誘導白木香產生沉香的3株真菌的製作方法
2023-12-08 17:47:11 1
專利名稱：誘導白木香產生沉香的3株真菌的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物工程技術領域，具體的說是涉及3株真菌，將它們接種在白木香的樹幹或枝幹上，能誘導白木香產生沉香。
背景技術：
2010版《中國藥典》中記載中藥沉香的基源植物為瑞香科(Thymelaeceae)沉香屬(Aquilaria)植物白木香[A. sinensis (Lour. )Gilg.]含樹脂的木材。在我國中藥史上，沉香的藥用價值已經認識很久。李時珍在《本草綱目》中記載「沉香性辛，微溫，無毒，有降氣、調中、清肝之效，為香簾衝動藥。」2010版《中國藥典》記載 沉香的功能與主治為行氣止痛，溫中止嘔，納氣平喘。用於胸腹脹悶疼痛，胃寒嘔吐呃逆，腎虛氣逆喘急。關於沉香的生產和獲取，有多種說法，但遇到的問題基本一致，即白木香結香周期很長，數量很少，品質不一，因此有「25年以下樹齡不結香」的說法，在宋《本草衍義》中「有香者百無一二」的記載。長期的實踐中，勞動人民發現沉香總是存在於白木香受傷和腐朽處，因此，李時珍在《本草綱目》中有「乃膏脈凝出自朽出者」，「乃刀斧伐僕膏脈結凝者」，「乃木朽而結者」和「因蠹隙而結者」的記載。在現在的實際生產中，和傳統手段一樣，仍然主要依靠用刀斧砍傷的辦法來促使白木香結香，比起天然結香，時間大大縮短，但這樣的方法仍然需要數年甚至十多年才能使白木香結香，生產速度慢的問題仍然困擾著沉香的合理使用和醫藥的供應，也致使白木香野生資源的蘊藏量急劇下降。1987年，白木香被列為國家珍稀瀕危三級保護植物，1999年又被國務院批准為國家二級重點保護野生植物。因此，發展快速有效的白木香結香的生產技術顯得尤為迫切。在自然條件下，白木香受到蟲咬、真菌侵染、風吹折枝或人為致傷等隨機因素的誘導，並經過長時間的積累，才有可能形成沉香。科學研究初步發現，某些真菌能夠誘導白木香產生沉香，但是，到目前為止，尚未見有高效誘導活性真菌應用於實際生產中。本專利採用人工接菌技術,將活性真菌接種到白木香樹上,從而提高沉香結香率,縮短沉香的生產周期並提高結香質量。這是用科學的方法生產沉香，提高沉香的產量和質量，滿足醫藥衛生需要、維護人民群眾健康的有效途徑，也是實現野生白木香資源保護和可持續利用的有效途徑之一。
發明內容
本發明的目的在於提供3株能夠誘導白木香產生沉香的真菌，將它們接種在白木香的樹幹或枝幹上，能夠使白木香產生與沉香理化性質相似的黃褐色物質。本發明提供的3株真菌，經鑑定分別為保藏編號為CGMCC No. 4453的小球殼孢屬(Microsphaeropsis sp.)真菌 YNAS-4,保藏編號為 CGMCC No. 4455 的炭角菌屬(Xylariasp.)真菌YNAS-6,和保藏編號為CGMCC No. 4456的毛雙抱屬(Lasiodiplodia sp.)真菌YNAS-S0這3株真菌於2010年12月16日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。保藏單位地址北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所。菌株的保藏和存活證明見附件。3株真菌的培養特性分別為YNAS-4 :在PDA培養基上培養，菌落中央隆起，呈深青綠色，外圍為白色，中央到邊緣顏色由深漸淡，毛狀邊緣，菌絲較發達，為絮狀，無明顯分泌物。