改變棉花纖維數量和性狀的基因及其編碼蛋白與應用的製作方法
2023-12-09 11:20:01 1
專利名稱：改變棉花纖維數量和性狀的基因及其編碼蛋白與應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物工程領域中能夠改變棉花纖維數量和性狀的基因及其編碼蛋白與應用。
背景技術：
棉花是重要的經濟作物。棉花纖維是由胚珠外珠被上的表皮細胞發育而成的一種單細胞結構的表皮毛。電鏡觀察獲知，胚珠表皮細胞中有大約1/3可以發育為棉纖維(Sre wart 1975)，並且這個比例在不同棉花種類之間略有不同。研究表明，胚珠外珠被表皮細胞發育為棉纖維的啟始與生長激素和赤黴素等激素有關(Kosmidou-Dimitropou lou 1986)。
Aux/IAA在植物界廣泛存在，它們是一類對生長激素產生應答的蛋白。在擬南芥基因組中至少包含了24個Aux/IAA基因，這些基因幾乎都是生長素處理後快速誘導表達的。Aux/IAA基因編碼一類核蛋白，能被快速降解，分子量在20-35KD之間，包含I-IV 4個保守區，其中，保守區III和IV能形成同源二聚體。ARF是另一類生長素反應因子，這類蛋白家族也包含保守區III和IV，可以與Aux/IAA形成異源二聚體。ARF蛋白是一類轉錄因子，可以與受生長素誘導基因上遊的生長素反應元件(AuxRE)結合。保守區II是一個蛋白降解的信號，而且對蛋白的穩定性有影響，該保守區突變後，蛋白穩定性升高。這表明Aux/IAA蛋白的快速關閉對正常的生長素反應有重要影響。
除了擬南芥，在其它種類植物中也發現了該家族的成員。比如豌豆中的PS-IAA4/5，PS-IAA6；大豆中的Aux22和Aux28；蠶豆中的ARG3和ARG4。
Gray等人發現影響SCF複合體的突變或抑制因子能夠增加AUX/IAA蛋白的穩定性。而且他們證明SCF與AUX/IAA之間確實存在直接的相互作用，這些相互作用是由AUX/IAA的保守區II介導的。這些結果表明生長素啟始了SCF依賴的AUX/IAA蛋白的降解。
已被證實的模型是基礎水平的AUX/IAA蛋白抑制生長素反應通路，而生長素促使AUX/IAA蛋白與SCF或SCF複合體結合，隨後降解。在這裡，生長素通過誘導AUX/IAA基因的表達形成了一個精確調節的反饋環。生長素誘導AUX/IAA的解體，促使ARF-ARF形成，導致受生長素調節基因的高水平轉錄。
發明內容
本發明的目的是提供一種能夠改變棉花纖維數量和性狀的基因及其編碼的蛋白質。
本發明所提供的改變棉花纖維數量和性狀的基因名稱為GhIAA16，是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)與序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA序列。
序列表中序列1的DNA由1020個鹼基組成，該基因的讀碼框為自5』端第100到第773位鹼基。
擴增GhIAA16中任一片段的引物對也在本發明的保護範圍之內，其中，上遊引物和下遊引物之間的距離在50到1000個鹼基之間；該引物對中的每一個引物的長度為15到30個鹼基。
由基因GhIAA16編碼的改變棉花纖維數量和性狀的轉錄因子GhIAA16，是具有序列表中序列2胺基酸殘基序列的蛋白質，或者是將序列2的胺基酸殘基序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列2的胺基酸殘基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白質。
序列表中序列2胺基酸殘基序列是由208個胺基酸殘基組成的蛋白質，如圖1所示，與AtIAA16序列比較，同源性為59.4％，其中用著重號標出的是NLS區。
