胚胎發育中的端粒酶活性水平。類似於以前公布的關於正常(IVF)牛胚的結果(Betts和King，1999，Dev.Genetics 25397-403)，端粒酶在所分析的早期發育的所有階段都是可檢測的。對於NT和IVF對照胚胎，端粒酶活性水平在8-16細胞年齡時降低，然後在桑椹胚和胚泡期升高(數據未顯示)。然而，NT胚泡中的端粒酶水平比相應的IVF胚泡高2倍。
實施例8相對於年齡相當的對照，克隆動物超年輕的免疫功能為了研究核移植後免疫衰老逆轉的程度，並確定克隆動物是否具有比年齡相當的對照增強的免疫功能，在體外接觸不同有絲分裂原後，檢測了來自克隆母牛的細胞相對於來自對照母牛的細胞的免疫應答。在對TSST(毒性休克症候群毒素，一種可誘導T細胞增殖的細菌超抗原)的應答，和對可誘導T細胞和B細胞增殖的商陸原有絲分裂原(PWM)的應答方面，克隆動物和對照動物有顯著差異。在培養的第2天和第3天都觀察到差異。對PHA(另一種T細胞有絲分裂原)的應答也觀察到差異，但變化更大。對PHA應答觀察到的差異顯著性可通過檢測大量受試者來確定。對ConA(一種T細胞有絲分裂原)的應答的差異較小，在統計學上不顯著。對於TSST和PWM，差異約為2倍，72小時TSST系統顯示2.6倍的影響。結果在下表中列出。
未檢測對有絲分裂原的體內反應，假定在接種後觀察到克隆動物有增強的敏感性。然而，對記憶抗原的皮膚延遲型過敏反應的體內試驗將有較低的危險，並且能用來分析體內免疫應答。
也可使用可用於分離特異細胞型的試劑進行體外試驗，以檢測特異細胞型(即T細胞亞群、B細胞、巨噬細胞等)的應答。也可用常規方法檢測特異胞質分裂的產生水平。
78小時培養物的平均值
結論和本發明的廣泛用途如我們在此公開的，根據Wilmut，核移植引起的體細胞中端粒的延長本身是不明顯的。但甚至根據以前的結果，從衰老細胞開始將產生更好的結果(更長的端粒，更長壽的細胞)這一事實是不明顯的。
儘管現在，對於將端粒縮短翻譯成細胞衰老表型的機制或細胞周期的中間減緩意見很不一致。以前的文章提出，端粒重複的逐漸丟失導致端粒基因的丟失和關鍵細胞功能的喪失。Woodring E.Wright在幾年前提出了一種模型，即端粒縮短移動了與端粒有關的異染色質，使端粒基因沉默，隨後導致衰老。Bryant Villeponteau發表了幾乎相反的意見，即，存在與端粒有關的錐形異染色質，它隨端粒縮短而縮短，這激活接近端粒的基因。Titia de Lange在最近關於TRF2和T環的文章中提出，衰老細胞不再能結合TRF2和形成T環。然而，另一種可能性是，在端粒中「散布」著非端粒序列，其中在端粒處有更多的純TTAGGG，在內部較少。當體細胞中端粒縮短時，細胞逐漸遇到端粒處的非端粒序列，它們不能結合TRF2，最終提高激活的p53(然後p21)的水平，引起細胞周期的減緩和最終的停止。問題是，年輕細胞增殖和突然衰老可能不是全部的現象或者沒有這種現象。可能是數量逐漸增多的損傷的端粒逐漸升高p21。
我們的結果提示，通過衰老人工去除端粒，然後在核移植後快速重新合成正確的TTAGGG，可產生在年輕的狀態下比正常細胞更長時間增殖的細胞和動物。對於進化，選擇將比需要繁殖的存活更長的細胞和動物沒有任何原因。因此，對於種系，產生具有比需要的更均一的TTAGGG的體細胞沒有原因。培養細胞至衰老的技術可有效地去掉好的和壞的端粒序列，然後核移植將給予細胞比正常具有的更好的壽命潛能。即使細胞具有與正常細胞相當的端粒長度，這也是事實。這將產生長期具有較高有絲分裂指數的細胞，和老化較慢和存活更長的動物。
