紫花苜蓿胚根直接用於pcr反應的製備方法及其試劑盒的製作方法
2023-12-08 19:40:31 2
紫花苜蓿胚根直接用於pcr反應的製備方法及其試劑盒的製作方法
【專利摘要】本發明主要涉及一種紫花苜蓿胚根直接用於PCR反應的方法。具體涉及紫花苜蓿胚根根尖經鹼處理後，直接作為PCR模板進行SSR反應的方法。一種紫花苜蓿胚根作為PCR模板直接用於SSR反應的方法，其主要特點是包括有：紫花苜蓿胚根根尖經0.25M?NaOH水溶液100℃水浴條件下處理40s，之後加入400μl0.25M?HCl和200μl0.5M?Tris-HCl(pH8.0)，再次100℃沸水中孵育3min，處理過的根尖可直接作為PCR模板進行SSR反應。檢測結果表明，該技術具有靈敏性強、準確率高、重複性強和快速便捷等特點，尤其是在受測群體較大時，此種方法更顯得經濟有效。
【專利說明】紫花苜蓿胚根直接用於PCR反應的製備方法及其試劑盒
【技術領域】
[0001]本發明主要涉及紫花苜蓿PCR反應的方法。具體涉及紫花苜蓿胚根用於PCR反應的製備方法。
【背景技術】
[0002]隨著分子生物學技術的不斷發展，產生了多種基於聚合酶鏈式反應(PolymeraseChain Reaction, PCR)的分子標記技術,如簡單重複序列(Simple Sequence Repeat, SSR)分析等(Vos等,2003 ；Akkaya等，1992 ；Charters等，1996)。目前,分子標記技術已廣泛應用於種屬特異性鑑定、目標基因的追蹤、基因定位和遺傳圖譜繪製等方面。應用這些標記技術的第一步即須提取待測樣品的基因組DNA，確定濃度後，取適量作為模板，進行相應的PCR擴增。常規製備待測樣品基因組DNA的方法程序複雜且工作量大，在運用分子標記進行種內多態性分析時，往往需要檢測大量的群體和單株，更顯得費時費力且成本較高。因此，尋找一種快速、有效、簡便地進行植物DNA擴增的新方法十分必要，雖然國外有文獻報導已在擬南芥等植物中建立起快速、有效的微衛星分析體系(Virk等，1999)，但在主要牧草作物如紫花苜蓿中的快速、簡便、有效的DNA分析體系卻未見報導。
【發明內容】
[0003]本發明的目的 一是避免現有技術的不足，提出一種紫花苜蓿胚根直接用於PCR反應的製備方法。
[0004]本發明的目的二是提供一種紫花苜蓿胚根直接用於PCR反應的試劑盒。
[0005]以便快速、高效的對大量紫花苜蓿群體和單株進行SSR檢測分析。此方法省時省力，操作簡便，在較短時間內能夠完成大量的工作。研究表明，此方法對於隨機選取的15份紫花苜蓿單株樣品都可適用。
[0006]為實現上述目的，本發明採取的技術方案為:一種紫花苜蓿胚根直接用於PCR反應的製備方法，其特徵是包括如下步驟:
[0007]A.紫花苜蓿種子採用雙層濾紙萌發法，在25°C萌發72h，切取l_3mm長胚根根尖備用；
[0008]B.將A步驟中切好的胚根根尖放入含400 μ 10.25Μ NaOH的Eppendorf管中，將此離心管插入100°c沸水中煮40s，取出並加入400 μ 10.25Μ HCl和200 μ 10.5Μ Tris-HClρΗ8.0，再次將該管放入100°C沸水中孵育3min，經過上述鹼處理的紫花苜蓿胚根根尖直接作為PCR模板進行SSR反應。
[0009]一種紫花苜蓿胚根直接用於PCR反應的試劑盒，其特徵是包括有:
[0010]PCR總體積為20μ 1，經步驟A、B處理的紫花苜蓿胚根根尖l_3mm，2XPCRMasterlOy 1，正向引物 SSSR-Fl μ 1，反向引物 SSR-Rl μ 1，ddH208 μ I。
