使用抗rsv單克隆抗體的rsv檢測試劑盒、免疫層析試驗用具和抗rsv單克隆抗體的製作方法

2023-12-09 06:40:36

專利名稱：：使用抗rsv單克隆抗體的rsv檢測試劑盒、免疫層析試驗用具和抗rsv單克隆抗體的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一種使用抗呼吸道合胞病毒單克隆抗體、可對呼吸道合胞病毒進行高靈敏檢測的呼吸道合胞病毒檢測試劑盒及免疫層析試驗用具。本發明還涉及一種可用於製作該試劑盒或該用具的抗呼吸道合胞病毒單克隆抗體。
背景技術：
：呼吸道合胞病毒(以下簡稱"RSV"或"RS病毒")是引起小兒呼吸道感染的主要病原。通常感染RSV時，引起類似感冒的輕微症狀。但是，當免疫力低下的嬰幼兒和老年人感染RS病毒時，可引起毛細支氣管炎，發生呼吸困難，甚至有死亡的病例。因此，人們希望能快速簡便地檢測該病毒感染。RSV主要根據血清學上的不同，分為A型和B型兩個亞型。A型RSV已知Long株、A2株等。B型RSV已知9320株、Bl野生型株等。RSV包膜中有糖蛋白質的G蛋白質和與細胞融合相關的F蛋白質。G蛋白質己知在RSV亞型(A型、B型)間胺基酸序列有很大差異。另一方面，F蛋白質已知在RSV亞型(A型、B型)間胺基酸序列差異很小。識別RSV的抗RSV單克隆抗體己知有幾個。特許公開2001—510329號公報公開了與RS病毒的F蛋白質結合、有中和活性的變異單克隆抗體。特許公開2005-522996號公報公開了一種人RSV抗體。特許公開平11一507640號公報也公幵了與RS病毒的F蛋白結合的人單抗。各種克隆獲得的與RS病毒的F蛋白質結合的抗RSV單克隆抗體都可以在市面上買到。另外，基於利用諸如BDRSVexamen(BD公司)、CheckRSV(AlfresaPharma公司[愛芙樂賽製藥株式會社])、BinaxNOW(榮研化學)、免疫卡(TFB公司)、poctemSRSV(希森美康公司)等抗RSV單抗的免疫層析技術檢測RSV用的試劑盒市場上也有銷售。然而，用這些傳統的RSV檢測用試劑盒檢測RSV時，靈敏度不夠，有時全陽性樣本的30~40%會被診斷為陰性。
發明內容本發明的範圍只由後附權利要求書所規定，在任何程度上都不受這一節
發明內容的陳述所限。本發明提供一種檢測RSV用試劑盒，其包括由雜交瘤RSF2—412培育出的識別RS病毒F蛋白質的抗RSV單克隆抗體。所述試劑盒，還包括由雜交瘤RSF1—1565和雜交瘤RSF6—255培育出的識別RS病毒F蛋白質的抗RSV單克隆抗體中的至少其中一種。所述試劑盒用於試劑盒的所述抗RSV單克隆抗體中至少一種用標記物標記。被標記物標記的抗RSV單克隆抗體為由雜交瘤RSF1—1565培育出的抗RSV單克隆抗體。所述試劑盒其中抗RSV單克隆抗體的至少一種固定在固相上。固定在固相上的抗RSV單克隆抗體是選自雜交瘤RSF2—412和雜交瘤RSF6—255培育的抗RSV單克隆抗體中的至少一種。本發明還提供一種RSV檢測用免疫層析試驗用具，至少包括由雜交瘤RSF2—412培育的識別RS病毒F蛋白質的抗RSV單克隆抗體。所述免疫層析試驗用具，還包括由雜交瘤RSF1—1565和雜交瘤RSF6一255培育出的識別RS病毒F蛋白質的抗RSV單克隆抗體中的至少一種。所述免疫層析試驗用具，具有添加可能含RSV的試樣的加樣墊、固定抗RSV單克隆抗體的標記附著墊、有固定與標記附著墊所固定的抗體不同的抗RSV單克隆抗體的判斷區的層析膜，固定在標記物吸附墊的抗體被標記物標記。所述被標記物標記的抗體是由雜交瘤RSF1—1565培育出的抗RSV單克隆抗體。所述標記物為非溶性顆粒狀物質。所述非溶性顆粒狀物質為顯色合成高分子粒子或膠體金屬粒子。所述免疫層析試驗用具，固定在判斷區的抗RSV單克隆抗體是選自由雜交瘤RSF2—412和雜交瘤RSF6—255培育的抗RSV單克隆抗體中的至少一種。本發明另提供一種抗RSV單克隆抗體，由從雜交瘤RSF2—412、雜交瘤RSF1—1565和雜交瘤RSF6—255構成的群中選擇的至少一種雜交瘤培育，識別RS病毒F蛋白。圖1為本發明的免疫層析試驗用具的某種實施方式的例示圖。具體實施例方式下面參照附圖就本發明的具體實施方式進行說明。(雜交瘤和抗RSV單克隆抗體)本發明的用於RSV檢測用試劑盒和免疫層析試驗用具的抗RSV單克隆抗體由雜交瘤RSF2—412(以下稱為"雜交瘤412")培育而成。下面把這一抗體稱為"412抗體"。本發明的抗體可以從其本身用眾所周知的方法培養的雜交瘤獲得。即用與所希望相符的輔藥混合的RSV抗原、最好是用RS病毒F蛋白質免疫適當的哺乳動物(比如小鼠、大鼠等)。使該動物的脾細胞、淋巴細胞、B淋巴細胞等抗體產生細胞與來源於適當的哺乳動物(比如小鼠、大鼠等)的骨髓瘤細胞融合，即可獲得雜交瘤。通常，抗體產生細胞和骨髓瘤細胞來源於同種動物。細胞融合可以通過在適當的培養基中在聚乙二醇等參與下使抗體產生細胞和骨髓瘤細胞融合的PEG法等進行。細胞融合後，用HAT培養基等選擇性培養基選擇雜交瘤，關於雜交瘤產生識別RS病毒F蛋白質的抗體的能力，按常法(比如酶免疫檢測法(EIA))進行篩選。然後，按常法(如有限稀釋法)克隆產生適當抗體的雜交瘤，選擇產生單克隆抗體的雜交瘤。在本發明中，如以下實施例所示，用RS病毒F蛋白質免疫小鼠獲得的小鼠脾細胞和小鼠骨髓瘤細胞融合，獲得雜交瘤412。雜交瘤412於2008年6月26日寄存於國家技術評估研究所專利微生物寄存中心(日本國千葉縣木更津市上總鐮足2-5-8)，2009年移交國際保藏(保藏日2008年6月26日，保藏號NITEBP-601號)。在本發明中，用與上述同樣的方法獲得RSF1—1565(以下稱"雜交瘤1565")和雜交瘤RSF6—255(以下稱"雜交瘤255")。雜交瘤15652007年7月19日寄存於獨立行政法人產業技術研究所特許生物寄存中心(日本國茨城縣筑波市東1丁目1番地1中央第6)，2009年移交國際保藏(保藏日2007年7月19日，保藏號FERMBP—11119)。雜交瘤255於2008年6月26日寄存於國家技術評估研究所專利微生物寄存中心(曰本國千葉縣木更津市上總鐮足2-5-8)，2009年移交國際保藏(保藏日2008年6月26日，保藏號NITEBP-602號)。由雜交瘤1565和雜交瘤255產生的抗RSV單克隆抗體以下分別稱為1565抗體和255抗體。上述雜交瘤412、1565和255的具體獲得辦法在後述實施例中明示。上述各雜交瘤產生的412抗體、1565抗體和255抗體可與RS病毒F蛋白質結合。