牛病毒性腹瀉病毒轉基因黃芪疫苗及生產方法
2023-12-09 03:49:01 1
專利名稱：牛病毒性腹瀉病毒轉基因黃芪疫苗及生產方法
技術領域：
本發明屬於獸藥技術或生物技術領域，具體涉及牛病毒性腹瀉病毒轉基因黃芪疫 苗產品及製備方法。
背景技術：
牛病毒性腹瀉病毒呈世界性分布，易感動物較多，如鹿、牛、豬、羊等，且它們間可 相互傳染。該病毒引起的疾病全年均可發生。牛病毒性腹瀉病毒可導致動物的病毒性腹瀉、 黏膜病、流產、死胎、弱胎、畸形胎、持續性感染、免疫耐受、血小板減少和出血性綜合症等多 種臨床症狀，還可導致非典型性豬瘟，給鹿業和奶牛業及養豬業造成極大的危害；尤其是在 人用的疫苗中發現了該病毒，這對人類是一個潛在的威脅。牛病毒性腹瀉病是全球性傳染 病，具有較高的感染率，流行的範圍在不斷擴大，陽性率在逐年增高。該病的發生和流行給 養殖業造成了重大的經濟損失。由於滅活苗，核酸疫苗，亞單位疫苗免疫原性差、保護力低， 而活毒疫苗不安全等原因，至今尚無很好的疫苗可供使用，亦無治療的特效藥，因此急需研 制有效的疫苗和治療的特效藥。
發明內容
本發明的目的是提供一種牛病毒性腹瀉病毒轉基因黃芪疫苗，用於動物牛病毒性 腹瀉病防治，克服現有的滅活苗，核酸疫苗免疫原性差、保護力低，活毒疫苗使用不安全的 缺點。本發明是將牛病毒性腹瀉病毒保護性抗原基因在可食性的抗病毒的藥用植物黃 芪宿主中表達得到的疫苗產品。本發明的牛病毒性腹瀉病毒轉基因黃芪疫苗是先以牛病毒性腹瀉病毒RNA為模 板用反轉錄_聚合酶鏈式反應法獲得Etl基因，再構建牛病毒性腹瀉病毒基因Etl重組植物表 達載體，然後採用花粉管通道法，將牛病毒性腹瀉病毒基因Etl重組植物表達載體溶液滴注 在處於半開放的黃芪花的柱頭上，待黃芪種子成熟時收穫種子，種植所收穫的種子得到再 生苗，對再生苗分別進行聚合酶鏈式反應鑑定和反轉錄-聚合酶鏈式反應法鑑定及蛋白質 電泳法鑑定，得到牛病毒性腹瀉病毒Etl基因轉化黃芪，再通過蛋白質印跡法和酶聯免疫吸 附法篩選具有免疫源性的牛病毒性腹瀉病毒基因Etl轉化的黃芪，所得到的疫苗產品。本發明藥用植物疫苗的表達宿主還可以選用人參、魚腥草、莪朮、防風、刺五加。本發明疫苗的製備方法包括以下步驟1、牛病毒性腹瀉病毒基因Etl基因的獲得以提取RNA常規方法提取的牛病毒性腹瀉病毒基因組RNA為模板，用反轉錄-聚 合酶鏈式反應法擴增Etl基因。擴增所用的引物序列如下上遊5『 -CCGGATCCACCATGGAAAA CATAACACAGTGG-3『；下遊5' -GCGAGCTCTTAAGCGTATGCTCCAAACCACGT-3『。反轉錄-聚合 酶鏈式反應產物經瓊脂糖凝膠電泳後，按維特潔DNA回收試劑盒說明書操作，回收目的基 因E0
2、牛病毒性腹瀉病毒基因Etl重組植物表達載體構建分別用DNA限制性內切酶雙酶切經凝膠純化的目的基因Etl及植物表達載體DNA， 用T4 DNA連接酶16°C條件下連接16h，取5μ 1連接產物轉化感受態大腸桿菌工程菌，挑取 轉化菌單菌落抽提質粒，經聚合酶鏈式反應鑑定和DNA限制性內切酶雙酶切鑑定及序列分 析篩選牛病毒性腹瀉病毒基因Etl重組植物表達載體轉化的重組工程菌，3、牛病毒性腹瀉病毒基因Etl花粉管通道法轉化黃芪大量培養重組工程菌，用鹼裂解法大量製備牛病毒性腹瀉病毒基因Etl重組植物表 達載體。