利用任何一種可以引導外源基因在植物中表達的載體，將本發明所提供的GhIAA16基因導入植物細胞，可獲得纖維數量和性狀得到改變的轉基因細胞系及轉基因植株。本發明的基因在構建到植物表達載體中時，在其轉錄起始核苷酸前可加上任何一種增強啟動子或誘導型啟動子。為了便於對轉基因植物細胞或植物進行鑑定及篩選，可對所使用的載體進行加工，如加入植物可選擇性標記或具有抗性的抗生素標記物。攜帶有本發明GhIAA16基因的表達載體可通過使用Ti質粒、Ri質粒、植物病毒載體、直接DNA轉化、微注射、電導等常規生物技術方法導入植物細胞，被轉化的植物宿主既可以是單子葉植物，也可以是雙子葉植物。本發明的基因對培育纖維植物新品種，特別是培育棉花新品種具有重要意義。當本發明的基因被用於改變棉花纖維數量、質量性狀時，可採用以下方法1、將本發明基因的反義GhIAA16基因克隆到植物轉化載體中；2、將所構建的植物轉化載體轉化可再生棉花組織(或器官)並使本發明的基因在轉化的組織中表達；3、將被轉化的組織(或器官)培養成植株。
下面結合具體實施例對本發明作進一步說明。
圖1為GhIAA16與AtIAA16胺基酸殘基序列比較。
圖2為GhIAA16基因的Southern分析結果。
圖3為GhIAA16基因的northern雜交結果。
圖4為GhIAA16基因的原位雜交結果。
具體實施例方式
實施例中所用的植物材料在棉花花期，掛牌觀察開花時間，採集花苞、花蕾、花和幼鈴於冰浴中帶回到實驗室中，用滅菌的器具迅速分別採集花前約5天的子房、花前3天的胚珠、花期胚珠和花後1-3天的胚珠於液氮中速凍，-80℃保存備用。同時，做原位雜交的材料用FAA固定，做掃描電鏡的材料用戊二醛固定。
實施例1棉花胚珠cDNA文庫的構建1、總RNA的提取和cDNA的製備用Qiagen Plant RNeasy Kit提取花期胚珠的總RNA，經電泳檢測RNA的完整性和相對濃度，並用島津紫外分光光度計測定RNA樣品的濃度後，取等量的1μg總RNA逆轉錄成cDNA第一條鏈(sscDNA)。
具體方法如下在0.2ml PCR管中加入下列試劑1μg RNA，1μl SMART III引物(10μM)，1μl CDSIII PCR引物(10μM)，加水至總體積5μl。將樣品混合後在微量離心機上短暫離心。樣品在72℃變性2分鐘，冰上冷卻2分鐘。向離心管中加入下列樣品2.0μl 5×1st strand Buffer，1.0μl DTT(20mM)，1.0μl dNTPs mix(10mMeach)，1.0μl SuperScript II RNase H-Reverse Transcriptase(200units/μl)。用槍頭輕輕地混勻樣品並短暫離心。在PE 9600 PCR儀上於42℃保溫1小時，將管置於冰上。
cDNA第二條鏈(dscDNA)的合成在0.2ml PCR管中加入2μl 1st-strand cDNA，80μl SDW，10μl 10×cDNA PCR buffer，2μl dNTPs mix，2μl 5』PCR引物，2μl CDS III/3』PCR引物，2μl 50×Advantage cDNA Polymerase Mix。輕彈管底混合樣品。在PE 9600 PCR儀上按下列程序擴增95℃1min；(95℃5sec；65℃5sec；68℃6min)×18個循環。取5μl PCR產物在1.1％凝膠上電泳，cDNA大小分布在500bp-4kb之間。
2、cDNA文庫的構建取50μl dscDNA加1μl proteinase K，45℃溫育20分鐘，酚/氯仿抽提後，乙醇沉澱，重溶於79μl水中。加入10μl Sfi I(20 units/ul)，10μl 10×Sfi Ibuffer，1μl 100×BSA，混勻後，50℃消化2小時。加2μl二甲苯青染料混勻，用CHROMA SPIN-400柱對cDNA酶切產物分級分離。收集各部分電泳產物，檢查cDNA大小分布。收集大於0.5kb的部分約100μl，乙醇過夜沉澱，乾燥，重新懸浮於7μl SDW中。cDNA與λTriplEx2載體連接。用Packagene Lambda DNA Packaging System(Promega，USA)包裝連接產物，加氯仿和DMSO後分裝成每管5μl，保存於-70℃。
3、滴度測定和插入片段大小鑑定按產品說明書的方法進行，宿主菌為E.coli XL1-Blue菌株。用5』和3』測序引物對噬菌斑進行PCR擴增，鑑定插入片段的大小。
