一種蟲草菌絲體多糖分離純化的方法
2023-12-08 18:07:36 1
一種蟲草菌絲體多糖分離純化的方法
【專利摘要】本發明一種蟲草菌絲體多糖分離純化的方法，屬於生物工程【技術領域】。將蟲草菌絲粉用石油醚脫脂後，95℃熱水回流提取，離心濃縮獲得蟲草菌絲體水提液；再用不同倍數質量分數為95%乙醇分級沉澱，離心收集沉澱，透析，冷凍乾燥，得到不同組分的蟲草菌絲體粗多糖；由離子液體1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽（[Bmim]BF4）和無機磷酸鹽NaH2PO4組成的離子液雙水相體系進行萃取分離，下層無機鹽相透析，濃縮，冷凍乾燥，即得分離純化的蟲草菌絲體多糖。利用本發明製備的蟲草菌絲體多糖能夠最大限度分離純化蟲草菌絲體多糖，既不影響多糖天然結構又能保持其原有生物活性，且本發明的方法方法簡便、成本低、靈活實用，利於推廣、開發和應用。
【專利說明】一種蟲草菌絲體多糖分離純化的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種從冬蟲夏草菌絲體中分離純化蟲草菌絲體多糖的方法，屬於生物工程【技術領域】。
【背景技術】
[0002]冬蟲夏草(Cordyceps sinensis)，又名冬蟲草或夏草冬蟲，是我國特有的一種名貴藥用真菌及傳統的滋補佳品，內含豐富的生物活性物質，具有增強免疫力、抗腫瘤、延緩衰老等功能。目前研究認為，多糖是冬蟲夏草的主要功效成分之一，蟲草多糖除了抗腫瘤和免疫調節活性，又有降血糖血脂和抑制糖尿病作用，抗氧化活性，所以最具開發多種新產品，新用途的潛力。由於天然冬蟲夏草資源有限，價格高昂，無法滿足人們對珍稀蟲草資源的廣泛需求，對蟲草菌人工發酵培養獲取蟲草菌絲體為蟲草的產業化開發提供了可能。人工培養蟲草菌體是以收穫蟲草菌絲體為目標，目前，商業化的蟲草產品主要是蟲草菌絲體膠囊或與其他中藥成分混合的健康產品。
[0003]對於蟲草菌絲體多糖分離純化工藝的研究很多，如乙醇分級沉澱、離子交換色譜、凝膠過濾色譜和膜過濾等。其中，柱層析是分離純化過程中應用最普遍的一種方法，但是純化過程具有耗時長、費用高、產品回收率低、溶劑用量大和操作繁瑣等缺點，限制了蟲草菌絲體多糖的工業化生產和開發。此外，乙醇分級沉澱是一種簡單且行之有效分離純化的方法，但在提取多糖的同時蛋白質也隨之沉澱下來，而且蛋白質含量隨乙醇濃度增加而增加，這為後續多糖純化帶來一定困難。因此，一種高效、快速分離純化蟲草菌絲體多糖的方法顯得尤為重要。
[0004]離子液體雙水相體系綜合了離子液體和雙水相體系的優點，開闢了新的萃取分離體系。與傳統的雙水相體系相比，離子液體雙水相體系分相時間短、黏度低、萃取過程不易乳化且離子液體可以回收利用，這些優點剛好克服了傳統雙水相體系的缺點，廣泛地應用於蛋白質、抗生素、生物鹼、藥物和小分子有機化合物的分離和純化。但是，關於離子液雙水相體系結合常規方法如乙醇分級沉澱、透析等快速分離純化多糖的研究文獻或專利還未見報導。
【發明內容】
[0005]本發明要解決的問題是提供一種蟲草菌絲體多糖分離純化的方法。
[0006]本發明提供蟲草菌絲體多糖分離純化的方法，不影響天然多糖的結構和生物活性，並能作為藥用、食用(保健品)原料。
[0007]本工藝的具體步驟是從液體發酵所得冬蟲夏草菌絲體中通過熱水提取、乙醇分級沉澱獲得不同組分多糖混合物，通過離子液雙水相體系萃取分離，透析，冷凍乾燥，得到蟲草菌絲體多糖。
[0008]一種蟲草菌絲體多糖分離純化的方法，按照下述步驟進行:
(O脫脂:蟲草菌絲粉用石油醚脫脂處理2次，自然晾乾；(2)熱水提取:步驟(I)所得的脫脂後蟲草菌絲粉95°C恆溫水浴中回流提取8h，重複2次，以5000 rpm離心15 min，收集上清液，濃縮，得蟲草菌絲體水提液，4°C冰箱儲存，備用；
(3)乙醇分級沉澱:步驟(2)所得的水提液加入1/5倍質量分數為95%的乙醇沉澱，4°C冰箱靜置過夜，以8000 rpm離心30 min，收集沉澱，蒸餾水透析48 h，冷凍乾燥；離心所得上清液中繼續依次加入1/5、2/5、3/5、1和2倍質量分數為95%的乙醇，重複以上操作，得到不同倍數乙醇沉澱的蟲草菌絲體粗多糖；
(4)離子液雙水相體系萃取分離:步驟(3)所得的蟲草菌絲體粗多糖配成質量濃度為10 mg/mL的水溶液,取1.0 mL加到由1.0 mL 1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽([Bmim]BF4)、1.25 g NaH2P0dP3.0 mL水組成的離子液雙水相體系中，充分振蕩、溶解，25°C恆溫水浴靜置30 min,分尚上下兩相；
(5)透析和冷凍乾燥:下層無機鹽相透析，濃縮，冷凍乾燥，得到白色絮狀蟲草菌絲體多
糖；
(6)離子液體回收:上層離子液相用二氯甲烷萃取，減壓蒸發，回收離子液體[Bmim]
BF4。