RSVLong株的F蛋白質的胺基酸序列眾所周知，表示為序列號l。如後述實施例所示，這三種抗體識別RS病毒F蛋白各個不同的表位。在本說明書中，"抗體"包含抗體、具有與該抗體同等RS病毒F蛋白質結合特性的抗體片段及其重構抗體。作為該抗體片段有Fab片段、F(ab，)2片段、Fab，片段、sFv片段等。(RSV檢測用試劑盒)本發明的RSV檢測用試劑盒至少包含由雜交瘤412產生的412抗體。在本說明書中，所謂"RSV檢測用試劑盒"指包括數個組分、通過將這些組分組合使用能夠檢測出RSV的組分集合。本發明的RSV檢測用試劑盒由包括上述412抗體在內的第一組分和其他組分構成。這些組分可以是含或不含抗體的溶液、含或不含抗體的固體載體及其組合等。本發明的試劑盒最好還包含識別與上述412抗體識別的RS病毒F蛋白質的表位不同表位的抗RSV抗體(以下稱"其他抗體")。該其他抗體可以是一種或幾種，但最好是二種。本發明的試劑盒最好包含412抗體及其他二種抗RSV抗體，共三種抗體，以此與過去的RSV檢測試劑盒相比，可以提高RSV檢測靈敏度。上述其他抗體識別的表位是否與412抗體識別的表位相同可以用眾所周知的方法檢測。作為眾所周知的方法有競爭抑制法。所謂競爭抑制法就是探討目標抗體對任意抗體和抗原結合的競爭抑制能力，是一種研究各抗體結合的表位是否相同的方法。更具體地說，就是在後述實施例3所示條件下進行的方法。上述任意抗體只要不是目標抗體，無特別限定。比如，在上述競爭抑制法中，當某種抗RSV抗體無法抑制412抗體可以抑制的任意抗體與RSV抗原的結合時，該抗RSV抗體就是上述"其他抗體"。當某種抗RSV抗體能夠抑制412抗體不能抑制的任意抗體與RSV抗原的結合時，該抗RSV抗體也是上述"其他抗體"。在上述競爭抑制法中，"能抑制"意思是對上述任意抗體和RSV抗原的結合抑制30%以上、理想的是50°/。以上、更好的是90%以上。在上述競爭抑制法中，"不能抑制"意思是對上述任意抗體和RSV抗原的結合只能抑制不到30%、更好的是不到10%、最好是0%。412抗體以外的本發明試劑盒中所含上述其他抗體最好是不與有序列號2所示胺基酸序列的蛋白質結合的抗RSV單克隆抗體。序列號2的胺基酸序列是RS病毒的F蛋白質的胺基酸序列(序列號l)的第421賴氨酸殘基變異為蘇氨酸殘基的胺基酸序列。不與有序列號2胺基酸序列的蛋白質結合的抗RSV單克隆抗體比如有1565抗體等(參照實施例5)。作為其他理想的其他抗體如有255抗體。特別是作為其他抗體最好是1565抗體和255抗體都含有的試劑盒。本發明的試劑盒只要包括有412抗體、包括可進行用抗原抗體反應檢出抗原的免疫檢測的這些組成要素，沒有其他特別限定。這種組成要素是該行業人員都知道的。作為免疫檢測法可採用免疫沉降、標記免疫檢測等方法。作為標記免疫檢測法如有免疫層析法、酶免疫試驗(EIA)、放射免疫測定(RIA)、螢光免疫測定(FIA)、化學發光免疫測定等。(標記抗體)作為本發明的試劑盒最好是標記免疫檢測試劑盒。在這種試劑盒中，所用的抗RSV單克隆抗體至少有一種被標記物標記。作為被標記物標記的抗體最好是不與有序列號2所示胺基酸序列的蛋白質結合的抗RSV單克隆抗體，尤以1565抗體為宜。上述標記物只要是在通常的免疫檢測中可用的標記物即可，無特別限定。比如可以是酶、螢光物質、放射性同位素、非溶性粒狀物等。作為酶如有鹼性磷酸酶、過氧化物酶、葡糖氧化酶、酪氨酸酶、酸性磷酸酶等。作為螢光物質如有異硫氰酸螢光素(FITC)、綠色螢光蛋白質(GFP)、螢光素等。作為放射性同位素如有125I、14C、"P等。作為上述非溶性粒狀物質，可以使用如寒天、瓊脂糖、架橋瓊脂糖、架橋海藻酸、架橋瓜爾膠、硝酸纖維素和羧基纖維素等纖維素酯類、凝膠、架橋凝膠、乳膠、橡膠、聚酯、聚乙烯、聚丙烯、苯乙烯-丁二烯共聚物、聚氯乙烯樹脂、聚醋酸乙烯酯、聚丙烯醯胺、聚甲基丙烯酸酯、苯乙烯-甲基丙烯酸酯共聚物、聚甲基丙烯酸環氧丙酯、丙烯醛-乙二醇二甲基丙烯酸酯共聚物等天然或合成樹脂及其衍生物。還可以使用用色素分子、螢光分子或磁粒子等標記由玻璃(比如活性化玻璃)、矽膠、高嶺土、雲母、矽鋁、氧化鋁、硫酸鋇等無機材料構成的粒子所得標記粒子作為非溶性粒狀物質。也可以將金膠體等金屬膠體粒子及紅細胞等作為非溶性粒狀物質使用。作為非溶性粒狀物質，尤以用色素分子標記上述合成高分子而成的顯色合成高分子粒子和金屬膠體粒子為宜。(固定在固相上的抗體)作為上述標記免疫檢測最好釆取利用抗體結合到固相上的固相法。在固相法中，所用抗RSV單克隆抗體至少一種固定在固相上。固定在固相上的抗體應至少一種是選自412抗體和255抗體。最好這兩種抗體都固定在固相上。作為固相法所用固相，如有微量滴定板、薄膜、粒子等。作為固相的材料可以使用膠乳、橡膠、聚乙烯、聚丙烯、苯乙烯樹脂、苯乙烯一丁二烯共聚物、聚氯乙烯、聚醋酸乙烯酯、聚丙烯醯胺、聚甲基丙烯酸酯、苯乙烯一甲基丙烯酸酯共聚物、聚甲基丙烯酸環氧丙酯、丙烯醛一乙二醇二甲基丙烯酸酯共聚物、聚偏氟乙烯(PVDF)、纖維素類(硝酸纖維素、醋酸纖維素等)、尼龍(如也可以羧基和烷基作為置換基的導入了氨基的修飾尼龍)等聚合物材料；瓊脂糖；明膠；紅細胞；矽膠、玻璃、無活性礬土、磁體等無機材料等。固相也可以將其中的一種或二種以上材料組合起來使用。(試樣)用本發明的RSV檢測用試劑盒進行試驗的試樣包括從RSV疑似患者採集的生物試樣、和對該生物試樣進行前期處理所得的試樣。作為生物試樣，如有血液、血清、糞便、尿液、唾液、鼻腔抽取液、拭液、汗液、淚液等。作為上述前期處理比如有將生物試樣溶解到適當的前期處理試劑中，用過濾器過濾溶解所得溶液等。(試劑盒的組成要素)當上述固相為微量滴定板時，本發明的試劑盒包含微量滴定板和至少含有上述412抗體的溶液。或者也可以將含有固定有412抗體的微量滴定板的試劑盒作為本發明的試劑盒。當上述固相是薄膜時，本發明的試劑盒包含薄膜和至少含有上述412抗體的溶液。或者也可以將含有固定有或吸附有412抗體的薄膜的試劑盒作為本發明的試劑盒。當上述固相是粒子時，本發明的試劑盒包含粒子和至少含有上述412抗體的溶液。或者也可以將含有固定有412抗體的粒子的試劑盒作為本發明的試劑盒。作為本發明的試劑盒，最好是免疫層析用試劑盒。即上述試劑盒包含固定或吸附有412抗體的免疫層析試驗用具。在本說明書中，所謂"吸附"抗體意指固相上的抗體可移動。(免疫層析試驗用具)本發明還提供一種固定或附著有412抗體的免疫層析試驗用具。上述免疫層析試驗用具最好具備添加可能含有RSV的試樣的加樣墊、吸附抗RSV單克隆抗體的標記附著墊和層析用膜載體(以下稱"層析膜，，)。