經過鑑定的陽性克隆按說明書的方法轉化成pTriplEx2質粒克隆。提取質粒克隆並測序。測序引物為5』和3』測序引物及基因特異引物。
實施例2cDNA微陣列(filter array)的製作和雜交1、將噬菌體文庫轉化為質粒文庫按產品說明書的方法進行，宿主菌為BM25.8。挑選了23808(62×384)個cDNA克隆，收集在248塊96孔板中。
2、菌落點於高密度膜上，用於雜交分析用BIOMECK 2000機器人(Beckman)點膜。點膜前，用96針replica(VPScientific，USA)將248塊96孔板中的BAC文庫複製一份到62塊384孔板中(Costar，USA)，96孔板原种放-70℃凍存，62塊384孔板用於點膜。點膜採用3×3點陣排列形式，每個克隆有三個重複。將膜放入LB(CAM 12.5mg/ml)固體培養基平板中，點有菌落一面朝上，37℃過夜培養，待菌落長到直徑約為1-2mm時，進行膜的處理。
膜處理流程如下在平底託盤內平鋪2張濾紙，分別用以下溶液浸溼。Hybond N+膜放置其上的順序和時間分別為①10％SDS，4min；②變性液(0.5N NaOH，1.5m NaCl)5min；③中和液(0.5M Tris-HCl pH7.5，1.5MNaCl，1mMEDTA)5min；④中和液5min；⑤2×SSC，0.1％SDS，5min；⑥2×SSC，5min；在紙巾上晾乾後，在0.4NNaOH上靜置20min；2L的5×SSC，0.2％SDS洗30min；2L的2×SSC洗30min。晾置濾紙上，室內乾燥，保鮮膜包裹直接用於雜交反應或4℃保存。
3、探針的製備分別提取徐州142和無絮棉花品種的花前3天、開花當天和花後3天的總RNA，取等量反轉為cDNA第一條鏈(方法同實施例1)，再用Promega公司的Primer-a-Gene試劑盒進行標記過夜。雜交前用Qiagen公司的PCR Purification試劑盒進行探針純化。
4、雜交、洗膜、曝光預雜交、雜交均按常規方法進行(金冬燕等，1996；Hybond N+ mannual，Amersham)。洗膜用高嚴緊方法進行(Hybond N+mannual，Amersham)2×SSC，0.1％SDS，15min；1×SSC，0.1％SDS，65℃，15min；2×SSC，0.1％SDS，65℃，15min。保鮮膜包裹雜交膜，-70℃下對X光片曝光。
實施例3GhIAA16的Southern分析棉花基因組DNA的提取按Paterson et al(1993)的方法進行。取20μg基因組DNA，分別用BamHI、EcoRI和HindIII(Takara產品)酶切。酶切產物經0.7％瓊脂糖凝膠電泳(30-50V，O/N)分離，然後用常規方法在搖床上處理電泳膠經0.125NHCl浸洗15min，變性液(1.5M NaCl，0.5N NaOH)浸洗30min，中和液(1.5M NaCl，0.5M Tris-HCl pH7.2)浸洗30min。最後用20×SSC將DNA印跡到HybondN+尼龍膜上。
預雜交、雜交均按常規方法進行(金冬燕等，1996；Hybond N+mannual，Amersham)。
探針標記用Promega公司的Primer-a-Gene試劑盒進行，標記過夜。雜交前用Qiagen公司的PCR Purification試劑盒進行探針純化。
洗膜用高嚴緊方法進行(Hybond N+mannual，Amersham)2×SSC，0.1％SDS，15min；1×SSC，0.1％SDS，65℃，15min；2×SSC，0.1％SDS，65℃，15min。
保鮮膜包裹雜交膜，-70℃下對X光片曝光。
結果如圖2所示，表明GhIAA16是一個單拷貝基因。
實施例4GhIAA16的表達分析1、Northern雜交按照實施例1的方法分別提取棉花-5DPA子房(花前5天，DPA代表Days PostAnthesis)，-3DPA(花前3天)胚珠，0DPA(花期)胚珠和3DPA(花後3天)胚珠中的總RNA。經1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢查RNA的完整性後，用紫外分光光度計和電泳方法相結合作精確定量。調整各樣品上樣量均為15μg，然後進行1.2％甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳。