選取花多、大而整齊的黃芪，用注射器將l-2ng/y 1牛病毒性腹瀉病毒基因Etl重 組植物表達載體溶液滴注於半開放的、顏色鮮豔的花的柱頭之上，去除已經開放、花色暗淡 的花朵以及還未開放的花朵，待種子成熟時收穫種子，室溫保存。對收穫種子種植製備再生 苗，對再生苗分別進行聚合酶鏈式反應鑑定和反轉錄-聚合酶鏈式反應法鑑定及蛋白質電 泳法鑑定，篩選出牛病毒性腹瀉病毒基因Etl轉化的黃芪。4、牛病毒性腹瀉病毒轉基因黃芪疫苗的篩選對牛病毒性腹瀉病毒轉基因黃芪，通過蛋白質印跡法和酶聯免疫吸附法篩選具有 免疫源性的牛病毒性腹瀉病毒基因Etl轉化的黃芪，得本發明疫苗產品，見表1。將牛病毒性 腹瀉病毒轉基因黃芪疫苗，移植大田進行擴繁，九月份收穫轉基因黃芪。表1酶聯免疫吸附法篩選牛病毒性腹瀉病毒轉基因黃芪疫苗
組別牛病毒性腹瀉病毒轉 基因黃芪牛病毒性腹瀉病 毒對照黃芪對照OD值0. 42±0. 0210. 43±0. 0240. 22±0. 018※不同字母間表示差異顯著(P 0. 05)。本發明是基於1、黃芪，為豆科多年生草本植物膜莢黃芪和蒙古黃芪的乾燥根。始載於《神農本草 經》，味甘性溫，入脾、肺二經，有補氣昇陽、固表止汗、託毒排膿、利水消腫和生肌等功效。含 有多種皂苷類、多糖、黃酮、胺基酸、微量元素等化學物質，具有抗病毒、抗腫瘤、調節免疫、 抗衰老、抗氧化、抗輻射和抗應激藥理作用。黃芪可提高體液免疫功能，慢性感染性疾病患 者注射黃芪20d後，血液中免疫球蛋白IgG、IgA及IgM的含量明顯升高，還可使肝炎患者的 總補體CH50和分補體C3明顯升高。黃芪可提高細胞免疫功能，黃芪多糖對T淋巴細胞體和 B淋巴細胞體外增殖均有有明顯的促進作用，黃芪多糖還有增強巨噬細胞的吞噬作用，提高 自然殺傷細胞NK的活性。本發明充分運用了黃芪抗病毒和免疫增強佐劑的特性。2、牛病毒性腹瀉病毒的結構蛋白Etl和E2均可誘導機體產生保護反應，但E2蛋白 保守性較低，抗原性變異較大，是導致病毒逃逸率高、疫苗保護率低和持續性感染的主要原 因，而Etl蛋白保守性較高，又具有抗原性，更適合研製基因工程苗。3、植物易於轉化並能提供廉價的蛋白質源，並且具有使用安全、生產簡單、可直接 口服等優點，因此植物疫苗在動物疾病防控方面將有極大的發展空間。花粉管通道法的優 點是不依賴組織培養而人工再生植株，操作簡單，單胚珠和多胚珠的單雙子葉植物均可應
4用，育種時間短，基因純合速度快，可直接獲得轉基因植株，導入的DNA分子整合效率較高， 可直接運用到常規育種。本發明的有益效果是將牛病毒性腹瀉病毒Etl基因在黃芪中表達，既產生保護性 抗原又產生增強免疫作用佐劑物質，提高了黃芪抗病毒的作用和疫苗的免疫效果。本發明 為疫苗和藥用植物聯合應用，為研製新型基因疫苗打下堅實的理論基礎和提供新的研究思 路。與牛病毒性腹瀉病毒活毒疫苗、滅活疫苗和亞單位疫苗相比，本發明的牛病毒性腹瀉病 毒轉基因黃芪疫苗還具有容易生產、使用方便、穩定性強、安全，沒有負作用的優點。本發明 對更有效地控制牛病毒性腹瀉病的傳播和流行，繁榮畜牧業具有重要的理論意義和應用價 值。本發明的疫苗的用法和用量1、預防用法與用量使用對象為鹿、牛、豬，飼餵時添加牛病毒性腹瀉病毒轉基因黃芪疫苗(鹿20克/ 日.只，牛30克/日.只，豬10克/日.只)，連餵3天，隔10天後再同法飼餵3天。2、治療用法與用量使用對象為鹿、牛、豬，飼餵時添加牛病毒性腹瀉病毒轉基因黃芪疫苗(鹿40克/ 日.只，牛60克/日.只，豬20克/日.只)，連餵3天。