因此，使用端粒延長乃至沒有端粒延長的核移植方法可導致端粒中新的均一TTAGGG重新合成。不受假說的限制，發明者們認為這可通過單獨的或與其它基因(如生長停滯序列(gas基因)、膠原酶、tPA等)結合的端粒酶、EPC-1的上調發生。這將產生存活更長和更健康的動物，和用於人類治療的「超年輕」的細胞。這是第一次證明超年輕細胞，即，具有總體表型的一群細胞和組織，即比正常混合的一群年輕細胞更年輕，即，基因表達模式和有絲分裂指數比正常年輕細胞更年輕。使用端粒酶僅僅延長端粒和細胞的壽命。然而，據發明者所知，所有公開報導都沒有證據表明能獲得總體表型更年輕或超年輕的細胞。實際上，許多研究人員報導，已經減緩的老的但還不是衰老的細胞繼續隨端粒酶緩慢但無限地分裂。
本發明的一個優選用途是使端粒短到達到希望的壽命，但使TTAGGG的均勻性最高。這將優化壽命與癌症危險的微妙平衡，即，細胞將不是組成型無限增殖的，它們沒有比必需的更長的端粒，以致限制異常細胞的克隆擴充。
預計用該技術由衰老細胞克隆的動物將具有獨特的性質。例如，預計為了皮毛產生的動物將更均勻的毛色，將具有增強的免疫應答，將具有更強的疾病抗性，並且具有其它優點。
如我們所說，具體的醫學用途可以是用於年齡相關的疾病，如年齡相關的黃斑退化、帕金森氏症、阿爾茨海默氏病，骨關節炎、免疫衰老、皮膚老化、肺氣腫、動脈瘤、冠心病、高血壓、白內障、成年發作的糖尿病，等等。另外，與細胞更新加速有關的疾病如肌營養不良、帶狀皰疹、AIDS和肝硬化也能通過施用再生的細胞治療。
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權利要求
1.一種復壯原代細胞的方法，包括a.將原代細胞、原代細胞的核或原代細胞的染色體移植到受體卵母細胞或卵中，以產生胚胎；b.使用該胚胎獲得內細胞團、胚盤和/或幹細胞；c.將內細胞團、胚盤和/或幹細胞注射到無免疫應答的動物中，形成畸胎瘤；d.分離得到的畸胎瘤；e.為了鑑定特異細胞型，分離不同的胚層；f.分離與原代細胞相同類型的細胞。
2.權利要求1的方法，其中所述原代細胞是一種衰老細胞或接近衰老的細胞。
3.權利要求1的方法，其中從核移植畸胎瘤中分離的細胞含有與不是通過核移植技術產生的同齡對照畸胎瘤的細胞平均至少一樣長的端粒。
4.權利要求3的方法，其中所述端粒平均長於不是通過核移植技術產生的同齡對照畸胎瘤的細胞。
5.權利要求2的方法，其中所述原代細胞是一種成纖維細胞。
6.權利要求1的方法，其中所述無免疫應答動物是SCID或裸鼠。
7.權利要求1的方法，其中所述原代細胞至少具有基因組上的一個改變。
8.一種產生與不同細胞型的第一種細胞有相同基因型的原代細胞的方法，包括a.將第一種細胞的核移植到受體卵母細胞中，以產生胚胎；b.使用該胚胎獲得內細胞團、胚盤和/或幹細胞；c.將內細胞團、胚盤和/或幹細胞注射到無免疫應答的動物中，形成畸胎瘤；d.分離得到的畸胎瘤；e.為了鑑定特異細胞型，分離不同的胚層；f.分離與第一種細胞不同類型的細胞，其中新原代細胞的端粒至少與不是通過核移植技術產生的畸胎瘤中同齡對照細胞的端粒一樣長。
9.權利要求8的方法，其中所述第一種細胞是一種衰老細胞或接近衰老的細胞。
10.權利要求9的方法，其中所述第一種細胞是一種成纖維細胞。