在上述免疫層析試驗用具，最好加樣墊和標記附著墊接觸。加樣墊和層析膜最好接觸。加樣墊最好在層析膜的試樣展開方向上遊與層析膜接觸。標記附著墊最好配置在層析膜的試樣展開方向上遊。標記附著墊可以與層析膜接觸，也可以不接觸。在本說明書，所謂"試樣展開方向上遊"和"試樣展開方向下遊"指對於免疫層析試驗用具的長邊方向，當將加樣一側當作上遊，試樣展開(流動)方向作為下遊時的相對方向。(試驗用具的抗體)在上述免疫層析試驗用具中，吸附在標記附著墊的抗體最好用上述標記物標記。作為該標記物要能夠用肉眼便捷地觀察到顏色變化，因此最好是非溶性粒狀物，尤以顯色合成高分子粒子或金屬膠體粒子為宜。在上述免疫層析試驗用具，用標記物標記的抗體以不與有序列號2所示胺基酸序列的蛋白質結合的抗RSV單克隆抗體為宜，最好是1565抗體。固定在上述判斷區的抗RSV單克隆抗體應至少有一種選自412抗體和255抗體，最好是這二種抗體。(加樣墊)上述加樣墊可以是棉花、玻璃纖維、多孔聚乙烯、多孔聚丙烯等多孔合成樹脂和纖維素纖維等材質。加樣墊可以是這些材料構成的布、無紡布、濾紙、條或膜。(標記附著墊)上述標記附著墊可以是玻璃纖維、纖維素纖維、塑料(如聚酯、聚丙烯、聚乙烯等)纖維等材質的東西。上述標記附著墊最好還附著用於確認試樣是否適當展開的質控用標記物。質控用標記物最好對試樣中的成份實際上沒有反應。該質控用標記物可以與下述能與質控用標記物結合的物質成對使用。即，質控用標記物和能結合到質控用標記物的物質是二個能特異性結合的物質的組合，其中，以哪個為質控用標記物均可。作為這種能特異性結合的二個物質的組合可以列舉出半抗原和能與之結合的蛋白質，如生物素與鏈黴親和素或親和素、2，4一二硝基酚或異羥洋地黃毒苷與蛋白質(如清蛋白、酪蛋白、纖維蛋白原等)等。這些質控用標記物的組合最好使用試樣中沒有的組合。作為上述質控用標記物的標記可以使用與上述標記物同樣的標記。質控用標記物可用與抗體相同的標記成份標記，也可以不同標記成份標記。(層析膜)上述層析膜可以是靠靜電作用和疏水相互作用等物理作用能與蛋白質結合且能通過毛細管現象展開試樣的材質。作為層析膜，可以列舉出硝化纖維、尼龍(如也可以羧基和垸基作為置換基的導入了氨基的修飾尼龍)、聚偏氟乙烯(PVDF)、醋酸纖維素等。上述層析膜最好有固定了可與質控用標記物結合的物質的質控區，用於確認試樣是否適當展開。可與上述質控用標記物結合的物質如以上關於質控用標記物的敘述。(其他部件)上述免疫層析試驗用具還可以有吸收墊。吸收墊可以用纖維素、玻璃纖維、聚乙烯、聚丙烯等多孔塑料等材質的織物、無紡布等。該吸收墊最好配置在比層析膜靠近試樣展開方向下遊的位置，並與層析膜接觸。在這種位置上配置吸收墊可以加快試樣的展開速度。上述免疫層析試驗用具為了將上述加樣墊、標記附著墊和層析膜以及吸收墊任意地組裝在一起，最好有襯底。襯底只要可以作為普通免疫層析試驗用具的襯底使用即可，無特別限定。作為襯底比如可以使用塑料、紙張、玻璃等。該襯底為了組裝上述各部件，最好表面具有粘性。(試驗用具的製作方法)本發明的免疫層析試驗用具可以與眾所周知的免疫層析試驗用具用一樣的方法製作。即通過將標記附著墊浸泡在含有抗體、最好是標記抗體的適當緩衝液中，再乾燥，即可製作出標記附著墊。或者在標記附著墊中添加該緩衝液，再乾燥，也可製作出標記附著墊。層析膜為了使該抗體固定在判斷區，可通過在判斷區添加適當抗體並乾燥來製作。這些標記附著墊和層析膜與加樣墊適當組合裁剪，即可獲得上述免疫層析試驗用具。(試驗用具的優選實施方式)圖1為本發明的一個實施方式所涉及的免疫層析試驗用具的截面圖。此免疫層析試驗用具1在由表面有粘附層的塑料板構成的襯底2上有由棉質無紡布構成的加樣墊3、由玻璃纖維無紡布構成的標記附著墊4、由硝化纖維等多孔物質構成的層析膜5和由纖維無紡布構成的吸收墊6。襯底2為適當地配置加樣墊3和標記附著墊4等上述部件而設。襯底2可以為紙或玻璃等材質。加樣墊3上添加試樣。試樣只要可能含有RSV，沒有特別限定。作為試樣尤以鼻腔提取液、鼻腔擦拭液或咽喉擦拭液為佳。試樣也可以用緩衝液等適當溶劑稀釋後添加。在本實施方式中，標記附著墊4與加樣墊3接觸配置，吸附有被標記物標記的第一抗體(1565抗體)。在本實施方式中，層析膜5不直接與標記附著墊4接觸。層析膜5有固定了與待測物發生抗原抗體反應的第二抗體的判斷區5A。第二抗體只要是與上述第一抗體不同的抗體即可。在本實施方式中，使用412抗體和255抗體作為第二抗體。如果標記附著墊或判斷區的某一個含有412抗體的話，也可以在本發明的抗RSV單克隆抗體以外組合其他抗RSV單克隆抗體使用。吸收墊6與層析膜5接觸配置，用於吸收過剩試樣。吸收墊6隻要能迅速吸收並保持液體即可。而且，加樣墊3的一部分和吸收墊6的表面可以如圖l所示用透明條7覆蓋。本發明的免疫層析試驗用具1比如可如下製作。(1)將層析膜5貼在襯底2的中部。(2)在襯底2的上遊一側、層析膜5的試樣展開開始處(即圖1的左側，以下稱為"上遊側")與層析膜5末端不接觸、間隔地粘貼標記附著墊4。(3)將加樣墊3上遊部分貼在襯底2的最上遊部分。(4)將加樣墊3的試樣展開結尾處(即圖1的右側，以下稱"下遊側")部分放在標記附著墊4和層析膜5的上遊側上面。(5)在標記附著墊4和層析膜5之間的襯底2貼上加樣墊3。(6)將吸收墊6的上遊側部分放在層析膜5的下遊側上面。(7)將吸收墊6的下遊側部分貼在襯底2的最下遊側處。(8)用透明條7覆蓋加樣墊3下遊側部分和吸收墊6的表面。試樣根據需要與適當的溶劑混合，製成可層析展開的混合液。再將上述免疫層析試驗用具1的上遊(加樣墊3)浸入該混合液，或將該混合液添加到加樣墊。這樣，該混合液通過加樣墊3在標記附著墊4與標記的第一抗體混合。如果上述混合液中存在RSV抗原，則在抗原抗體反應的作用下，RSV抗原與第一抗體結合，形成複合物。此複合物在層析膜5中移動，到達判斷區5A。複合物與固定在判斷區5A的第二抗體發生抗原抗體反應，被判斷區5A捕捉。此時，如果作為標記物使用的是藍色乳膠粒子等顯色合成高分子粒子的話，判斷區5A會因該粒子的聚集顯現為藍色。這樣就可以馬上目測確認RSV的存在。層析膜5也可以不止有一個，而是有二個以上判斷區。層析膜5也可以有質控區。當有質控區時，只要在標記附著墊4上可移動地附著用標記物比如紅色乳膠粒子標記的親和素，在層析膜5的質控區固定與親和素特異性結合的生物素即可。使用本發明的RSV檢測用試劑盒和免疫層析試驗用具，比傳統的RSV檢測方法更能提高RSV檢測靈敏度。