將直徑為O. 65cm的菌片接種在PDA培養基上，生長5天菌落直徑為3. 44cm。菌絲有不同直徑的由細變粗的多種形態，最細的菌絲直徑2 μ m,最粗的菌絲直徑5 μ m。細菌絲與粗菌絲相連，粗菌絲是由細菌絲髮展而來的。細菌絲淡色，無隔。粗菌絲呈暗色，菌絲中圓形顆粒內容物清晰可見。不產生分生孢子。YNAS-6 :在PDA培養基上培養，菌落乳白色，中央有均勻的棉絮狀隆起，菌絲的分布是輻射狀條形溝紋，像羽毛狀分布，一層一層由中央向外圍疊放，呈繩索條紋向外輻射，無明顯分泌物。將直徑為O. 65cm的菌片接種在PDA培養基上，生長5天菌落直徑為3. 08cm。菌落質地堅硬，乾燥。培養時間超過6天之後，菌落中央開始變黃，出現黑色斑塊，並出現無色油滴狀分泌物。菌落背面呈繩索輻射狀。菌落長滿後繼續培養，黑白相間放射狀的菌落表面有絨毛狀菌絲團不均勻分布。菌絲直徑3-4μπι，有隔。菌絲由無色透明和淡色兩種色調的間隔組成。不產生分生孢子。YNAS-8 :將直徑為O. 65cm的菌片接種在PDA培養基上，生長2天菌落直徑為4. 82cm ;生長3天菌落長滿直徑9cm的培養皿。培養3天之內，菌落稀疏，呈白色；菌絲絮狀；菌落背面白色，泛黃。培養3天之後，菌絲開始變得發達，菌落顏色由白色漸變成灰色，最後呈黑色。培養時間超過15天後，菌落表面出現黑色油狀分泌物；菌落背面呈黑色。菌絲有粗、細2種。細菌絲直徑約1-2 μ m，淡色。粗菌絲直徑8-10 μ m，暗色。粗菌絲是由細菌絲髮育而來的。菌絲有隔。細菌絲的隔間距較長。粗菌絲的隔間距較短。不產生分生孢子。3株真菌用蕎麥皮培養基培養。蕎麥皮培養基的組成為蕎麥皮、麥麩、玉米粉、硫酸鈣和糖類成分；其中糖類成分為葡萄糖、或果糖、或麥芽糖、或蔗糖、或葡萄糖、果糖、麥芽糖和蔗糖4種糖類成分中的任意兩種或兩種以上以任意比例混合的混合物。蕎麥皮培養基的配製方法為(I)硫酸鈣和糖類成分用水配成混懸液，硫酸鈣的加入量按重量百分比計算為
O.5% -I. 5%，糖類成分的加入量按重量百分比計算為O. 5% -I. 5%。硫酸鈣微溶於水，糖類成分能溶於水。由於它們在配方中的用量較少，採用混懸液的方式加入，可以保證它們在培養基中均勻分散。(2)蕎麥皮、麥麩和玉米粉三種乾料按體積比為1-5 1-3 O. 05-0. I的比例混
合均勻。(3)將含有硫酸鈣和糖類成分的混懸液攪拌均勻，加入蕎麥皮、麥麩和玉米粉混合的乾料中，攪拌，使混合均勻。乾料和混懸液的重量(g)與體積(mL)比為I : O. 8-1. 6。培養基PH自然，測量值一般在7. 5-8. 5之間。試管或罐頭瓶等玻璃器皿，容器裝量20-60%，121°C滅菌 120-180 分鐘。3株真菌的培養方法將3株真菌分別自低溫保藏的斜面試管菌種活化後，轉接於PDA培養基的平皿中，恆溫25°C暗培養。培養至菌落直徑大約3cm左右時，挑取邊緣菌塊，轉接於裝有上述固體培養基的罐頭瓶中，20-28°C暗培養。待菌絲生長充滿培養基約一半時，將培養的固體菌種轉接於新的、相同的培養基中，於相同條件下培養。菌絲長滿培養基後的菌種可以用於接種白木香，誘導白木香產生沉香；也可以作為大規模培養真菌的種子菌種使用。將3株真菌的固體培養物接種於白木香的樹幹或枝幹上，能夠誘導白木香產生沉香。接種的時候，菌株可以分別單獨使用，也可以2株或3株同時使用。當使用混合菌種接種時，先將單獨培養的各菌株的固體培養物以所需要的比例混合均勻，即可用於接種使用。
