脂肪酶粉末製劑、其製備方法及應用的製作方法

2023-12-08 22:28:46 4

專利名稱：：脂肪酶粉末製劑、其製備方法及應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及可以適合用在各種酯化反應、酯交換反應等中的脂肪酶粉末製劑、以及含有脂肪酸酯和/或脂肪酸的脂肪酶粉末製劑、它們的製備方法、採用這些脂肪酶粉末製劑的酯交換方法等。
背景技術：
：脂肪酶被廣泛應用於脂肪酸等各種羧酸與一元醇或多元醇等醇類的酯化反應、多種羧酸酯間的酯交換反應等中。這其中，酯交換反應作為以動植物油脂類的改性為代表的各種脂肪酸的酯、糖酯或甾醇酯的製備方法，是一種重要的技術。將作為油脂水解酶的脂肪酶用作這些反應的催化劑的話，則可以在室溫至約70。C左右的溫和條件下進行酯交換反應，與以往的化學反應相比，不僅抑制副反應並減少能耗成本，而且由於作為催化劑的脂肪酶是天然物質，因此安全性也高。而且，利用其底物特異性和位置特異性(positionalspecificity),可以有效生產目的物質。然而，即使在酯交換反應中直接使用脂肪酶粉末，活性無法充分表達，而且要使原本水溶性的脂肪酶均勻地分散於油性原料中十分困難，其回收也困難。因此，一直以來一般是通過將脂肪酶固定在某些載體例如陰離子交換樹脂(專利文獻l)、酚醛吸附樹脂(專利文獻2)、疏水性載體(專利文獻3)、陽離子交換樹脂(專利文獻4)、螯合樹脂(專利文獻5)等上，再用於酯化或酯交換反應等中。還提出了固定化脂肪酶顆粒的製備方法，該方法中製備使溶解了脂肪酶和作為脂肪酶載體的物質的水相分散於疏水相而成的乳液，通過從該乳液中除去水，^吏水相變成^皮脂肪酶包^隻的固體顆粒(專利文獻6)。這樣一來，以往將脂肪酶固定之後再用於酯交換反應，^f旦這種固定化脂肪酶由於固定化處理不僅導致原來的脂肪酶活性的損失，而且在使用多孔性載體時，原料或生成物堵塞細孔，結果導致酯交換率降低。而且，以往的使用固定化脂肪酶的酯交換反應中，由於載體所保持的水分被帶入到反應體系中，因此難以避免副反應，例如難以避免油脂類的酯交換反應中生成甘油二酯或甘油單酯等。鑑於這種狀況，現在開發出各種使用粉末脂肪酶的技術。例如，提出了如下方法在惰性有機溶劑的存在下或不存在下，在酯交換反應時，將粉末脂肪酶分散於含有酯的原料中，並使90%以上的分散脂肪酶粉末顆粒的粒徑保持在l~100pm範圍，再進行酯交換反應(專利文獻7)。此外，還提出了採用通過對含有磷脂和脂溶性維生素的酶溶液進行乾燥而獲得的酶粉末(專利文獻8)。然而，仍然需要脂肪酶活性進一步提高的粉末脂肪酶。另一方面，還4是出了一種特徵在於向含酶溶液中添加穀物粉、或添加穀物粉和糖類，再乾燥該含酶溶液的酶固定制劑的製備方法(專利文獻9)。這其中，作為可使用的酶，可例舉脂肪酶、纖維素酶、蛋白酶、澱粉酶和果膠酶，由該製備方法獲得的酶固定制劑雖然能夠抑制酶活性降低物質存在下的酶失活，但對於提高酶活性這一點並沒有記載。而且，其中實際製備的只是將脂肪含量少的脫脂大豆粉應用於纖維素酶或蛋白酶的例子，使用脂肪酶的例子沒有具體記載。專利文獻1:日本特開昭60-98984號/>才艮專利文南大2:曰本淨令開曰召61-202688號7>才艮專利文獻3專利文獻4專利文獻5專利文獻6專利文獻7專利文獻8專利文獻9日本特開平2-138986號公報曰本特開平3-61485號7>才艮曰本淨爭開平l—262795號7>才艮曰本專利第3403202號7^才艮曰本專利第2668187號7>才艮曰本淨爭開2000—106873號7>才艮曰本淨爭開平11_246893號7>淨艮
