用鋰皂石粘土納米顆粒負載阿黴素鹽酸鹽抗癌藥物的方法

2023-12-08 20:28:46 2

專利名稱：用鋰皂石粘土納米顆粒負載阿黴素鹽酸鹽抗癌藥物的方法
技術領域：
本發明屬於粘土納米顆粒負載藥物的製備領域，特別涉及一種用鋰皂石(Laponite, LAP)粘土納米顆粒負載阿黴素鹽酸鹽(Doxorubicine, D0X)抗癌藥物的方法。
背景技術：
在使用化學藥物治療腫瘤的過程中，抗癌藥物無法區別對待癌變組織細胞與健康細胞，導致了化學療法對機體損傷很大。首先，抗腫瘤藥物隨血液循環向全身組織細胞無差別或小差別的分布，會導致全身毒副作用，且大大限制了允許給藥的最大劑量。其次，藥物在不同組織細胞的廣泛分布則要求相對大的給藥量，這不僅僅會造成藥物的浪費，並且還會帶來毒副作用。此外，一些小分子的抗癌藥物，如阿黴素鹽酸鹽(Doxorubicine, D0X),由於其本身分子較小，其在高通透性的癌變組織中的快速消散也是亟待解決的問題。使用納米顆粒作為藥物載體負載抗腫瘤藥物，是納米技術與現代醫學的一次結合。粘土類納米顆·粒不僅具有良好的生物相容性，並且對藥物負載能力高，控制釋放能力好，被認為是作為調節給藥的非常有用的材料。在藥物的控制和/或靶向釋放，以及提高藥物在病變部位的聚集，均有著值得期待的前景。鋰皂石(Laponite，LAP)是一種含鎂、鋰、矽的層狀粘土礦物，其晶體結構為三八面體型，可以離子交換的方法將小分子藥物包裹在鋰皂石的層狀結構內，得到LAP/藥物納米粒子。查找相關的文獻和專利發現，以LAP作為載體負載抗癌藥物D0X，並進一步研究其抗癌活性的研究尚未見報導。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種用鋰皂石(Laponite，LAP)粘土納米顆粒負載阿黴素鹽酸鹽(Doxorubicine，D0X)抗癌藥物的方法，該方法條件溫和，工藝簡單，產品易於操作分離，所得到的LAP/D0X能夠有效控制DOX的釋放，LAP/D0X的抗癌活性較純DOX有了明顯的提高，應用前景廣闊。本發明的一種用鋰皂石粘土納米顆粒負載阿黴素鹽酸鹽抗癌藥物的方法，包括( I)配製鋰皂石的水溶液，並與阿黴素鹽酸鹽的水溶液混合，然後攪拌使LAP充分負載D0X，得到混合溶液；其中阿黴素鹽酸鹽的水溶液中阿黴素鹽酸鹽的濃度為2mg/mL，鋰皂石的水溶液中鋰皂石的濃度為2-8mg/mL ；(2)離心分離上述混合溶液，吸出上清液，並用超純水洗滌沉澱，最後即得到DOX/LAP沉澱物(負載有阿黴素鹽酸鹽的鋰皂石)。本發明中採用的LAP為商品化的LAP，DOX為商品化的DOX。步驟(I)中所述的鋰皂石的水溶液與阿黴素鹽酸鹽的水溶液的體積比為1:1。步驟(I)中所述的鋰阜石的水溶液中鋰阜石的濃度為2mg/mL、4mg/mL、6mg/mL或8mg/mL。