具體實施例方式實施例I應用真菌YNAS-4誘導白木香產生沉香 (I)固體培養基的製作配製蔗糖和硫酸鈣濃度均為O. 5%的混懸液；將蕎麥皮、麥麩和玉米粉這3種材料按體積比為I : I : O. 05的比例混合均勻；每公斤乾料中加入混懸液I升，攪拌均勻。培養基分裝後，於121°C滅菌165分鐘。(2)菌種的準備挑取經PDA平板活化的YNAS-4菌落邊緣的菌種塊，接種到裝有上述固體基質的罐頭瓶中，於22-24°C暗培養15天。將生長旺盛的真菌菌絲塊再一次轉接到裝有蕎麥皮培養基的罐頭瓶中，於22-24°C暗培養30天，待用。(3)接種孔的準備選取樹齡5年，胸徑> 8cm的白木香樹，在樹幹或枝幹上按照左右間隔5cm，上下間隔8cm的距離，用電鑽或手工打孔器打孔，孔口略向上，直徑為lcm，深約3cm。如果接種前孔周圍植物組織比較乾燥，用無菌水噴灑孔壁，使其保持溼潤。(4)接菌將真菌YNAS-4的培養物用無菌鑷子或小勺接入接種孔中，接種量約為3克，輕輕按壓，保證菌種與開孔周圍植物組織的接觸，但不要將接種物壓得過於緻密。用少量無菌棉覆蓋接種孔口，再用麻繩纏繞固定。以上處理重複3次。結果2個月之後觀察，在接種部位及其周圍有黑褐色物質形成。真菌YNAS-4誘導白木香樹幹或枝幹變色，形成黑褐色物質的範圍(左右寬度，上下寬度)數據見表I。從接種部位周圍取下木料燃燒時，能產生獨特的沉香香味。用手摸變色部位，有油膩的感覺，但不會把手抹黑。將黑褐色部位取出，陰乾，稱重，數據見表I。實施例2應用真菌YNAS-6誘導白木香產生沉香(I)固體培養基的製作配製葡萄糖濃度為I. 2 %，硫酸鈣濃度為I %的混懸液；將蕎麥皮、麥麩和玉米粉這3種材料按體積比為2 1.5 0.07的比例混合均勻；每公斤乾料中加入混懸液O. 8升，攪拌均勻。培養基分裝後，於121°C滅菌140分鐘。(2)菌種的準備挑取經PDA平板活化的YNAS-6菌落邊緣的菌種塊，接種到裝有上述固體基質的罐頭瓶中，於25-28°C暗培養15天。將生長旺盛的真菌菌絲塊再一次轉接到裝有蕎麥皮培養基的罐頭瓶中，於25-28°C暗培養20天，待用。3)接種孔的準備選取樹齡5年以上，胸徑> IOcm的白木香樹，在樹幹或枝幹上按照左右間隔8cm，上下間隔IOcm的距離，用電鑽或手工打孔器打孔，孔口略向上，直徑為
I.5cm,深約5cm。如果接種前孔周圍植物組織比較乾燥，用無菌水噴灑孔壁，使其保持溼潤。4)接菌將真菌YNAS-6的培養物用無菌鑷子或小勺接入接種孔中，接種量約為4克，輕輕按壓，保證菌種與開孔周圍植物組織的接觸，但不要將接種物壓得過於緻密。用少量無菌棉覆蓋接種孔口，再用麻繩纏繞固定。以上處理重複3次。結果2個月之後觀察，在接種部位有黑或黃褐色物質形成。真菌YNAS-6誘導白木香樹幹或枝幹變色，形成黑褐色物質的範圍(左右寬度，上下寬度)數據見表I。從接種部位周圍取下木料燃燒時，能產生獨特的沉香香味。用手摸變色部位，有油膩的感覺，但不會把手抹成黑或黃褐色。將黑褐色部位取出，陰乾，稱重，數據見表I。實施例3應用真菌YNAS-8誘導白木香產生沉香(I)固體培養基的製作配製果糖濃度為O. 5 %，麥芽糖濃度為I %，硫酸鈣濃度為I %的混懸液；將蕎麥皮、麥麩和玉米粉這3種材料按體積比為I : 3 O. I的比例混合均勻；每公斤乾料中加入混懸液I. 6升，攪拌均勻。培養基分裝後，於121°C滅菌180分鐘。