甲醛變性膠的製作1.2％FA凝膠150ml是由1.5g瓊脂糖加15ml 10×FA凝膠緩衝液配置，在微波爐中熔化後，65℃水浴中冷卻，再加2.7ml 37％的甲醛原液製成的。電泳前須在1×FA緩衝液中平衡至少30min。1×FA緩衝液600ml的配方為50ml 10×FA緩衝液、10ml 37％甲醛原液和440ml DEPC處理的SDW。上樣時，每4份RNA樣品加1份5×RNA上樣緩衝液，混勻後65℃水浴中加熱3-5min，冰浴冷卻。5×RNA上樣緩衝液10ml中內含16μl飽和溴酚藍溶液、80μl 500mM EDTA，pH8.0、720μl 37％甲醛原液、2ml甘油、3084μl甲醯胺和4ml 10×FA緩衝液。
電泳結束後，切下分子標記泳道用EB染色，旁邊放一螢光尺精確指示位置。樣品部分的膠在DEPC處理的SDW搖床上浸洗30min，再用DEPC處理的10×SSC浸洗30min。然後將RNA用DEPC處理的20×SSC轉至Hybond N+膜上，膜經預雜交，放射性探針雜交，經高嚴緊性洗膜後，於-70℃下對X光片曝光。
結果如圖3所示，圖中-5d，開花前5天的胚珠；-3d，開花前3天的胚珠；0d，開花當天的胚珠；3d，花後3天的胚珠。每條泳道上樣量約15μg total RNA。從圖中可以看出，GhIAA16在花前3天的胚珠中表達量最高，該時期正是棉纖維的啟始期。之後，該基因的表達在突變體中逐漸減少，而在野生型中維持恆定的表達水平，這一結果暗示GhIAA16在棉纖維的啟始中可能發揮作用。
2、組織原位雜交1)包埋材料固定取花前5天的子房、花前3天和花期、花後1-2天的胚珠，放入有固定液FAA(50％乙醇，10％甲醛，5％冰乙酸)的小瓶中，真空抽氣3小時，使固定液完全滲入到材料中，換固定液，室溫放置過夜。
脫水材料經下列乙醇梯度系列脫水30％乙醇30min，50％乙醇30min，70％乙醇30min，85％乙醇30min，90％乙醇30min，100％乙醇1小時，100％乙醇1小時，100％乙醇1小時。
透明材料經過下列二甲苯梯度透明25％二甲苯+75％乙醇1小時，50％二甲苯+50％乙醇1小時，75％二甲苯+25％乙醇1小時，二甲苯1小時，二甲苯1小時，二甲苯1小時，室溫放置過夜。
包埋將58-60℃融化的石蠟(Sigma)緩慢倒入浸有材料的二甲苯溶液中，石蠟和二甲苯的比例為1∶1，室溫放置過夜，42℃放置1天，58-60℃放置2天，期間換3-4次石蠟，最後將材料和石蠟一起倒入小濾紙盒中，冷水中速凝，完全凝固後放4℃保存。
2)切片和展片切片將蠟塊修成小梯形塊，用Leica全自動切片機將材料切成連續的蠟帶，切片厚度為6μm。
展片用毛筆和解剖針將蠟帶按切割順序放到蠟光紙上，選取不同位置的蠟片，在光學顯微鏡下做鏡檢，確定含有合適材料的蠟帶。然後，輕輕地將蠟帶正面向上放在滴有RNase-free Water的載玻片上。接著將載玻片放在45℃燙板上展片5min。待蠟帶透明後，小心將玻片傾斜，用滅菌濾紙條將多餘的水分吸乾淨。42℃展片24-48小時。
3)切片脫蠟和脫水脫蠟展片後的材料進行脫蠟處理二甲苯20min，二甲苯20min，50％二甲苯+50％乙醇20min，100％乙醇5min，100％乙醇5min，90％乙醇5min，70％乙醇5min，50％乙醇5min，30％乙醇5min，DEPC處理水5min，DEPC處理水5min，DEPC處理水5min。
蛋白酶K消化37℃預熱蛋白酶K Buffer(0.1M Tris-HCl pH7.5，0.05M EDTA)後加入蛋白酶K至終濃度1-5μg/ml，37℃處理切片30min後，RNase-free Water洗3次。
脫水2×SSC，5min；2×SSC，5min；30％乙醇5min，50％乙醇3min，70％乙醇3min，90％乙醇3min，100％乙醇3min，100％乙醇3min。室溫下乾燥後，片子可直接用於雜交或保存於-20℃。