11.權利要求8的方法，其中所述原代細胞是選自平滑肌、骨骼肌、心肌、皮膚和腎的類型。
12.權利要求8的方法，其進一步包括在生長因子的存在下培養不同類型的細胞，以促進進一步的分化。
13.權利要求11的方法，其中用所述原代細胞產生組織(用於向需要移植的患者中移植)。
14.權利要求8的方法，其中第一種細胞的基因組在核移植之前改變。
15.通過權利要求8的方法分離的細胞。
16.通過權利要求13的方法分離的組織。
17.權利要求7的方法，其中所述遺傳改變包括至少一種異源基因的轉染。
18.權利要求7的方法，其中所述遺傳改變包括至少一種天然基因的破壞。
19.權利要求14的方法，其中所述遺傳改變包括至少一種異源基因的轉染。
20.權利要求14的方法，其中所述遺傳改變包括至少一種天然基因的破壞。
21.一種對原代細胞進行複合遺傳操作的方法，包括在遺傳操作之間利用向受體卵母細胞中核移植復壯該原代細胞，其中在核移植之前將該細胞傳代為衰老或接近衰老的狀態。
22.一種對原代細胞進行複合遺傳操作的方法，包括在遺傳操作之間利用向受體卵母細胞中核移植復壯該原代細胞，其中在核移植之前將該細胞誘導為衰老樣或接近衰老樣狀態。
23.權利要求21的方法，復壯由此產生含有的端粒平均與同齡對照胚胎細胞一樣長的胚胎細胞。
24.根據權利要求21的方法遺傳改變的一種原代細胞。
25.一種生產與權利要求24的細胞有相同基因型的遺傳改變的動物的方法，包括a.將所述細胞的核移植到受體卵母細胞中，b.用該具核卵母細胞產生胚胎或胚胎幹細胞，c.將胚胎或胚胎幹細胞導入雌性受體中，和d.使胚胎或胚胎幹細胞完全發育，使得雌性分娩與原代細胞有相同基因型的新生動物。
26.通過權利要求25的方法產生的遺傳改變的動物，該動物含有平均至少與同齡對照動物一樣長的端粒。
27.一種用核移植技術再克隆一種克隆動物的方法，其中用來供應再克隆的核的供體細胞是一種衰老或接近衰老的細胞。
28.權利要求25的方法，其中再克隆的動物與克隆動物相比遺傳改變。
29.一種生產至少含有兩種遺傳修飾的再克隆的內細胞團、胚泡、畸胎瘤、胚、胎或動物的方法，包括a.從目的動物中獲得原代細胞，b.通過插入異源DNA和/或缺失天然DNA對原代細胞進行第一次遺傳修飾，c.使遺傳修飾的原代細胞增殖為衰老或接近衰老，d.使用第一次遺傳修飾的衰老或接近衰老的細胞作為核供體，用於向去核卵母細胞或去核受精卵中核移植，e.獲得具有第一種遺傳修飾的克隆內細胞團、胚泡、畸胎瘤、胚、胎或動物，f.由克隆的內細胞團、胚泡、畸胎瘤、胚、胎或動物獲得克隆的原代細胞，g.通過插入異源DNA和/或缺失天然DNA對克隆的原代細胞進行第二次遺傳修飾，h.使第二次克隆的原代細胞增殖直到衰老或接近衰老，i.使用具有第一次和第二次遺傳修飾的衰老或接近衰老的克隆原代細胞作為核供體，用於向去核卵母細胞或去核受精卵中核移植，和j.獲得具有第一次和第二次遺傳修飾的再克隆的內細胞團、胚泡、畸胎瘤、胚、胎或動物。
30.權利要求29的方法，其進一步包括將再克隆的內細胞團、胚泡、畸胎瘤、胚、胎或動物再克隆的步驟，其中進行第三次遺傳修飾，使得再克隆具有第一次、第二次和第三次的遺傳修飾。
31.權利要求30的方法，其中通過核移植技術用衰老或接近衰老的供體細胞產生再克隆。
32.權利要求29的方法，其中所述再克隆含有至少與不是用核移植技術產生的同齡對照動物平均一樣長的端粒。