(2)菌種的準備挑取經PDA平板活化的YNAS-8菌落邊緣的菌種塊，接種到裝有上述固體基質的罐頭瓶中，於20-22°C暗培養5天。將生長旺盛的真菌菌絲塊再一次轉接到裝有蕎麥皮培養基的罐頭瓶中，於20-22°C暗培養10天，待用。(3)接種孔的準備選取樹齡5年以上，胸徑> IOcm)的白木香樹，在樹幹或枝幹上按照左右間隔8cm，上下間隔IOcm的距離，用電鑽或手工打孔器打孔，孔口略向上，直徑為2. 0cm，深約5cm。如果接種前孔周圍植物組織比較乾燥，用無菌水噴灑孔壁，使其保持溼潤。(4)接菌將真菌YNAS-8的培養物用無菌鑷子或小勺接入接種孔中，接種量約為5克，輕輕按壓，保證菌種與開孔周圍植物組織的接觸，但不要將接種物壓得過於緻密。用少量無菌棉覆蓋接種孔口，再用麻繩纏繞固定。以上處理重複3次。結果2個月之後觀察，在接種部位及其周圍有黑褐色物質形成。真菌YNAS-8誘導白木香樹幹或枝幹變色，形成黑褐色物質的範圍(左右寬度，上下寬度)數據見表I。從接種部位周圍取下木料燃燒時，能產生獨特的沉香香味。用手摸變色部位，有油膩的感覺，但不會把手抹黑。將黑褐色部位取出，陰乾，稱重，數據見表I。比較例I(I)固體培養基的製作配製果糖、葡萄糖、蔗糖濃度均為O. 5%，硫酸鈣濃度為
I.5%的混懸液；將蕎麥皮、麥麩和玉米粉這3種材料按體積比為3 3 O. I的比例混合均勻；每公斤乾料中加入混懸液I. 2升，攪拌均勻。培養基分裝後，於121°C滅菌120分鐘。(2)接種孔的準備選取樹齡5年以上，胸徑彡IOcm的白木香樹，在樹幹或枝幹上按照左右間隔8cm，上下間隔IOcm的距離，用電鑽或手工打孔器打孔，孔口略向上，直徑為
I.5cm,深約3cm。如果接種前孔周圍植物組織比較乾燥，用無菌水噴灑孔壁，使其保持溼潤。(3)空白處理用少量無菌棉覆蓋接種孔口，再用麻繩纏繞固定。以上處理重複3次。(4)陰性對照處理將滅菌後的蕎麥皮培養基用無菌鑷子或小勺接入接種孔中，接種量約為3克，輕輕按壓，保證培養基與開孔周圍植物組織的接觸，但不要將接種物壓得過於緻密。用少量無菌棉覆蓋接種孔口，再用麻繩纏繞固定。以上處理重複3次。結果2個月之後觀察，空白處理的接種孔周圍變化很小，僅有很小範圍的顏色變化，與周圍組織顏色相比，略微發黃；陰性對照處理的接種孔周圍變化也很小，僅有很小範圍的顏色變化，顏色變黃。從以上2種處理的接種部位周圍取下木料燃燒，氣味不濃。以上2種處理形成的顏色變化的範圍(左右寬度，上下寬度)數據見表I。將顏色變化部位取出，陰乾，稱重，數據見表I比較例2(I)固體培養基的製作配製葡萄糖濃度為O. 5%、蔗糖濃度為1%，硫酸鈣濃度為I. 5%的混懸液；將蕎麥皮、麥麩和玉米粉這3種材料按體積比為5 3 O. I的比例混合均勻；每公斤乾料中加入混懸液I. 4升，攪拌均勻。培養基分裝後，於121°C滅菌150分鐘。(2)菌種的準備分別挑取經PDA平板活化的真菌YNAS-4，YNAS-6和YNAS-8的菌落邊緣的菌種塊，接種到裝有上述固體基質的罐頭瓶中，於22-24°C暗培養至菌絲生長充滿培養基質的1/3-2/3，待用。 (3)接種孔的準備選取樹齡5年以上，胸徑彡IOcm的白木香樹，在樹幹或枝幹上按照左右間隔8cm，上下間隔IOcm的距離，用電鑽或手工打孔器打孔，孔ロ略向上，直徑為I. 5cm,深約5cm。如果接種前孔周圍植物組織比較乾燥，用無菌水噴灑孔壁，使其保持溼潤。