4)探針的製備用GhIAA16的引物Ary11-55』CTG CTT TCT CGT ATA GCA GCC TGAry11-85』GTG CTT GAA TAT TTG GGA GCC擴增出一段675bp的PCR產物。PCR產物純化後克隆到pBlueScriptII KS載體中，挑選陽性質粒。用UP、RP、Ary11-5和Ary11-8的引物組合鑑定插入方向。質粒提取後，分別用HindIII和EcoRI酶切，酶切產物用酚氯仿抽提一次，氯仿抽提兩次，乙醇沉澱後，沉澱溶解於RNase free SDW中，一般濃度為300-400ng/μl。取1-2μg量進行探針標記。按DIG RNA Labeling Kit上敘述的方法進行。最後，轉錄後的探針溶於50μl RNase free SDW中。半定量檢測探針標記效率和濃度。一般濃度為100-400ng/μl。
5)雜交每張片子大約用100-150μl雜交液，雜交液由A和B組成。比例為200μl雜交液由154.4μl雜交液A加45.6μl雜交液B組成。
雜交液A(7.72ml)5000μl甲醛，1000μl 50％葡聚糖，1000μl 10×blockingreagent，600μl 5M NaCl，100μl 1M Tris-HCl pH7.5，20μl 500mM EDTA pH7.5。雜交液B(現用現配，45.6μl)5μlpoly A(20μg/μl)；3μl tRNA(10mg/ml)；37.6μl探針和RNase free SDW。
雜交液B在80℃加熱5分鐘變性探針，立即置於冰上。雜交液A和B混合後，探針終濃度為100-400ng/ml。在大培養皿中放入0.3MNaCl-50％甲醯胺溶液形成溼室，將需要雜交的片子放在溼室中42℃雜交過夜。
6)洗片洗片室溫下4×SSC，5min三次。
RNase處理37℃RNase buffer(500mM NaCl，1mM EDTA，10mM Tris-HClpH7.5)加RNase A至終濃度25μg/ml，放入切片37℃保溫30min。RNase buffer 37℃洗三次，每次15分鐘。在800ml 2×SSC溶液中輕微攪拌洗片，室溫30分鐘，重複一次。
7)顯色1×PBT(1％Tween20，8mM Na2HPO4，2mM NaH2PO4，0.13M NaCl，3mM KCl pH7.5)中洗5分鐘。0.5％Blocking reagent(用1×PBT配製)中洗60分鐘。1×PBT中洗5分鐘。加入2.75u/ml anti-Dig-AP，室溫放置60分鐘(2.75u/ml抗體溶液300μl 1×PBT，30μl 10mg/ml BSA，1μl anti-Dig-AP)。1×PBT中洗兩次，每次20分鐘。1×TNM50中洗5分鐘(TNM50 buffer100mM Tris-HCl pH9.5，100mM NaCl，50mMMgCl2)。顯色黑暗中顯色30分鐘-12小時(顯色buffer600μl TNM50，12μlNBT/BCIP貯液)。脫水，封片，鏡檢並拍照。
結果如圖4所示，A為Antisense GhIAA16 RNA探針雜交結果；B為sense GhIAA16RNA探針雜交結果(A、B均為開花當天徐州142胚珠縱切)。結果表明GhIAA16基因可能在胚珠的珠心部位高表達。
實施例5轉化在基因的5』和3』端分別設計含SacI和XbaI酶切位點的引物，以GhIAA16基因的cDNA為模板，進行PCR擴增。引物為GhIAA16正義AryXba5』ATA TCT AGA GAG GAA ATT AGA AAA TGT CAArySac3』ATA GAG CTC TTA ATT TGT GCT TGA ATA TTT GGGhIAA16反義AryXba3』TAT TCT AGA GCC TCT GTA CAA TTC TTT ATGArySac5』ATA GAG CTC GAG GAA ATT AGA AAA TGT將擴增產物用Wizard PCR Preps DNA Purification System(Promega)純化後，用SacI和XbaI雙酶切，酚/氯仿抽提後，乙醇沉澱，溶於少量SDW中。提取pBI121質粒，也用SacI和XbaI雙酶切，跑電泳後割膠純化分子量大的載體帶(Wizard PCRPreps DNA Purification System)。用T4連接酶做連接反應分別連接正反義基因片段與載體，熱激轉化大腸桿菌DH5α。在大腸桿菌內鑑定連接正確後再將構建的質粒轉入農桿菌GV3101中。用真空滲透法轉化擬南芥。得到轉基因植株。