因此，能夠更準確、便捷地檢測出RSV，得以為更準確地診斷RSV感染提供指標。實施例下面通過以下實施例更詳細地說明本發明，但本發明不限於這些實施例。雜交瘤的製備(小鼠免疫)在市場銷售的Capricon公司制的含有RSV抗原的磷酸緩衝液(PBS)100pL中加入10(^l福氏完全佐劑(FCA)混合、乳化，製作FCARSV抗原溶液200^1。再以上述同樣的方法不使用FCA，而使用福氏不完全佐劑(FIA)製作200(J的FIARSV抗原溶液。用200pl的FCARSV抗原溶液向7~8周齡的BALB/C雌鼠進行腹腔內注射，進行首次免疫。首次免疫後，隔2~3周用FIARSV抗原溶液200^1進行追加免疫。在分離脾細胞10天前和3天前靜脈注射200^1RSV抗原(Capricon公司制)。最後一次注射結束三天後，分離脾細胞，用PEG法融合脾細胞和P3X63—Ag8，653鼠骨髓瘤細胞，製備雜交瘤。(雜交瘤培養)將雜交瘤懸浮於HAT培養基，濃度至2.5xl(^細胞/ml，向96孔微孔板(Coming康寧公司制；以下稱培養板)各孔分裝2.5><105細胞/孔。培養板在37°C、8%C02的恆溫槽內靜置，開始雜交瘤的培養。培養十天以上，出現雜交瘤集落時篩選產生單克隆抗體的雜交瘤。(雜交瘤篩選)在含有O.lw/v%NaN3的0.1M磷酸緩衝液(PBSpH7.5)中添加RSV抗原，直至RSV抗原(Capricon公司制)濃度為0.5嗎/ml，調製固定用RSV抗原溶液。將此固定用RSV抗原溶液lOOpl分裝到免疫模塊(NUNC公司制)各孔(以下稱抗原固定板)。抗原固定板4。C過夜後，在濃度為0.05。/。時用含有Tween20的PBS緩衝液(以下稱緩衝液A)洗滌三次。洗滌後，在濃度為lw/VM)時將含BSA的PBS緩衝液(以下稱緩衝液B)30(^1分裝到抗原固定板各孔，28t:靜置存放4小時以上。抗原固定板在使用前一直在28"C保存。除去抗原固定板中的緩衝液B。除去後，向抗原固定板各孔分別分裝75^1緩衝液B。再將上述雜交瘤培養上清從培養板各孔取出，並向抗原固定板各孔分別添加25^1。添加緩衝液B和培養上清後，室溫攪拌一小時。攪拌後用緩衝液A洗滌抗原固定板各孔三次。洗滌後，向抗原固定板各孔分別添加用緩衝液B稀釋了10000倍的辣根過氧化物酶(POD)標記抗小鼠Ig多克隆抗體(DAKO公司制；編號No.P0447)各100^1，室溫反應30分鐘。反應後，用緩衝液A洗滌抗原固定板各孔三次。洗滌後，每孔各加10(^1含POD的底物即鄰苯二胺(OPD)的底物液，室溫中靜置10分鐘。再加含2HH2S04的反應終止液於抗原固定板各孔，每孔100|_il。對於各孔中的反應液，用酶標儀(分子儀器公司制)測定492nm處的吸光度。所得三個雜交瘤RSF1—1565、RSF2—412、RSF6—255委託國際保藏(保藏號FERMBP-11119號、保藏號MTE601號、和保藏號NITE602號)。抗RS病毒一F蛋白質單克隆抗體的反應性的確認(1565抗體、412抗體和255抗體的反應性的確認)RS病毒一F抗原使用的是Long株(10[6.7]TCID(50)/ml)、A2株(10[5.5]TCID(50)/ml)、9320株(10[5.5]TCID(50)/ml)和Bl野生型(wild-type)(BWV)株(10[4.5]TCID(50)/ml)的RSV。這些RSV4株可從美國標準生物品收藏中心(ATCC)購得。用含牛血清白蛋白(BSA)的磷酸緩衝液(以下稱為第一緩衝液)將上述RSV稀釋到1/10。已稀釋的各抗原液和樣本萃取液(100mM檸檬酸一0.4MNaCl、10mM二硫蘇糖醇、0.1(v/v)。/。聚氧乙烯辛基苯基醚(Polyoxyethyleneoctylphenylether))等量混合，萃取處理5分鐘，製備各種抗原萃取液。製備含市面上出售的抗鼠抗體IgG與瓊脂糖凝膠珠(安瑪西亞生物科學(AmershamBiosciences)公司制)結合而成的珠體濃度為15v/v。/。的瓊脂糖凝膠溶液。混合瓊脂糖凝膠溶液、上述各抗原萃取液和第一緩衝液，製備各種抗原試樣。各抗原試樣中的瓊脂糖凝膠溶液和各抗原萃取液的混合量例示如表1。tableseeoriginaldocumentpage17抗原試樣加入96孔V底板(三博特(sanplatec)公司制)各孔，每孔60pL。再將1565抗體、412抗體和255抗體分別用第一緩衝液稀釋到l嗎/ml，製備1565抗體液、412抗體液和255抗體液。將製備的各抗體液分別加入各孔，每孔30pL。然後，室溫攪拌96孔V底板60分鐘。攪拌後，96孔V底板靜置10分鐘。在免疫模塊(能肯(NUNC)公司制)各孔分別加入100pL的用0.1M磷酸納緩衝液稀釋到濃度10|ig/ml的133—1H抗體(CHEMICON公司制；抗RSV的抗體)溶液。再用含(Tween20)吐溫20的磷酸緩衝液(以下稱第二緩衝液)洗滌三次各孔。洗滌後，在各孔分別注入30(HiL第一緩衝液封閉(稱此免疫模塊為133—1H抗體致敏板)。清除133—1H抗體致敏板中的第一緩衝液。清除後，在133—1H抗體致敏板各孔添加上述靜置IO分鐘的96孔V底板各孔的上清50pL。133—1H抗體致敏板室溫中攪拌30分鐘後，用第二緩衝液洗滌三遍133—1H抗體致敏板。在洗淨後的133—1H抗體致敏板各孔添加100pl含生物素標記的B016抗體(Serotec公司制；最終濃度2pg/ml)和用鏈黴親和素標記的辣根過氧化物酶(POD;最終濃度50mU/ml)的第一緩衝液。室溫中攪拌133—1H抗體致敏板60分鐘。然後，用第二緩衝液洗滌133—1H抗體致敏板三將含POD的底物即鄰苯二胺(OPD)的底物液分別添加至133—1H抗體致敏板各孔各10(^1，室溫中靜置10分鐘。再在133—1H抗體致敏板各孔各添加100nl含2NH2S04的反應終止液，用酶標儀(美國分子儀器(MolecularDevices)公司制)測定各孔中反應液在492nrn處的吸光度(吸光度A)。作為質控試驗，將抗體液換為第一緩衝液製備質控試樣，進行同樣的試驗，測定吸光度(吸光度B)。作為質控試驗，還用第一緩衝液代替抗體液和抗原試樣，製備質控試樣，進行同樣的試驗，測定吸光度(吸光度C)。用所得吸光度AC以下述(1)式求使用各來源於雜交瘤的抗RS病毒一F蛋白單克隆抗體的測定試樣的吸收率。吸收率(％)=[1—(A—C)/(B—C)]x100(1)各抗RSV—F蛋白單克隆抗體的反應性評價結果如表2所示。