33.權利要求31的方法，其中所述再克隆含有至少與不是用核移植技術產生的同齡對照動物平均一樣長的端粒。
34.權利要求29的方法，其中遺傳修飾涉及負責免疫功能的基因。
35.權利要求29的方法，其中目的動物是一種有蹄動物。
36.權利要求35的方法，其中目的動物是牛。
37.一種復原衰老、關卡停滯或接近衰老的細胞壽命的方法，包括將該細胞的核移植到受體卵母細胞中。
38.權利要求37的方法，其中受體卵母細胞與衰老或接近衰老的細胞是不同種的。
39.權利要求37的方法，其進一步包括由所述具核卵母細胞產生胚胎或胚胎幹細胞。
40.一種鑑定至少一種可直接或間接提高端粒酶活性的基因的方法，包括針對可提高衰老或接近衰老細胞中端粒酶活性的成員，篩查由胚胎或胚胎幹細胞產生的cDNA或mRNA文庫。
41.權利要求40的方法，通過測定增強的端粒酶報導基因表達測定端粒酶活性的提高。
42.權利要求41的方法，其中構建所述端粒酶報導基因，使之含有與一種報導基因融合的hTRT基因。
43.權利要求42的方法，其中該構建體含有基因融合。
44.權利要求42的方法，其中該構建體含有蛋白質融合。
45.權利要求40的方法，通過TRAPeze試驗測定提高的端粒酶活性。
46.權利要求40的方法，在文庫篩查之前，使所述cDNA或mRNA文庫與來自衰老細胞的cDNA或mRNA文庫進行扣除雜交。
47.一種鑑定至少一種可直接或間接抑制端粒酶活性的基因的方法，包括針對可抑制胚胎幹細胞中端粒酶活性的成員，篩查由衰老或接近衰老的細胞產生的cDNA或mRNA文庫。
48.權利要求47的方法，通過測定降低的端粒酶報導基因表達測定端粒酶活性的降低。
49.權利要求47的方法，其中構建所述端粒酶報導基因，使之含有與一種報導基因融合的hTRT基因。
50.權利要求49的方法，其中該構建體含有基因融合。
51.權利要求49的方法，其中該構建體含有蛋白質融合。
52.權利要求47的方法，端粒酶活性通過蛋白質相互作用降低，端粒酶活性的降低通過TRAPeze試驗測定。
53.權利要求47的方法，在文庫篩查之前，使所述cDNA或mRNA文庫與來自胚胎幹細胞的cDNA或mRNA文庫進行扣除雜交。
54.一種鑑定可提高EPC-1和/或端粒酶活性的蛋白質的方法，包括a.收集卵母細胞細胞質的級分，b.將其加入為衰老或接近衰老的細胞設計的無細胞系統中，和c.測定由於接觸特異卵母細胞細胞質級分引起的端粒酶和/或EPC-1活性改變。
55.一種通過權利要求40的方法鑑定的基因。
56.一種通過權利要求47的方法鑑定的基因。
57.一種通過權利要求54的方法鑑定的蛋白質。
58.一種篩選可抑制端粒酶和/或EPC-1活性的化合物的方法，包括使通過核移植技術用衰老或接近衰老的供體細胞產生的胚胎幹細胞接觸一種化合物，以確定該化合物是否抑制端粒酶和/或EPC-1活性。
59.一種通過權利要求58的方法鑑定的化合物。
60.一種含有權利要求55的基因，或其部分或轉錄產物的藥用組合物，目的在於提高需要提高活性的患者的端粒酶活性。
61.一種含有權利要求55的基因編碼的基因產物的藥用組合物，目的在於提高需要提高活性的患者的端粒酶活性。
62.一種含有權利要求56的基因，或其部分或轉錄產物的藥用組合物，目的在於抑制需要抑制活性的患者的端粒酶活性。
63.一種含有權利要求56的基因編碼的基因產物的藥用組合物，目的在於抑制需要抑制活性的患者的端粒酶活性。