步驟(I)中所述的攪拌為磁力攪拌，攪拌的速率為100_150r/min，攪拌的時間為18-24h。步驟(2)中所述的離心的速率為8000-10000r/min,離心的時間為5-lOmin。步驟(2)中所述的洗滌中洗滌次數為2-3次。步驟(2)中得到的負載有阿黴素鹽酸鹽的鋰皂石中鋰皂石對阿黴素鹽酸鹽的最佳藥物負載效率為98. 3±0. 77%，此時步驟(I)中鋰皂石的水溶液中鋰皂石的濃度為3mg/mL。本發明中鋰皂石對阿黴素鹽酸鹽的最佳藥物負載效率的測定方法如下(I)用Lambda25紫外-可見分光光度計測量預先配製好的一系列濃度的DOX水溶液在480nm波長處的吸光值，繪製濃度_吸光度標準曲線；(2)配製一系列不同濃度LAP水溶液(2，4，6和8mg/mL)，並分別與2mg/mL的DOX水溶液混合，輔以磁力攪拌，使LAP充分負載DOX ;其中攪拌速率為100-150r/min，攪拌時間為 18-24h ；(3)離心、分離步驟(2)中的混合溶液，吸出上清液，並用超純水洗滌沉澱，將洗滌液與上清液混合；其中離心速率為8000-10000r/min，離心時間為5_10min，洗滌次數為2_3次；(4)利用Lambda25紫外-可見分光光度計測量步驟(3)中混合液在480nm處吸光值，根據標準曲線計算上清液中剩餘的DOX濃度，進而得出藥物的負載量，找到具有最佳藥物負載效率時LAP的濃度為3mg/mL，LAP對DOX的最佳藥物負載效率為98. 3±0. 77% ； (5)室溫下避光保存步驟(3)中的D0X/LAP沉澱物，備用。將上述步驟(5)後的載藥D0X/LAP納米顆粒和純DOX與貼壁的KB細胞置於5%C02，37° C條件下培養2h，利用流式細胞儀分析並比較KB細胞對D0X/LAP和純DOX的吞噬效果；並通過四唑鹽比色試驗(MTT)法對比D0X/LAP納米顆粒及純DOX對KB細胞的抑制作用，計算兩者對KB細胞抑制成活的IC5tl值。上述得到的結果為D0X/LAP納米顆粒及純DOX對KB細胞抑制成活的IC5tl值分別為 291 ±12. I 和 541 ±6. 6nM。本發明使用傅立葉變換紅外光譜(FITR)、X_射線衍射(XRD)等表徵手段驗證本發明方法的可行性。材料的抗腫瘤能力評價則通過體外釋放實驗、MTT實驗、相差顯微鏡觀察、細胞吞噬來表徵。具體測試結果如下(I)通過改變LAP的濃度，優化其對DOX的負載效率如表I所示，LAP對DOX的負載效率隨著LAP濃度的增加而增加；當LAP的濃度為3mg/mL時，LAP對DOX的負載達到最優值，為98. 3±0. 77%。表I.不同濃度LAP對DOX (終濃度為lmg/mL)負載效率的影響。
LAP (mg/mL)1234
負載效率(％)a72.4±0.89 95.9 士0.56 98.3±0.77 98.0±0.08a負載效率(%) =Mt/M0X 100%, Mt和M0分別表示被負載的DOX的質量和DOX的原始質量。(2)傅立葉變換紅外光譜(FTIR)測試結果
在附圖
I所示的DOX的FTIR圖譜中，3520CHT1處的O-H伸縮振動峰，3310cm-1處的N-H伸縮振動峰和29300^1處的C-H伸縮振動峰，1610cm-1處和ΙδδΟαιΓ1處的N-H彎曲振動峰，以及HlOcnT1處的C=O伸縮振動峰，均為DOX藥物分子的特徵吸收峰；而在LAP/D0X的FTIR圖譜中，1610CHT1和1580CHT1處也可以檢測到N-H彎曲振動峰，以及在HlOcnT1處的C=O伸縮振動峰，證明DOX分子已經成功的上載。