在表2中，"+++，，表示(i)式所求吸收率為90%以上，"++"表示50%以上，"+"表示30%以上，"一"表示不到30%。tableseeoriginaldocumentpage18從表2的結果明顯看出，1565抗體、412抗體和255抗體對Long株、A2株、9320株及BWV株的任何一種抗原均顯示反應性。[實施例3]抗RS病毒一F蛋白單克隆抗體的抗原識別部位的確認(對B016抗體的抑制試驗)A2株(10[5.5]TCID(50)/ml)用第一緩衝液稀釋到1/10。等量混合稀釋的抗原液和樣本萃取液，進行5分鐘的萃取處理，製備A2株抗原萃取液。再將A2株抗原萃取液用第一緩衝液稀釋到1/20，製備抗原試樣。用0.1M磷酸納緩衝液稀釋到濃度10pg/mL的133—1H抗體(DHEMICON公司)溶液在免疫模塊(NUNC公司制)各孔分別加入100pL。用第二緩衝液洗滌各孔三次。洗滌後各孔各加300|aL第一緩衝液封閉(以下稱此免疫模塊為133—1H抗體致敏板)。除去133—1H抗體致敏板中的第一緩衝液。除去後在133—1H抗體致敏板各孔中加100pL抗原試樣，攪拌30分鐘。再用第二緩衝液洗滌抗體致敏板各孔三遍。1565抗體、412抗體和255抗體分別用第一緩衝液稀釋為10pg/ml，製備1565抗體液、412抗體液和255抗體液。將製備的各抗體液各加50pL於133—1H抗體致敏板各孔中。再在133—1H抗體致敏板各孔中加入50pL含生物素標記的B016抗體(UK—Serotec公司制；最終濃度2pg/ml;針對RSV的抗體)和鏈黴親和素標記的POD(最終濃度40mU/ml)的第一緩衝液，之後，室溫中攪拌133—1H抗體致敏板60分鐘，再用第二緩衝液洗滌B3—1H抗體致敏板三遍。在133—1H抗體致敏板各孔中分別加入100pL含OPD的底物液，室溫中靜置IO分鐘。再在133—1H抗體致敏板各孔中各加100pL含2NH2S04的反應終止液，對各孔中的反應液用酶標儀測定在492nm處的吸光度(吸光度A)。作為質控試驗，將抗體液換為第一緩衝液製備質控試樣，進行同樣的試驗，測定吸光度(吸光度B)。作為質控試驗，還用第一緩衝液代替抗體液和抗原試樣，製備質控試樣，進行同樣的試驗，測定吸光度(吸光度C)。用所得吸光度AC以下述(2)式求出使用各來源於雜交瘤的抗RS病毒一F蛋白質單克隆抗體的測定試樣的抑制率。抑制率(％)=[1—(A—C)/(B—C)]xl00(2)(對133—1H抗體的抑制試驗)試驗除使用將B016抗體在免疫模塊各孔致敏的B016抗體致敏板取代133—1H抗體致敏板、和用生物素標記的133—1H抗體取代生物素標記的B016抗體外，均與上述對B016抗體的抑制試驗相同。各抗RS病毒一F蛋白單克隆抗體對133—1H抗體和B016抗體的抑制結果如表3所示。在表3中，"+++"表示(2)式所求抑制率為90%以上，"++"表示50%以上，"+"表示30%以上，"一"表示不到30°/。。克隆抗體名對133-1H抗體的抑制對B016抗體的抑制RSF1-1565+++—RSF2-"2一RSF6-255—+++從表3的結果看，顯然412抗體與133—1H抗體和B016抗體有不同的抗原識別部位。通過RS病毒一F蛋白單克隆抗體組合檢測RSV抗原的試驗用第一緩衝液將Long株(10[6.7]TCID(50)/ml)稀釋到1/10。等量混合已稀釋的各抗原液和樣本萃取液，萃取處理5分鐘，製備Long株抗原萃取液。向免疫模塊各孔分別加入各100pL的用0.1M磷酸納緩衝液稀釋到濃度5昭/mL的1565抗體、412抗體和255抗體。用第二緩衝液洗滌各孔三次。洗滌後各孔分別各加300pL第一緩衝液封閉，製作1565抗體致敏板、412抗體致敏板和255抗體致敏板。除去各抗體致敏板中的第一緩衝液。除去後，向各抗體致敏板各孔中按照50pL/孔添加Long株抗原萃取液。在室溫中攪拌30分鐘後，用第二緩衝液洗滌三遍。按眾所周知的方法分別對1565抗體、412抗體和255抗體進行生物素標記，以此製備生物素標記RSF1—1565抗體、生物素標記RSF2~412抗體和生物素標記RSF6—255抗體。向各抗體致敏板按照100nL/孔添加含所制各生物素標記抗體(最終濃度2嗎/ml)和鏈黴親和素標記的POD(最終濃度40mU/ml)的第一緩衝液。室溫中攪拌各抗體致敏板60分鐘後，用第二緩衝液洗滌三遍。在各抗體致敏板各孔中各加入lOO^L含OPD的底物液，室溫中靜置10分鐘。再在各抗體致敏板各孔中各加100pL含2NH2S04的反應終止液。對各孔中的反應液用酶標儀測定492nm處的吸光度。測定結果見表4。固相一側RSF1-1565RSF2-412RSF6-255標記一側RSF2-"2RSF1-1565RSF6-255從表4的結果得知，1565抗體、412抗體和255抗體只要固相一側和標記一側的抗體不用同一種抗體，通過各種組合均可用夾心免疫檢測法檢出RSV抗原。1565抗體的表位分析(1565抗體逃逸株的製備)將RSV感染細胞Hep2用添加了10%胎牛血清的EagleMEM(SIGMA公司制)在24孔板(康寧(Corning)公司制)中培養。Hep2細胞形成集落時，將培養液換成含1%胎牛血清的EagleMEM，以MOI=0.0005感染Long株(10[6.7]TCID(50)/ml)。感染後，在37。C、5%C02中培養1小時。經一小時培養後，按照20pg/孔添加1565抗體。添加抗體後，在37"、5。/。C02培養34天。除去另用含10%胎牛血清的EagleMEM培養的Hep2細胞的培養液，添加培養3~4天的上述細胞培養上清的1/2量。再添加與細胞培養上清等量的含1%胎牛血清的EagleMEM。添加後37。C、5%032培養1小時。培養1小時後，力Q1565抗體20)ig/孔。添加抗體後，在37°C、5%(302培養34天。此操作再進行五次。在1565抗體存在的情況下進行共計七次RSV感染繼代培養後，觀察細胞病變效應。根據觀察的細胞病變效應得以確認出現1565抗體逃逸株，因此將此細胞培養液全部回收，凍結保存。(1565抗體逃逸株的RS病毒-F蛋白質基因序列分析及胺基酸序列分析)用ReverTraAce-a-(東洋紡公司制，產品代碼FSK-101)和引物[序列ATGGAGTTGCCAATCCTCAAAGC(序列號3)]從1565抗體逃逸株的培養上清和Long株合成cDNA。用PrimeStar(TAKARA公司制產品代碼R010A)和引物[序列ATGGATCCATGGAGTTGCCAATCCTCAAAGC(序歹U號4)、GCATT(序列號5)]從合成的各cDNA進行聚合酶鏈式反應(PCR)。