圖1牛病毒性腹瀉病毒Etl基因反轉錄_聚合酶鏈式反應電泳圖。圖2牛病毒性腹瀉病毒基因Etl重組植物表達載體聚合酶鏈式反應電泳圖。圖3牛病毒性腹瀉病毒基因Etl重組植物表達載體的酶切鑑定電泳圖。圖4牛病毒性腹瀉病毒轉基因黃芪聚合酶鏈式反應鑑定電泳5牛病毒性腹瀉病毒轉基因黃芪的反轉錄_聚合酶鏈式反應鑑定電泳6牛病毒性腹瀉病毒轉基因黃芪蛋白質電泳檢測圖7牛病毒性腹瀉病毒轉基因黃芪蛋白質印跡法檢測1、本發明動物實驗例實驗例1，牛病毒性腹瀉病毒轉基因黃芪疫苗對鹿的免疫作用1、牛病毒性腹瀉病毒轉基因黃芪疫苗對鹿的免疫選24頭1月齡健康仔鹿隨機分成三組，每組8隻，第1組為牛病毒性腹瀉病毒轉 基因黃芪疫苗免疫組，飼餵時添加牛病毒性腹瀉病毒轉基因黃芪疫苗20克/日.只。第2 組為黃芪黃芪對照組，飼餵時添加黃芪20克/日.只。第3組為玉米秸粉對照組，飼餵時 添加20克/日.只。連餵3天，隔10天後加強免疫一次，分別再飼餵3天。於初次免疫前 當日和末次飼餵後第4周經頸靜脈取血，分離血清和淋巴細胞。酶聯免疫吸附法檢測鹿的 特異性體液免疫應答，淋巴細胞轉化實驗檢測細胞免疫水平。2、牛病毒性腹瀉病毒轉基因黃芪疫苗對鹿的體液特異性免疫應答將純化牛病毒性腹瀉病毒可溶性全病毒抗原，用pH8. 0包被液稀釋，每孔加入 ΙΟΟμΙ，包被酶標板4°C過夜。棄去液體，用緩衝液3X3洗滌。用含10%馬血清37°C封閉 2h。緩衝液洗滌同上。加入200倍稀釋的待檢鹿血清100μ 1，37°C感作lh。緩衝液洗滌同 上。加入5000倍稀釋的兔抗鹿酶標二抗感作lh。緩衝液洗滌同上，加入底物37°C顯色反應15min。每孔加50μ1 2Μ H2SO4，終止反應，測定OD49tl值。結果用光密度(OD)的比率來 表示，即一個實驗樣品的OD49tl和0天樣品OD49tl間的比率。OD比值> 2時顯示為陽性。OD 比值在1. 5-1. 9之間的樣品被記為弱陽性。OD比值< 1. 5時為陰性。實驗結果表明，初次 飼餵前當日，各組均為牛病毒性腹瀉病毒抗體陰性。牛病毒性腹瀉病毒轉基因黃芪疫苗組 在末次免疫4周後產生顯著的IgG應答，而飼餵黃芪組和對照組沒有檢察到牛病毒性腹瀉 病毒抗體效價。見表2。表2牛病毒性腹瀉病毒轉基因黃芪疫苗誘導鹿體液特異性免疫(0D值)
權利要求
牛病毒性腹瀉病毒轉基因黃芪疫苗，其特徵是將牛病毒性腹瀉病毒保護性抗原基因在可食性的抗病毒的藥用植物黃芪宿主中表達得到的疫苗產品。
2.根據權利要求1所述的牛病毒性腹瀉病毒轉基因黃芪疫苗，其特徵是先以牛病毒 性腹瀉病毒RNA為模板用反轉錄_聚合酶鏈式反應法獲得Etl基因，再構建牛病毒性腹瀉病 毒基因Etl重組植物表達載體，然後採用花粉管通道法，將牛病毒性腹瀉病毒基因Etl重組植 物表達載體溶液滴注在處於半開放的黃芪花的柱頭上，待黃芪種子成熟時收穫種子，種植 所收穫的種子得到再生苗，對再生苗分別進行聚合酶鏈式反應鑑定和反轉錄_聚合酶鏈式 反應法鑑定及蛋白質電泳法鑑定，得到牛病毒性腹瀉病毒Etl基因轉化黃芪，再通過蛋白質 印跡法和酶聯免疫吸附法篩選具有免疫源性的牛病毒性腹瀉病毒基因Etl轉化的黃芪，所得 到的的疫苗產品。