(3) X-射線衍射(XRD)測試結果通過對衍射圖譜(附圖2、表2)的比較和分析，除了 001晶面以外，LAP的其他各晶面的位置以及晶面間距在負載藥物前後沒有明顯改變。而001晶面的晶面距離明顯增大(從14.95 A增加到17.67 Α)，這主要是因為DOX分子插入到了 LAP晶體的001晶面之間，形成了 LAP-DOX-LAP的夾層結構而使晶面間距增加所致。此外，LAP/D0X在20°到30°之間出現了一系列新的DOX晶體的衍射峰，也證明了 DOX已經成功負載到了 LAP的片層結構中。表2. LAP和LAP/D0X各晶面的位置以及晶面間距
權利要求
1.一種用鋰皂石粘土納米顆粒負載阿黴素鹽酸鹽抗癌藥物的方法，包括 (1)配製鋰皂石的水溶液，並與阿黴素鹽酸鹽的水溶液混合，然後攪拌得到混合溶液；其中阿黴素鹽酸鹽的水溶液中阿黴素鹽酸鹽的濃度為2mg/mL，鋰皂石的水溶液中鋰皂石的濃度為2-8mg/mL ； (2)離心分離上述混合溶液，吸出上清液，並用超純水洗滌沉澱，最後即得到負載有阿黴素鹽酸鹽的鋰皂石。
2.根據權利要求I所述的一種用鋰皂石粘土納米顆粒負載阿黴素鹽酸鹽抗癌藥物的方法，其特徵在於步驟(I)中所述的鋰皂石的水溶液與阿黴素鹽酸鹽的水溶液的體積比為 I: I。
3.根據權利要求I所述的一種用鋰皂石粘土納米顆粒負載阿黴素鹽酸鹽抗癌藥物的方法，其特徵在於步驟(I)中所述的鋰阜石的水溶液中鋰阜石的濃度為2mg/mL、4mg/mL、6mg/mL 或 8mg/mL。
4.根據權利要求I所述的一種用鋰皂石粘土納米顆粒負載阿黴素鹽酸鹽抗癌藥物的方法，其特徵在於步驟(I)中所述的攪拌為磁力攪拌，攪拌的速率為100-150r/min，攪拌的時間為18-24h。
5.根據權利要求I所述的一種用鋰皂石粘土納米顆粒負載阿黴素鹽酸鹽抗癌藥物的方法，其特徵在於步驟(2)中所述的離心的速率為8000-10000r/min，離心的時間為5_10mino
6.根據權利要求I所述的一種用鋰皂石粘土納米顆粒負載阿黴素鹽酸鹽抗癌藥物的方法，其特徵在於步驟(2)中所述的洗滌中洗滌次數為2-3次。
7.根據權利要求I所述的一種用鋰皂石粘土納米顆粒負載阿黴素鹽酸鹽抗癌藥物的方法，其特徵在於步驟(2)中得到的負載有阿黴素鹽酸鹽的鋰皂石中鋰皂石對阿黴素鹽酸鹽的藥物負載效率為98. 3±0. 77%，此時步驟(I)中鋰皂石的水溶液中鋰皂石的濃度為6mg/mL。
全文摘要
本發明涉及一種用鋰皂石粘土納米顆粒負載阿黴素鹽酸鹽抗癌藥物的方法，包括(1)配製鋰皂石的水溶液，並與阿黴素鹽酸鹽的水溶液混合，然後攪拌得到混合溶液；其中阿黴素鹽酸鹽的水溶液中阿黴素鹽酸鹽的濃度為2mg/mL，鋰皂石的水溶液中鋰皂石的濃度為2-8mg/mL；(2)離心分離上述混合溶液，吸出上清液，並用超純水洗滌沉澱，最後即得到負載有阿黴素鹽酸鹽的鋰皂石。本發明的條件溫和，工藝簡單，產品易於操作分離，本發明所得到的LAP/DOX能夠有效控制DOX的釋放，LAP/DOX的抗癌活性較純DOX有了明顯的提高，應用前景廣闊。
文檔編號G01N21/33GK102784397SQ201210277499
公開日2012年11月21日 申請日期2012年8月6日 優先權日2012年8月6日
發明者史向陽, 吳一倫, 王世革 申請人:東華大學