序列表160221012111020212DNA213棉屬陸地棉種(Gossypium hirsutum)220
223
4001ggtgttggtc caataattta gtgcaaaaac catcttcttt tttctgcttt ctcgtatagc 60agcctgtttt gagaaacttt tttttgagga aattagaaaa tgtcatcgga gaacgggaaa120aggttgctgg aaactgatgc cggcggcttg aattttgagg ctaccgagct gactttaggg180ttacctggag agcctagagt aacatcggac ggtggagcta agttgggcag taaacgtgga240ttttcggaaa ccgttgatct taagttgggt gacaacaatc aagaggttaa gctgggtcac300tccctccaag aagctgccaa gtctcccgtt tcaaagacac aagtggtggg ttggccgccg360gtgagaggct ttgcaaagag aggaaagaag agttgcaaat atgtaaaagt ggcggtggac420ggtgctccat atttaaggaa agttgatctc gagatataca atagttatca gcagctgtta480acctcccttg aagacatgtt ttcatgtttc accataagaa actatttgaa cgagaagaaa540atagaccaag tgaatggaat tgagtatatg cctacatatg aagataagga cggagattgg600atgttggtgg gagatgttcc atggcaaatg ttcgttgaat cttgcaaacg cttaaggtta660atgaaaagtt cagaggcagt aggattaggt ctaaagacgg ctcccaaata ttcaagcaca720aattaaagaa aaagaagcct ttttaattca agcatccaag aaagaaatca taaagaattg780tacagaggct ttttgctttg tttgaactat ttttacctga cgggcagggt ttttgactaa840gatatagact gccaaattgc aagaaacata aaataaataa gctgtaattg tagtgcattg900atgttgtggg cttttttctc cacattactt aaagttaatc atctcttctt cctttttcaa960aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 10202102211208212PRT213棉屬陸地棉種(Gossypium hirsutum)4002
Met Ser Ser Glu Asn Gly Lys Arg Leu Leu Glu Thr Asp Ala-Gly15 10 15Gly Leu Asn Phe Glu Ala Thr Glu Leu Thr Leu Gly Leu Pro Gly20 25 30Glu Pro Arg Val Thr Ser Asp Gly Gly Ala Lys Leu Gly Ser Lys35 40 45Arg Gly Phe Ser Glu Thr Val Asp Leu Lys Leu Gly Asp Asn Asn50 55 60Gln Glu Val Lys Leu Gly His Ser Leu Gln Glu Ala Ala Lys Ser65 70 75Pro Val Ser