64.一種含有權利要求58的蛋白質的藥用組合物，目的在於提高需要提高活性的患者的端粒酶活性。
65.一種編碼權利要求58的蛋白質的基因。
66.一種含有權利要求65的基因的藥用組合物，目的在於提高需要提高活性的患者的端粒酶活性。
67.一種含有權利要求59的化合物的藥用組合物，目的在於抑制需要降低活性的患者的端粒酶活性。
68.一種為了延長原代細胞的壽命激活內源端粒酶和/或EPC-1的方法。
69.一種具有復壯的增殖能力的細胞，它是通過使具有體細胞壽命的細胞或其DNA接觸生殖細胞或胚胎細胞或其分級分離的化合物產生的。
70.權利要求69的細胞，其中該細胞相對於年齡相當的同型同種體細胞具有提高的EPC-1活性和/或延長的端粒。
71.權利要求69的細胞，其選自人、牛、馬、犬、貓、豬、小鼠、大鼠、山羊、綿羊、豚鼠、熊、兔。
72.權利要求69的細胞，它是一種人類細胞。
73.含有根據權利要求60的細胞產生的延長端粒的DNA。
74.權利要求73的DNA，它來源於人體細胞。
75.一種產生具有復壯的增殖能力的細胞的方法，方法是使屬於體細胞系的細胞或其DNA接觸卵、卵母細胞、胚胎細胞或從中分級分離的組分。
76.權利要求75的方法，其中所述體細胞是衰老的、接近衰老的或關卡停滯的。
77.權利要求75的方法，其中所述體細胞是一種人類細胞。
78.權利要求77的方法，其中所述體細胞從患有衰老相關病症或與細胞更新增加有關的病症的人體中獲得。
79.權利要求78的方法，其中所述病症選自AIDS、肌營養不良、神經變性疾病、高血壓、免疫缺陷、骨關節炎和糖尿病。
80.通過核移植產生的克隆非人類胚胎、動物細胞或非人類動物，其中供體細胞或核是一種衰老細胞或關卡停滯的細胞。
81.一種改進的核移植方法，它可產生與年齡相當的對照相比端粒延長和/或EPC-1活性提高，和/或端粒酶活性提高，和/或增殖能力增強或壽命延長的非人類胚胎或動物或人類或非人類細胞，其中這種改進包括使用一種衰老、接近衰老、關卡停滯的供體細胞或DNA作為供體細胞或DNA。
82.一種鑑定可影響細胞老化或衰老的化合物的方法，包括(i)產生一種EPC-1基因或EPC-1調節序列轉染的細胞；和(ii)鑑定「開啟」該調節序列的化合物。
83.權利要求82的方法，其中所述EPC-1調節序列或基因與一種DNA有效連接，其表達是可檢測的。
84.一種真核細胞，它被與標記DNA有效連接的EPC-1基因或相關調節序列轉染。
85.一種真核細胞，它被與組成型或可調節強啟動子有效連接的EPC-1基因轉染。
86.權利要求85的細胞，其中所述EPC-1基因與CMV、PGK或其它非EPC-1調節序列有效連接。
全文摘要
本發明涉及復壯正常體細胞和生產與目的正常體細胞有相同基因型的不同類型正常體細胞的方法。這些細胞在細胞和組織移植中特別有用。也包括再克隆克隆動物的方法,特別是克隆動物的後代與其克隆親代相比遺傳改變(例如是「超年輕的」)的方法。這些動物應比其克隆親代更健康並具有希望的特性。也包括激活內源端粒酶、EPC－1活性和/或ATL途徑和/或延長正常體細胞壽命的方法,以及與細胞增殖能力老化有關的其它基因。
文檔編號A61P19/00GK1377424SQ00813712
公開日2002年10月30日 申請日期2000年9月6日 優先權日1999年9月7日
發明者M·維斯特, R·L·蘭扎, J·希柏利 申請人:先進細胞技術公司