(4)接菌將真菌YNAS-4和YNAS-6的培養物按體積比約為I : I的比例混合均勻；將真菌YNAS-4和YNAS-8的培養物按體積比約為2 I的比例混合均勻；將真菌YNAS-6和YNAS-8的培養物按體積比約為I : 3的比例混合均勻；將真菌YNAS-4、YNAS-6和YNAS-8的培養物按體積比約為I : I : I的比例混合均勻；用無菌鑷子或小勺將以上4種混合菌種分別接入接種孔中，接種量約為4-5克，輕輕按壓，保證菌種與開孔周圍植物組織的接觸，但不要將接種物壓得過於緻密。用少量無菌棉覆蓋接種孔ロ，再用麻繩纏繞固定。每種混合菌種分別重複3次。結果2個月之後觀察，在接種部位有黒褐色物質形成。混合菌種誘導白木香樹幹或枝幹變色，形成黒褐色物質的範圍(左右寬度，上下寬度)數據見表I。從接種部位周圍取下木料燃燒時，能產生獨特的沉香香味。用手摸變色部位，有油膩的感覺，但不會把手抹黒。混合接菌比起空白和陰性對照有明顯的優勢。將黑褐色部位取出，陰乾，稱重，數據見表I。表I.白木香接種3種真菌後接種部位周圍形成顏色變化的擴散範圍及擴散部位木材的採收重量
權利要求
1.誘導白木香產生沉香的3株真菌，它們分別是保藏編號為CGMCCNo. 4453的小球殼孢屬(Microsphaeropsis sp.)真菌YNAS-4,保藏編號為CGMCC No. 4455的炭角菌屬(Xylaria sp.)真菌 YNAS-6,和保藏編號為 CGMCC No. 4456 的毛雙抱屬(Lasiodiplodiasp.)真菌 YNAS-8。
2.如權利要求I所述的真菌，其特徵在於3株真菌的固體培養，其培養基組成為蕎麥皮、麥麩、玉米粉、硫酸鈣和糖類成分；其中糖類成分為葡萄糖、或果糖、或麥芽糖、或蔗糖、或葡萄糖、果糖、麥芽糖和蔗糖4種糖類成分中的任意兩種或兩種以上以任意比例混合的混合物； 固體培養基配製方法為 (1)硫酸鈣和糖類成分用水配成混懸液，硫酸鈣的加入量按重量百分比計算為0.5% -I. 5%，糖類成分的加入量按重量百分比計算為0. 5% -I. 5% ; (2)蕎麥皮、麥麩和玉米粉三種乾料按體積比為1-5 1-3 0.05-0. I的比例混合均勻； (3)將含有硫酸鈣和糖類成分的混懸液加入蕎麥皮、麥麩和玉米粉混合的乾料中，攪拌，使混合均勻；乾料和混懸液的重量與體積比為I : 0. 8-1.6。
3.如權利要求I所述的真菌，其特徵在於3株真菌的用途是能接種在白木香上，誘導白木香產生沉香。
4.如權利要求I所述的真菌，其特徵在於3株真菌單獨使用，或3株真菌中的任意2株或2株以上以任意比例混合使用，都能夠誘導白木香產生沉香。
全文摘要
本發明公開了3株真菌，它們分別是保藏編號為CGMCC No.4453的小球殼孢屬(Microsphaeropsis sp.)真菌YNAS-4，保藏編號為CGMCC No.4455的炭角菌屬(Xylaria sp.)真菌YNAS-6和保藏編號為CGMCC No.4456的毛雙孢屬(Lasiodiplodia sp.)真菌YNAS-8。將它們接種到白木香的樹幹或枝幹上，能誘導白木香產生沉香，在提高中藥沉香的產量，保護白木香自然資源等方面有廣闊的應用前景。
文檔編號C12N1/14GK102649939SQ20111004432
公開日2012年8月29日 申請日期2011年2月24日 優先權日2011年2月24日
發明者孟志霞, 崔晉龍, 王春蘭, 郭順星, 陳曉梅 申請人:中國醫學科學院藥用植物研究所