Lys Thr Gln Val Val Gly Trp Pro Pro Val Arg Gly80 85 90Phe Ala Lys Arg Gly Lys Lys Ser Cys Lys Tyr Val Lys Val Ala95 100 105Val Asp Gly Ala Pro Tyr Leu Arg Lys Val Asp Leu Glu Ile Tyr110 115 120Asn Ser Tyr Gln Gln Leu Leu Thr Ser Leu Glu Asp Met Phe Ser125 130 135Cys Phe Thr Ile Arg Asn Tyr Leu Asn Glu Lys Lys Ile Asp Gln140 145 150Val Asn Gly Ile Glu Tyr Met Pro Thr Tyr Glu Asp Lys Asp Gly155 160 165Asp Trp Met Leu Val Gly Asp Val Pro Trp Gln Met Phe Val Glu170 175 180Ser Cys Lys Arg Leu Arg Leu Met Lys Ser Ser Glu Ala Val Gly185 190 195Leu Gly Leu Lys Thr Ala Pro Lys Tyr Ser Ser Thr Asn200 205 208
權利要求
1.改變棉花纖維數量和性狀的基因GhIAA16，是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)與序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA序列。
2.根據權利要求1所述的基因，其特徵在於所述改變棉花纖維數量和性狀的基因GhIAA16具有序列表中序列1的DNA序列。
3.根據權利要求2所述的基因，其特徵在於該基因的讀碼框為自5』端第100到第773位鹼基。
4.改變棉花纖維數量和性狀的轉錄因子GhIAA16，是具有序列表中序列2胺基酸殘基序列的蛋白質，或者是將序列2的胺基酸殘基序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列2的胺基酸殘基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白質。
5.根據權利要求4所述的轉錄因子，其特徵在於它是具有序列表中序列2胺基酸殘基序列的蛋白質。
6.擴增權利要求2中任一片段的引物對，其中，上遊引物和下遊引物之間的距離在50到1000個鹼基之間；該引物對中的每一個引物的長度為15到30個鹼基。
7.含有權利要求2所述基因的表達載體。
8.根據權利要求2所述基因的細胞系。
9.權利要求2所述基因在培育纖維植物新品種中的應用。
10.權利要求2所述基因在培育棉花新品種中的應用。
全文摘要
本發明公開了改變棉花纖維數量和性狀的基因及其編碼蛋白與應用。本發明所提供的改變棉花纖維數量和性狀的基因名稱為GhIAA16，是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)與序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA序列。由基因GhIAA16編碼的改變棉花纖維數量和性狀的轉錄因子GhIAA16，是具有序列表中序列2胺基酸殘基序列的蛋白質，或者是將序列2的胺基酸殘基序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列2的胺基酸殘基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白質。本發明的基因對培育纖維植物新品種，特別是培育棉花新品種具有重要意義。
文檔編號A01N1/00GK1491956SQ0214596
公開日2004年4月28日 申請日期2002年10月25日 優先權日2002年10月25日
發明者索金鳳, 梁小娥, 張燕生, 薛勇彪 申請人:中國科學院遺傳與發育生物學研究所