[0009]本發明建立蟲草菌絲體多糖分離純化的方法，獲取均一分子量的多糖，成分為葡萄糖、甘露糖和半乳糖，具有免疫調節和抗氧化活性。對進一步研究其化學結構、溶液構象和闡明其藥理活性機制有重要意義。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0010]圖1為I倍體積質量分數為95%乙醇沉澱組分純化得到蟲草菌絲體多糖的GPC-MALLS 色譜圖。
【具體實施方式】
[0011]實施例1:
1.脫脂: 蟲草菌絲粉裝入脫脂布袋中，放入500 mL索氏提取器中，加入石油醚，45°C恆溫水浴脫脂6 h，重複脫脂I次，倒出蟲草菌絲粉，自然晾乾。
[0012]2.熱水提取:步驟I所得的脫脂後蟲草菌絲粉按1:10 (g/L)的料液比加入蒸餾水，充分混勻後，在95°C恆溫水浴中回流提取8 h，重複提取2次。提取結束後，混合物用500 mL塑料離心杯，以5000 rpm, 15 min離心,上清液45°C旋轉蒸發器減壓濃縮,濃縮至原體積的1/3，得到蟲草菌絲體水提液，4°C冰箱儲存，備用。
[0013]3.乙醇分級沉澱:步驟2所得的蟲草菌絲體水提液加入1/5倍預冷的質量分數為95%乙醇沉澱，充分振蕩，4°C冰箱靜置過夜，以8000 rpm, 30 min離心，收集沉澱，溶於水，蒸餾水透析48 h，進一步去除寡糖、無機鹽、單糖、色素等小分子雜質，冷凍乾燥；離心所得上清液繼續依次加入1/5、2/5、3/5、1和2倍質量分數為95%的乙醇，重複以上操作，得到不同倍數95%乙醇沉澱的蟲草菌絲體粗多糖。
[0014]4.離子液雙水相體系萃取分離:步驟3所得的蟲草菌絲體粗多糖溶於水配成質量濃度為10 mg/mL的水溶液，取1.0 mL多糖溶液加到10 mL具刻度試管中，然後加入1.0 mL1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽([Bmim]BF4)、1.25 g無機磷酸鹽NaH2PO4和3.0 mL水，充分振蕩、溶解，25°C恆溫水浴靜置30 min，分離上下兩相。[0015]5.透析和冷凍乾燥:步驟4所得下層無機鹽相加入到截留分子量為8000-12000Da的透析袋中，蒸餾水透析48 h，去除無機磷酸鹽NaH2PO4,透析液45 °C減壓濃縮，冷凍乾燥，得到白色絮狀的蟲草菌絲體多糖純品，經凝膠滲透色譜-多角度雷射光散射(GPC-MALLS)檢測為單一峰(見圖1)，苯酚-硫酸法檢測中性糖含量在96%以上。
[0016] 6.離子液體回收:上層含有蛋白質等雜質的離子液相加入一定體積二氯甲烷，置於分液漏鬥中，充分振蕩，收集二氯甲烷相，45 °C旋轉蒸發器減壓蒸發，得到離子液體[Bmim]BF4。
【權利要求】
1.一種蟲草菌絲體多糖分離純化的方法，其特徵在於按照下述步驟進行: (1)脫脂:蟲草菌絲粉用石油醚脫脂處理2次，自然晾乾； (2)熱水提取； (3)乙醇分級沉澱； (4)離子液雙水相體系萃取分離: (5)透析和冷凍乾燥:下層無機鹽相透析，濃縮，冷凍乾燥，得到白色絮狀蟲草菌絲體多糖； (6)離子液體回收:上層離子液相用二氯甲烷萃取，減壓蒸發，回收離子液體[Bmim]BF4。
2.根據權利要求1所述的一種蟲草菌絲體多糖分離純化的方法，其特徵在於其中步驟(2)熱水提取步驟如下:步驟(1)所得的脫脂後蟲草菌絲粉95°C恆溫水浴中回流提取8h，重複2次，以5000 rpm離心15 min，收集上清液，濃縮，得蟲草菌絲體水提液，4°C冰箱儲存，備用。
3.根據權利要求1所述的一種蟲草菌絲體多糖分離純化的方法，其特徵在於其中步驟(3)乙醇分級沉澱步驟如下:步驟(2)所得的水提液加入1/5倍質量分數為95%的乙醇沉澱，4°C冰箱靜置過夜，以8000 rpm離心30 min，收集沉澱，蒸餾水透析48 h，冷凍乾燥；離心所得上清液中繼續依次加入1/5、2/5、3/5、1和2倍質量分數為95%的乙醇，重複以上操作，得到不同倍數乙醇沉澱的蟲草菌絲體粗多糖。
4.根據權利要求1所述的一種蟲草菌絲體多糖分離純化的方法，其特徵在於其中步驟(4)離子液雙水相體系萃取分離步驟如下:步驟(3)所得的蟲草菌絲體粗多糖配成質量濃度為10 mg/mL的水溶液，取1.0 mL多糖溶液加入到由1.0 mL 1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽([Bmim]BF4)、1.25 g NaH2P0jP3.0 mL水組成的離子液雙水相體系中，充分振蕩、溶解，25°C恆溫水浴靜置30 min，分離上下兩相。
【文檔編號】C08B37/00GK103467618SQ201310434343
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年9月23日 優先權日:2013年9月23日
【發明者】閆景坤, 馬海樂, 唐吉諒, 胡永田 申請人:江蘇大學