PCR在95'C反應2分鐘後，以95"C反應30秒、55。C反應20秒和72'C反應100秒為一個循環，重複這樣的循環35次。反應結束後，冰結保存PCR產物。用MinElutePCR純化試劑盒(QIAGEN公司制)從PCR產物除去引物。用BigDyeTerminatorv3.1循環測序試劑盒(美國生物應用系統(AppliedBiosystems)公司制)及引物[序歹U:ATGGATCCATGGAGTTGCCAATCCTCAAAGC(序歹lj號4)、TTTCTTGGTTTTTTGTTAGGTGTTGG(序歹lj號6)、TTTAACATTACCAAGTGAAATAAATCT(序歹ij號7)、TCTTCTTTTCCTTTTCTTGCTTAATG(序歹U號8)]從棄弓l物的PCR產物進行循環測序反應。反應後，除去標記核苷，用測序儀(美國生物應用系統公司制)和序列分析軟體(日立軟體公司制)進行基因序列分析和預測胺基酸序列分析。1565抗體逃逸株的RS病毒^F蛋白質的胺基酸序列見序列號2。Long株的RS病毒一F蛋白質的胺基酸序列見序列號1。從序列號1和序列號2可以看出，RSF1—1565抗體逃逸株的RS病毒一F蛋白質第421賴氨酸(K)變為蘇氨酸(T)。(對1565抗體逃逸株的反應性分析)1565抗體逃逸株的培養上清液和Long株用第一緩衝液稀釋到1/10。等量混合稀釋的各抗原液和樣本萃取液，萃取處理5分鐘，製備各抗原萃取液。再將各抗原萃取液用第一緩衝液稀釋到1/5，製備抗原試樣。向免疫模塊(NUNC公司制)各孔中分別添加lOOpL的用0.1M磷酸納緩衝液稀釋到濃度10嗎/mL的B016抗體(UK—Serotec公司制)溶液。用含Tween20的磷酸緩衝液(以下稱第二緩衝液)洗滌各孔三次。洗滌後，在各孔中分別添加第一緩衝液30(HiL並封閉(以下稱此免疫模塊為B016抗體致敏板)。除去B016抗體致敏板中的第一緩衝液。除去後向B016抗體致敏板各孔添加100pL抗原試樣，攪拌30分鐘。然後用第二緩衝液洗滌B016抗體致敏板各孔三次。按眾所周知的方法對1565抗體進行生物素標記，製備生物素標記RSF1—1565抗體。向B016抗體致敏板各孔分別添加100pL的含有製備的1565生物素標記抗體(最終濃度2嗎/mL)和鏈黴親和素標記POD(最終濃度40mU/ml)的第一緩衝液後，B016抗體致敏板在室溫中攪拌60分鐘。再用第二緩衝液洗滌B016抗體致敏板三次。B016抗體致敏板各孔分別添加100pL含OPD的底物液，室溫中靜置IO分鐘。向B016抗體致敏板各孔分別添加100pl的含2HH2S04的反應終止液後，對各孔中的反應液，用酶標儀測定492nm處的吸光度。吸光度的測定結果如表5所示。tableseeoriginaldocumentpage23從表5可以看出，1565抗體不識別1565抗體逃逸株的RS病毒一F蛋白質。製作檢測RSV用免疫層析試驗用具(本發明試驗用具的製作)將1565抗體作為標記物標記的第一抗體使用，將412抗體和255抗體作為固定在層析膜上的第二抗體使用，按以下方法製作圖1所示免疫層析試驗用具l(以下稱試驗用具)。首先，用磷酸緩衝液(pH7.0)將412抗體和255抗體最終濃度稀釋到1.0mg/mL，製備412抗體'255抗體混合液。再用抗體塗敷機(Bio-Dot公司產品)將412抗體'255抗體混合液在硝化纖維膜制層析膜判斷區5A塗lmm寬，5(TC乾燥30分鐘。將乾燥後的層析膜5浸入封閉液(含BSA的磷酸緩衝液(pH7.0))進行封閉。再用洗滌液(含有SDS的磷酸緩衝液(pH7.0))洗滌，於40。C下乾燥120分鐘，獲得層析膜5。然後，使1565抗體對藍色顯色聚苯乙烯乳膠粒子(粒徑0.3pm)發生致敏作用，懸浮於分散用緩衝液(含BSA和蔗糖的磷酸緩衝液(pH7.0))，製備1565抗體致敏乳膠粒子。致敏時的抗體濃度為每lmLl。/。乳膠粒子200嗎IgG。將此1565抗體致敏乳膠粒子加入玻璃纖維制襯墊後，用真空乾燥機乾燥，獲得標記附著墊4。用上述層析膜5和標記附著墊4得到本發明的試驗用具。(質控試驗用具的製備)製備方法除用B016抗體作為第一抗體、用133-lH抗體作為第二抗體和用稀釋到最終濃度為2.0mg/mL的B016抗體代替412抗體和255抗體混合液以外其他均與上述本發明試驗用具的製作相同，製備質控試驗用具。確認本發明試驗用具和傳統試驗用具對RSV的反應性(用本發明試驗用具檢測RSV)用實施例6製備的本發明試驗用具按下述步驟確認對RSV的反應性。(1)用Vero細胞培養表6所示三種RSV(Long株、BWV株及9320株)，用生理鹽水按表6所示稀釋倍率稀釋所得病毒，製備病毒液。(2)向800pL樣本萃取試劑(含0.3w/v%NP—40(乙基苯基聚乙二醇)的磷酸緩衝液pH7.3)中添加150)iL上述(1)製備的一定稀釋倍率的病毒液進行混合，製備測定用試樣。(3)將約200pL上述(2)製備的測定用試樣滴入玻璃試管，本發明試驗用具的上遊(加樣墊3)浸入其中放置約IO分鐘後，用肉眼判斷判斷區5A顯色情況。當確認顯色時評價為(+)，未確認顯色時評價為(一)。結果見表6。(用傳統試驗用具檢測RSV)作為傳統試驗用具，使用了質控試驗用具，市面上出售的試驗用具使用的是checkRSV(AlfresaPharma公司制)和BDRSVexamen(BectoivDickinson公司制)，用此確認其對RSV的反應性。質控試驗用具按與上述本發明試驗用具同樣的步驟確認了其對RSV的反應性。市面上出售的試驗用具用上述病毒液按各市面上出售的試驗用具附帶的資料所記操作步驟確認了其對RSV的反應性。反應性的確認結果見表6。tableseeoriginaldocumentpage25NT:未試驗從表6可以看出，本發明的試驗用具對RSV顯示出比傳統試驗用具更高的反應性。