3.牛病毒性腹瀉病毒轉基因黃芪疫苗的生產方法，其特徵是包括以下步驟(1)牛病毒性腹瀉病毒基因Etl基因的獲得以提取RNA常規方法提取的牛病毒性腹瀉病毒基因組RNA為模板，用反轉錄_聚合酶 鏈式反應法擴增Etl基因，擴增所用的引物序列如下上遊5 『 -CCGGATCCACCATGGAAAACATA ACACAGTGG-3 『；下遊5 『 -GCGAGCTCTTAAGCGTATGCTCCAAACCACGT-3 『，反轉錄-聚合酶鏈 式反應產物經瓊脂糖凝膠電泳後，按維特潔DNA回收試劑盒說明書操作，回收得到Etl基因；(2)牛病毒性腹瀉病毒基因Etl重組植物表達載體構建將步驟⑴得到的目的基因分別用DNA限制性內切酶雙酶切經凝膠純化的目的基因產 物及植物表達載體DNA，用T4 DNA連接酶在16°C條件下連接16h，取適量連接產物轉化感 受態大腸桿菌工程菌，挑取轉化菌單菌落抽提質粒，經聚合酶鏈式反應鑑定和DNA限制性 內切酶雙酶切鑑定後，進行牛病毒性腹瀉病毒基因Etl重組植物表達載體序列分析，篩選得 到含牛病毒性腹瀉病毒基因Etl重組植物表達載體轉化的工程菌，大量培養重組菌株，用鹼 裂解法大量製備牛病毒性腹瀉病毒基因Etl重組植物表達載體，用緩衝液將其稀釋成濃度為 l-2ng/yl的牛病毒性腹瀉病毒基因Etl重組植物表達載體；(3)牛病毒性腹瀉病毒基因Etl花粉管通道法轉化黃芪大量培養重組工程菌，用鹼裂解法大量製備牛病毒性腹瀉病毒基因Etl重組植物表達 載體，7月中旬期間，選取花多、大而整齊的兩年生膜莢黃芪，用注射器將步驟(2)得到的 l-2ng/y 1的牛病毒性腹瀉病毒基因Etl重組植物表達載體溶液滴注於半開放的、顏色鮮豔 的花的柱頭之上，去除已經開放、花色暗淡的花朵以及還未開放的花朵，待種子成熟時收穫 種子，室溫保存，對收穫種子種植得再生苗，對再生苗分別進行聚合酶鏈式反應鑑定和反轉 錄-聚合酶鏈式反應法鑑定及蛋白質電泳法鑑定，篩選出牛病毒性腹瀉病毒轉基因黃芪；(4)牛病毒性腹瀉病毒轉基因黃芪疫苗的篩選對牛病毒性腹瀉病毒轉基因藥用植物，通過蛋白質印跡法和酶聯免疫吸附法篩選具有 免疫源性的牛病毒性腹瀉病毒基因Etl轉化的黃芪，得本發明疫苗產品。
全文摘要
牛病毒性腹瀉病毒轉基因黃芪疫苗及生產方法，用於動物牛病毒性腹瀉病防治，克服現有的滅活苗，核酸疫苗免疫原性差、保護力低，活毒疫苗使用不安全的缺點。本發明是以牛病毒性腹瀉病毒RNA為模板，用反轉錄-聚合酶鏈式反應法獲得其E0基因，再構建其基因E0重組植物表達載體，然後採用花粉管通道法，得到牛病毒性腹瀉病毒E0基因轉化黃芪。通過蛋白質印跡法和酶聯免疫吸附法篩選具有免疫源性的牛病毒性腹瀉病毒基因E0轉化的黃芪，得疫苗產品。本發明的有益效果是將牛病毒性腹瀉病毒E0基因在黃芪中表達，既產生保護性抗原又產生增強免疫作用的佐劑物質，提高了黃芪抗病毒的作用和疫苗的免疫效果。還有易生產、使用方便、穩定性強、無負作用的優點。
文檔編號C12N15/83GK101934073SQ201010120759
公開日2011年1月5日 申請日期2010年3月6日 優先權日2010年3月6日
發明者於文影, 劉佳佳, 張連學, 李然, 李璠瑛, 杜銳, 王亞興, 王全凱, 王南, 臧埔, 郜玉鋼 申請人:吉林農業大學