[0011]本發明的有益效果:此方法省時省力，操作簡便，在較短時間內能夠完成大量的工作。檢測結果表明，本發明具有靈敏性強、準確率高、重複性強和快速便捷等特點，尤其是在受測群體較大時，此種方法更顯得經濟有效。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0012]圖1紫花苜蓿胚根根尖。圖中:紫花苜蓿胚根根尖長度約2mm ；
[0013]圖2a顯示以15份紫花苜蓿單株基因組DNA為模板的SSR反應成像效果圖；
[0014]圖2b顯示15份紫花苜蓿以本發明製備的紫花苜蓿胚根根尖為模板的SSR反應成像效果圖；
[0015]圖中:圖2a和圖2b引物均為正向引物SSRl-F和反向引物SSRl-R ;
[0016]圖3a顯示以15份紫花苜蓿單株基因組DNA為模板的SSR反應成像效果圖；
[0017]圖3b顯示15份紫花苜蓿以本發明製備的紫花苜蓿胚根根尖為模板的SSR反應成像效果圖；
[0018]圖中:圖3a和圖3b引物均為正向引物SSR2-F和反向引物SSR2-R，
[0019]圖4a為明場條件下紫花苜蓿胚根根尖經EB染色成像效果；
[0020]圖4b為紫外光條件下紫花苜蓿胚根根尖經EB染色成像效果。
[0021]圖中:CK代表未經鹼處理紫花苜蓿胚根根尖。
【具體實施方式】
[0022]以下結合實施例對本發明的原理和特徵進行描述，所舉實例只用於解釋本發明，並非用於限定本發明的範圍。
[0023]實施例1:一種紫花苜蓿胚根直接用於PCR反應的製備方法，其特徵是包括如下步驟:
[0024]A.紫花苜蓿種子採用雙層濾紙萌發法，在25°C萌發72h，切取l_3mm長胚根根尖備用；
[0025]B.將A步驟中切好的胚根根尖放入含400 μ 10.25Μ NaOH的Eppendorf管中，將此離心管插入100°c沸水中煮40s，取出並加入400 μ 10.25Μ HCl和200 μ 10.5Μ Tris-HClρΗ8.0，再次將該管放入100°C沸水中孵育3min，經過上述鹼處理的紫花苜蓿胚根根尖直接作為PCR模板進行SSR反應。
[0026]實施例2:—種紫花苜蓿胚根直接用於PCR反應的試劑盒，其特徵是包括有:
[0027]PCR總體積為20μ 1，經步驟A、B處理的紫花苜蓿胚根根尖l_3mm，2XPCRMasterlOy 1，正向引物 SSSR-Fl μ 1，反向引物 SSR-Rl μ 1，ddH208 μ I。
[0028]實施例3:—種紫花苜蓿(「美國金皇后」品種，儲存於蘭州大學草地農業科技學院種子庫)胚根根尖作為PCR模板直接用於SSR反應的方法，其包括如下步驟:
[0029]A.紫花苜蓿種子採用雙層濾紙萌發法，25°C萌發72h，切取約2mm長胚根根尖備用，見圖1 ;
[0030]B.將A步驟中切好的胚根根尖放入含400 μ 10.25Μ NaOH的Eppendorf管中，將此離心管插入沸水中煮40s，取出並加入400 μ 10.25Μ HCl和200 μ 10.5Μ Tris_HCl(pH8.0)，再次將該管放入沸水中孵育3min，經過上述鹼處理的紫花苜蓿胚根根尖直接作為PCR模板進行SSR反應。
[0031]C.PCR反應的體系， PCR總體積為20 μ 1，模板為步驟B鹼處理的紫花苜蓿胚根根尖，2XPCR Master (上海生工產品編號:SK2082) 10 μ 1，正向引物SSSR-Fl μ 1，反向引物SSR-Rl μ l，ddH208y I。PCR 方法為:(1)95°C預變性 2min ；(2) 95°C變性 30s ;(3) 55°C退火 30s ； (4) 72°C延伸 30s ; (5) 2 ~4 步驟循環 38 次；(6) 72°C延伸 7min。
[0032]D.PCR產物經聚丙烯醯胺凝膠電泳檢測效果，見圖2和圖3。
[0033]實驗例1:15份紫花苜蓿以單株基因組DNA為模板的SSR反應與以本發明製備的紫花苜蓿胚根根尖為模板的SSR反應效果對比:
[0034]使用正向引物SSRl-F和反向引物SSRl-R對15份紫花苜蓿單株進行SSR反應包括如下步驟:
[0035]正向引物SSRl-F 為:GTCGTAGTAAACGTAAACAAAGAA
[0036]反向引物SSRl-R 為:ACGGCAGGAACAGATCCTTGAA
[0037]此對引物為本發明較佳實施例引物，並不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。
[0038](I).以15份紫花苜蓿(「美國金皇后」品種，儲存於蘭州大學草地農業科技學院種子庫)單株基因組DNA為模板的SSR反應
[0039]提取15份紫花苜蓿單株的基因組DNA，將其濃度稀釋為200ng/μ 1，用作模板，採用正向引物SSRl-F和反向引物SSRl-R進行SSR反應。
[0040]PCR體系為:2XPCR Master (上海生工產品編號:SK2082)10 μ 1，紫花苜蓿基因組DNA 模板 I μ 1，正向引物 SS`Rl-Fly 1，反向引物 SSRl-Rly I, ddH207 y I。PCR 方法為:(1)95°C 預變性 2min ;(2)95°C 變性 30s ; (3)55°C 退火 30s ; (4) 72°C 延伸 30s ；(5)2 ~4 步驟循環38次；(6) 72°C延伸7min。
[0041]PCR產物經聚丙烯醯胺凝膠電泳檢測其效果為:
[0042]圖2a顯示以15份紫花苜蓿單株基因組DNA為模板的電泳條帶清晰明亮。
[0043](2).15份紫花苜蓿(「美國金皇后」品種，儲存於蘭州大學草地農業科技學院種子庫)以本發明製備的紫花苜蓿胚根根尖為模板的SSR反應效果
[0044]將15份紫花苜蓿種子採用雙層濾紙萌發法，25°C萌發72h，切取約2mm長胚根根尖。
[0045]將切好的胚根根尖放入含400 μ 10.25Μ NaOH的Eppendorf管中，將此離心管插入沸水中煮40s，取出並加入400 μ 10.25Μ HCl和200 μ 10.5Μ Tris-HCl (ρΗ8.0)，再次將該管放入沸水中孵育3min，經過上述鹼處理的紫花苜蓿胚根根尖直接作為PCR模板進行SSR反應。
[0046]PCR體系為:2XPCR Master (上海生工產品編號:SK2082)10 μ 1，鹼處理過的紫花苜蓿胚根根尖作為模板，正向引物SSRl-Fl μ 1，反向引物SSRl-Rl μ 1，ddH208 y L.PCR方法為:(1)95°C預變性 2min ;(2)95°C變性 30s ;(3)55°C退火 30s ;(4)72°C延伸 30s ；(5)2~4步驟循環38次；(6) 72°C延伸7min。
[0047]PCR產物經聚丙烯醯胺凝膠電泳檢測其效果為:
[0048]圖2b顯示以15份鹼處理過的紫花苜蓿胚根根尖作為模板的電泳條帶清晰明亮，與圖2a中電泳條帶效果一致。
[0049]實驗例2:15份紫花苜蓿以單株基因組DNA為模板的SSR反應與以本發明製備的紫花苜蓿胚根根尖為模板的SSR反應效果對比:[0050]使用正向引物SSR2-F和反向引物SSR2-R對15份紫花苜蓿單株進行SSR反應包括如下步驟:
[0051 ]正向引物 SSR2-F 為:CCAAACTCAGAACCCTAACCCAA
[0052]反向引物SSR2-R 為:GAACTTGTCAAGACCCATGAAGA
[0053]此對引物為本發明較佳實施例引物，並不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。
[0054](I).以15份紫花苜蓿(「美國金皇后」品種，儲存於蘭州大學草地農業科技學院種子庫)單株基因組DNA為模板的SSR反應:
[0055]提取15份紫花苜蓿單株的基因組DNA，將其濃度稀釋為200ng/μ 1，用作模板，採用正向引物SSR2-F和反向引物SSR2-R進行SSR反應。
[0056]PCR體系為:2XPCR Master (上海生工產品編號:SK2082)10 μ 1，紫花苜蓿基因組DNA模板I μ 1，正向引物引物SSR2-Fly 1，反向引物SSR2-Rly l，ddH207 y I。PCR方法同實驗例I。
[0057]PCR產物經聚丙烯醯胺凝膠電泳檢測其效果為:
[0058]圖3a顯示以15份紫花苜蓿單株基因組DNA為模板的電泳條帶清晰明亮。
[0059](2).以15份本發明製備的紫花苜蓿(「美國金皇后」品種，儲存於蘭州大學草地農業科技學院種子庫)胚根根尖為模板的SSR反應效果
[0060]將15份紫花苜蓿種子採用雙層濾紙萌發法，25°C萌發72h，切取約2mm長胚根根尖。
[0061]紫花苜蓿胚根根尖處理方法同實驗例I。
[0062]PCR體系為:2XPCR Master (上海生工產品編號:SK2082)10 μ 1，鹼處理過的紫花苜蓿胚根根尖作為模板，正向引物SSR2-Fly 1，反向引物SSR2-Rly 1，(ΜΗ208 μ I。PCR方法同(I)。
[0063]PCR產物經聚丙烯醯胺凝膠電泳檢測其效果為:
[0064]圖3b顯示以15份鹼處理過的紫花苜蓿胚根根尖作為模板的電泳條帶清晰明亮，與圖3a中電泳條帶效果一致。
[0065]實驗例3:本發明製備的紫花苜蓿胚根根尖的螢光觀察，包括如下步驟:
[0066]將經過本發明製備的紫花苜蓿胚根根尖和未經鹼處理的對照根尖分別放入
0.05mg/ml的溴乙錠(EB)溶液中，反應30s後，用吸水紙吸去多餘的液體，在紫外燈下進行觀察並拍照。
[0067]圖4a顯示，在明場條件下經過本發明製備的紫花苜蓿胚根根尖和未經鹼處理的對照根尖均能成像。
[0068]圖4b顯示，在紫外光照射條件下經經過本發明製備的紫花苜蓿胚根根尖可以成像，而未經鹼處理的根尖不能成像。表明經本發明製備的紫花苜蓿胚根根尖細胞內的DNA已經析出並與EB結合，在紫外光的照射下發射螢光，進而成像。而未經鹼處理的紫花苜蓿胚根根尖，沒有DNA析出，不能與EB結合，經紫外光照射不能產生螢光，遂不能成像。
[0069]以上所述僅為本發明的較佳實施例，並不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。
【權利要求】
1.一種紫花苜蓿胚根直接用於PCR反應的製備方法，其特徵是包括如下步驟: A.紫花苜蓿種子採用雙層濾紙萌發法，在25°C萌發72h，切取1-3_長胚根根尖備用； B.將A步驟中切好的胚根根尖放入含400μ 10.25Μ NaOH的Eppendorf管中，將此離心管插入1001:沸水中煮408，取出並加入40(^10.25皿 HCl 和 200 μ 10.5Μ Tris-HCl ρΗ8.0,再次將該管放入100°C沸水中孵育3min，經過上述鹼處理的紫花苜蓿胚根根尖直接作為PCR模板進行SSR反應。
2.一種紫花苜蓿胚根直接用於PCR反應的試劑盒，其特徵是包括有: PCR總體積為20 μ 1，經步驟A、B處理的紫花苜蓿胚根根尖l-3mm，2XPCRMasterlOy 1，正向引物 SSSR-Fl μ 1，反向引物 SSR-Rl μ 1，ddH208 μ I。
【文檔編號】C12Q1/68GK103773869SQ201410023097
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2014年1月17日 優先權日:2014年1月17日
【發明者】劉志鵬, 馬利超, 羅棟, 王彥榮, 陳天龍 申請人:蘭州大學