序列表<110〉<120〉<130〉<勝<170〉<210〉希森美康株式會社使用抗RSV單克隆抗體的RSV檢測試劑盒、免疫層析試驗用具和新型抗RSV單克隆抗體08-0078Patentlnversion3.11574PRT呼吸道合胞病毒1MetGluLeuProlieLeuLysAlaAsnAlalieThrThrlieLeuAla151015AlaValThrPheCysPheAlaSerSerGinAsnlieThrGluGluPhe202530TyrGinSerThrCysSerAlaValSerLysGlyTyrLeuSerAlaLeu354045ArgThrGlyTrpTyrThrSerVallieThrlieGluLeuSerAsnlie505560LysGluAsnLysCysAsnGlyThrAspAlaLysValLysLeulieLys65707580GinGluLeuAspLysTyrLysAsnAlaValThrGluLeuGinILeuLeu859095MetGinSerThrProAlaAlaAsnAsnArgAlaArgArgGluLeuPro100105110ArgPheMetAsnTyrThrLeuAsnAsnThrLysLysThrAsnValThr115120125LeuSerLysLysArgLysArgArgPheLeuGlyPheLeuLeuGlyVal130135140GlySerAlalieAlaSerGlyThrAlaValSerLysValLeuHisLeu145150155160GluGlyGluValAsnLyslieLysSerAlaLeuLeuSerThrAsnLys165170175AlaValValSerLeuSerAsnGlyValSerValLeuThrSerLysVal180185190LeuAspLeuLysAsnTyrlieAspLysGinLeuLeuProlieValAsn195200205LysGinSerCysArglieSerAsnlieGluThrVallieGluPheGin210215220GinLysAsnAsnArgLeuLeuGlulieThrArgGluPheSerValAsn225230235240AlaGlyValThrThrProValSerThrTyrMetLeuThrAsnSerGlu245250255LeuLeuSerLeulieAsnAspMetProlieThrAsnAspGinLysLys260265270LeuMetSerAsnAsnValGinlieValArgGinGinSerTyrSerlie275280285MetSerlielieLysGluGluValUuAlaTyrValValGinLeuPro290295300LeuTyrGlyVallieAspThrProCysTrpLysLeuHisThrSerPro305310315320LeuCysThrThrAsnThrLysGluGlySerAsnlieCysLeuThrArg325330335ThrAspArgGlyTrpTyrCysAspAsnAlaGlySerValSerPhePhe340345350ProGinAlaGluThrCysLysValGinSerAsnArgValPheCysAsp355360365ThrMetAsnSerLeuThrLeuProSerGluValAsnLeuCysAsnVal370375380AspliePheAsnProLysTyrAspCysLyslieMetThrSerLysThr385390395400AspValSerSerSerVallieThrSerLeuGlyAlalieValSerCys405410415TyrGlyLysThrLysCysThrAlaSerAsnLysAsnArgGlylielie420425430LysThrPheSerAsnGlyCysAspTyrAlaSerAsnLysGlyValAsp435440445ThrValSerValGlyAsnThrLeuTyrTyrValAsnLysGinGluGly450455460LysSerLeuTyrValLysGlyGluProlielieAsnPheTyrAspPro465470475480LeuValPheProSerAspGluPheAspAlaSerlieSerGinValAsn485490495GluLyslieAsnGinSerLeuAlaPhelieArgLysSerAspGluLeu500505510LeuHisHisValAsnAlaGlyLysSerThrThrAsnlieMetlieThr515520525ThrlielielieVallielieVallieLeuLeuSerLeulieAlaVal530535540GlyLeuLeuLeuTyrCysLysAlaArgSerThrProValThrLeuSer545550555560LysAspGinLeuSerGlylieAsnAsnlieAlaPheSerAsn565570<210〉2574<212〉PRT呼吸道合胞病毒2MetGluLeuProlieLeuLysAlaAsnAlalieThrThrlieLeuAla151015AlaValThrPheCysPheAlaSerSerGinAsnlieThrGluGluPhe202530TyrGinSerThrCysSerAlaValSerLysGlyTyrLeuSerAlaLeu354045ArgThrGlyTrpTyrThrSerVallieThrlieGluUuSerAsnlie505560LysGluAsnLysCysAsnGlyThrAspAlaLysValLysLeulieLys65707580GinGluLeuAspLysTyrLysAsnAlaValThrGluLeuGinLeuLeu859095MetGinSerThrProAlaAlaAsnAsnArgAlaArgArgGluLeuPro100105110ArgPheMetAsnTyrThrLeuAsnAsnThrLysLysThrAsnValThr115120125LeuSerLysLysArgLysArgArgPheLeuGlyPheLeuLeuGlyVal130135140GlySerAlalieAlaSerGlyThrAlaValSerLysValLeuHisLeu145150155160GluGlyGluValAsnLyslieLysSerAlaLeuLeuSerThrAsnLys165170175AlaValValSerLeuSerAsnGlyValSerValLeuThrSerLysVal180185190LeuAspLeuLysAsnTyrlieAspLysGinLeuLeuProlieValAsn195200205LysGinSerCysArglieSerAsnlieGluThrVallieGluPheGin210215220GinLysAsnAsnArgLeuLeuGlulieThrArgGluPheSerValAsn225230235240AlaGlyValThrThrProValSerThrTyrMetLeuThrAsnSerGlu245250255LeuLeuSerLeulieAsnAspMetProlieThrAsnAspGinLysLys260265270LeuMetSerAsnAsnValGinlieValArgGinGinSerTyrSerlie275280285MetSerlielieLysGluGluValLeuAlaTyrValValGinLeuPro290295300LeuTyrGlyVallieAspThrProCysTrpLysLeuHisThrSerPro305310315320LeuCysThrThrAsnThrLysGluGlySerAsnlieCysLeuThrArg325330335ThrAspArgGlyTrpTyrCysAspAsnAlaGlySerValSerPhePhe340345350ProGinAlaGluThrCysLysValGinSerAsnArgValPheCysAsp355360365ThrMetAsnSerLeuThrLeuProSerGluValAsnLeuCysAsnVal370375380AspliePheAsnProLysTyrAspCysLyslieMetThrSerLysThr385390395400AspValSerSerSerVallieThrSerLeuGlyAlalieValSerCys405410415TyrGlyLysThrThrCysThrAlaSerAsnLysAsnArgGlylielie420425430LysThrPheSerAsnGlyCysAspTyrAlaSerAsnLysGlyValAsp435440445ThrValSerValGlyAsnThrLeuTyrTyrValAsnLysGluGluGly450455460LysSerLeuTyrValLysGlyGluProlielieAsnPheTyrAspPro465470475480LeuValPheProSerAspGluPheAspAlaSerlieSerGinValAsn485490495GluLyslieAsnGinSerLeuAlaPhelieArgLysSerAspGluLeu500505510LeuHisHisValAsnAlaGlyLysSerThrThrAsnlieMetlieThr515520525ThrlielielieVallielieVallieLeuLeuSerLeulieAlaVal530535540GlyLeuLeuLeuTyrCysLysAlaArgSerThrProValThrLeuSer545550555560LysAspGinLeuSerGlylieAsnAsnlieAlaPheSerAsn5655703〈211〉23DNA人工序列反轉錄引物3atggagttgccaatcctcaaage4《211>31DNA人工序列PCR引物4atggatccatggagttgccaatcctcaaagc5522331DNA人工序列<220〉<223〉PCR引物5tag幼ttctagtgatggtgatggtgatgatttgtggtggatttaccagcatt52<210〉6<211〉26腿人工序列<220〉<223〉循環測序引物6tttcttggttttttgttaggtgttgg26727腿<213〉人工序列<220〉循環測序引物<400〉7tttaacattaccaagtgaaataaatct27<210〉826DNA人工序列循環測序引物<400〉8tcttcttttccttttcttgcttaatg2權利要求1.一種檢測RSV用試劑盒，包括由雜交瘤RSF2-412培育的識別RS病毒F蛋白質的抗RSV單克隆抗體。2.權利要求1所述試劑盒，還包括由雜交瘤RSF1—1565和雜交瘤RSF6—255培育出的識別RS病毒F蛋白質的抗RSV單克隆抗體中的至少其中——禾中。3.權利要求1所述試劑盒，其特徵在於用於試劑盒的所述抗RSV單克隆抗體中至少一種用標記物標記。4.權利要求3所述試劑盒，其特徵在於被標記物標記的抗RSV單克隆抗體為由雜交瘤RSF1—1565培育出的抗RSV單克隆抗體。5.權利要求1所述試劑盒，其特徵在於抗RSV單克隆抗體中至少一種固定在固相上。6.權利要求5所述試劑盒，其特徵在於固定在固相上的抗RSV單克隆抗體是選自雜交瘤RSF2—412和雜交瘤RSF6—255培育的抗RSV單克隆抗體中的至少一種。7.—種RSV檢測用免疫層析試驗用具，至少包括，由雜交瘤RSF2—412培育的識別RS病毒F蛋白質的抗RSV單克隆抗體。8.權利要求7所述免疫層析試驗用具，還包括，由雜交瘤RSF1—1565和雜交瘤RSF6—255培育出的識別RS病毒F蛋白質的抗RSV單克隆抗體中的至少一種。9.權利要求7所述免疫層析試驗用具，其特徵在於具有添加可能含RSV的試樣的加樣墊，固定抗RSV單克隆抗體的標記附著墊，有固定與標記附著墊所固定的抗體不同的抗RSV單克隆抗體的判斷區的層析膜；固定在標記物吸附墊的抗體被標記物標記。10.權利要求9所述免疫層析試驗用具，其特徵在於被標記物標記的抗體是由雜交瘤RSF1—1565培育出的抗RSV單克隆抗體。11.權利要求9所述免疫層析試驗用具，其特徵在於標記物為非溶性顆粒狀物質。12.權利要求11所述免疫層析試驗用具，其特徵在於非溶性顆粒狀物質為顯色合成高分子粒子或膠體金屬粒子。13.權利要求9所述免疫層析試驗用具，其特徵在於固定在判斷區的抗RSV單克隆抗體是選自由雜交瘤RSF2—412和雜交瘤RSF6—255培育的抗RSV單克隆抗體中的至少一種。14.一種抗RSV單克隆抗體，其特徵在於由從雜交瘤RSF2—412、雜交瘤RSF1—1565和雜交瘤RSF6—255構成的群中選擇的至少一種雜交瘤培育，識別RS病毒F蛋白質。全文摘要本發明公開一種RSV檢測用試劑盒以及免疫層析試驗用具。至少包括由雜交瘤RSF2-412培育的識別RS病毒(RSV)F蛋白的抗RSV單克隆抗體。同時，本發明還公開了一種抗RSV單克隆抗體，由從雜交瘤RSF2-412、雜交瘤RSF1-1565和雜交瘤RSF6-255構成的群中選擇的至少一種雜交瘤培育，識別RS病毒F蛋白質。文檔編號G01N33/577GK101629959SQ20091016063公開日2010年1月20日申請日期2009年7月17日優先權日2008年7月18日發明者坂口晃司,朝枝步,沖津直哉,長谷川武宏,隈元裕司申請人:希森美康株式會社