發明內容本發明的目的在於提供脂肪酶活性得到提高的脂肪酶粉末製劑。本發明的目的還在於提供這些脂肪酶粉末製劑的製備方法。本發明的目的還在於提供使用這些脂肪酶粉末製劑的酯交換方法和酯化方法。本發明是基於以下認識而形成的用脂肪含量高的大豆粉末將特定起源的脂肪酶造粒成粉末，在酯化反應和/或酯交換反應中使用獲得的脂肪酶粉末製劑，則脂肪酶活性顯著提高。也就是說，本發明提供一種脂肪酶粉末製劑，其特徵在於，其是含有米根黴(Rhizopusoryzae)來源和/或德氏才艮酶(Rhizopusdelemar)來源的脂肪酶、以及脂肪含量在5質量％以上的大豆粉末的顆粒物。本發明還提供了一種脂肪酶粉末製劑的製備方法，其特徵在於，對溶解、分散有米根黴來源和/或德氏根酶來源的脂肪酶和脂肪含量在5質量％以上的大豆粉末的水溶液進行乾燥。本發明還提供了一種酯交換物或酯化物的製備方法，其特徵在於，使用上述脂肪酶粉末製劑，對選自於脂肪酸酯、脂肪5酸和醇中的1種以上物質進行酯交換反應或酯化反應。按照本發明，可以提供能高效進行酯交換反應或酯化反應而且可以在反應後回收而再次利用的、酶活性得到顯著提高的脂肪酶粉末製劑。而且，按照本發明，可以獲得在製備面向由於宗教原因或健康原因等無法攝取動物來源的蛋白和油脂的人的食品或食品添加劑中能安全且廉價地使用的脂肪酶粉末製劑。圖l表示使用實施例2(本發明1)中獲得的脂肪酶粉末製劑和脂肪酶粉末製劑時酯交換反應率的經時變化。具體實施例方式本發明使用的脂肪酶可以使用根黴屬的德氏根酶(Rhizopusdelemar),口米才艮零(Rhizopusoryzae)。"f尤選l,3-特異性脂肪酶。這些脂肪酶可以例舉Robin公司的商品PicantaseR8000、AmanoEnzymeInc.的商品脂肪酶F-AP15等，最合適的脂肪酶可以例舉米才艮黴來源的、AmanoEnzymeInc.的商品月旨肪酶DF"Amano"15-K(也稱為脂肪酶D)。該製品是粉末脂肪酶。另夕卜，該脂肪酶DF"Amano，，15-K以前被標記為德氏才艮酶來源。本發明中使用的脂肪酶，可以通過對含有脂肪酶的培養基成分等的含脂肪酶的水溶液進行乾燥而獲得。作為本發明中使用的脂肪含量在5質量％以上的大豆粉末，優選脂肪含量在10質量％以上，更優選15質量％以上，另一方面，優選脂肪含量在25質量％以下的大豆粉末。尤為優選脂肪含量為18~23質量％的大豆粉末。其中，作為脂肪，可以例舉脂肪酸甘油三酯及其類似物。大豆的脂肪含量可以通過索氏提取法等方法容易地測定。本發明中，作為這種大豆粉末，可以使用全脂大豆粉。而且還可以使用豆漿作為大豆粉末的原料。大豆粉末可以通過常規方法將大豆4分石爭來製備，優選其粒徑在O.l~600(am左右。按質量基準計，大豆粉末相對於脂肪酶的使用量優選為0.1~200倍的量，更伊C選為0.1~20倍的量，最優選為0.1-10倍的量。本發明的脂肪酶粉末製劑優選水分含量為IO質量％以下，尤為優選在l~8質量％。本發明的脂肪酶粉末製劑的粒徑可任意，但優選90質量％以上的脂肪酶粉末製劑的粒徑為1~100|am。平均粒徑優選在10~80|im。而且，脂肪酶粉末製劑的形狀優選為球狀。脂肪酶粉末製劑的粒徑可以用例如HORIBA公司的粒度分布測定裝置(LA-500)來測定。本發明的脂肪酶粉末製劑可以通過選自於噴霧乾燥、冷凍乾燥和溶劑沉澱-千燥中的任一種乾燥方法來對溶解、分散有脂肪酶和大豆粉末的水溶液進行千燥從而製備。其中，溶解、分散有脂肪酶和大豆粉末的水溶液，可以通過以下方式獲得，即，使粉末脂肪酶和大豆粉末溶解、分散於水中；或在溶解、分散有大豆粉末的水溶液中混合粉末脂肪酶；或下文描述的在含脂肪酶的水溶液中混合大豆粉末。在使溶解、分散有脂肪酶和大豆粉末的水溶液乾燥的過程中，脂肪酶和/或大豆粉末的顆粒凝聚，形成含有脂肪酶和大豆粉末的顆粒物。該顆粒物可含有脂肪酶的培養基成分。這樣製備的脂肪酶粉末製劑可以直接用於酯交換或酯化。關於溶解、分散有脂肪酶和大豆粉末的水溶液中的水量，相對於脂肪酶和大豆粉末的總質量來調整水的質量。具體是，水的質量相對於脂肪酶和大豆粉末的總質量優選為0.5~l，OOO倍，更優選為1.0~500倍，最優選為3.0~IOO倍。尤其是，通過噴霧乾燥製備脂肪酶粉末製劑時，根據裝置的特性，水的質量相對於脂肪酶和大豆粉末的總質量優選在2.0~1，000倍，更優選2.0500倍，最優選3.0100倍。而且，在使用含脂肪酶的水溶液作為原料時，含脂肪酶的水溶液中的脂肪酶含量不明時，可以通過冷凍乾燥、以及減壓乾燥使含脂肪酶的水溶液粉末化，求出脂肪酶含量，計算出脂肪酶質量。這其中，作為含脂肪酶的水溶液，可以例舉除去了菌體的脂肪酶培養液、精製培養液、使從這些培養液中獲得的脂肪酶再次溶解和分散於水中的溶液、使市售的4分末脂肪酶再次溶解和分散於水中的溶液、市售的液狀脂肪酶等。而且，為了進一步提高脂肪酶活性，更優選除去鹽類等低分子成分，而且，為了進一步提高粉末性狀，更優選除去糖等低分子成分。作為脂肪酶培養液，可以例舉例如含有大豆4分、蛋白腖、玉米漿、K2HP04、(NH4)2S04、MgS04'71120等的水溶液。作為這些物質的濃度，大豆粉為O.l~20質量％,優選為1.0~10質量％,蛋白腖為O.l~30質量％,優選為0.5~IO質量％,玉米漿為O.l~30質量％,優選為0.5~10質量％，K2HP04為0.01~20質量％,優選為0.1~5質量％。而且，(NH4)2S04為0.01~20質量％,優選為0.05~5質量％,MgS04-71120為0.01~20質量％，優選為0.05~5質量％。培養條件可以控制在培養溫度為104(TC，優選為2035。C,通氣量為0.1~2.0VVM,優選為0.1~1.5VVM,攪拌轉速為100~800rpm,優選為200~400rpm,pH為3.0—10.0,優選為4.0~9.5。菌體的分離優選通過離心分離、膜過濾等進行。此外，鹽8類或糖等低分子成分的除去可以通過UF膜處理進行。具體而言，進行UF膜處理，將含有脂肪酶的水溶液濃縮到1/2量的體積後，添加與濃縮液等量的磷酸緩沖液，重複進行15次上述操作，可以獲得除去低分子成分的含脂肪酶的水溶液。離心分離優選控制為20020，000xg，月莫過濾^尤選用MF月莫、通過壓濾機等將壓力控制在3.0kg/m2以下。胞內酶的情況下，優選用勻漿器、韋林氏攪切器(Waringblender)、超聲波破碎、弗氏壓碎器(Frenchpress)、球磨機等進行細胞破碎，通過離心分離、膜過濾等除去細胞殘渣。勻漿器的攪拌轉速為50030，000rpm、優選為1,000~15，000rpm、韋林氏攪切器的轉速為500~10，000rpm、優選為1，000~5，000rpm。攪拌時間為0.5-10分鐘、優選為15分鐘。超聲波破碎在l~50kHz、優選在10~20kHz的條件下進行。5求磨機優選使用直徑O.l~0.5mm左右的玻璃制小^求。在乾燥工序前的中間工序中，可以濃縮含脂肪酶的水溶液。濃縮方法沒有特別限定，可以例舉蒸發、閃蒸、UF膜濃縮、MF膜濃縮、採用無機鹽類的鹽析、採用溶劑的沉澱法、通過離子交換纖維素等的吸附法、採用吸水性凝膠的吸水法等。可優選UF膜濃縮、蒸發。作為UF膜濃縮用組件，優選分級分子量為3,000~IOO，OOO，優選6，000~50，000的平板膜或中空纖維膜，材質優選為聚丙烯腈類、聚碸類等。下面，對作為將溶解、分散有脂肪酶和大豆粉末的水溶液進行乾燥的方法即噴霧乾燥、冷凍乾燥、或溶劑沉澱-乾燥進行說明。噴霧乾燥可以使用例如噴嘴逆流式、圓盤逆流式、噴嘴並流式、圓盤並流式等噴霧乾燥機進行。優選為圓盤並流式，噴霧器轉速優選控制為4,000~20，000rpm、加熱優選控制在入口溫度100200。C、出口溫度40~100°C,以進行噴霧乾燥。尤其是，將含有脂肪酶和大豆粉末的水溶液的溫度調整到20~40°C，然後在70。C~130。C的乾燥氣氛內噴霧。而且，優選在乾燥前預先將水溶液的pH調整到7.5~8.5。冷凍乾燥(freezedrying)優選通過例如實一驗室規模的少量用冷凍乾燥機、板式冷凍乾燥來進行。此外還可以通過減壓乾燥來調製。溶劑沉澱-乾燥方式如下在使用的溶劑中緩緩加入溶解、分散有脂肪酶和大豆粉末的水溶液，使之生成沉澱物，用離心分離機對獲得的沉澱物進行離心分離，回收沉澱後，進行減壓乾燥。為了防止脂肪酶粉末製劑的變性、劣化，一系列操作優選在室溫以下的低溫條件下進行。作為在溶劑沉澱中使用的溶劑，可以例舉例如乙醇、丙酮、曱醇、異丙醇和己烷等水溶性溶劑或親水性溶劑，還可以使用它們的混合溶劑。這其中，為了進一步提高脂肪酶粉末製劑的活性，優選^f吏用乙醇或丙酮。使用的溶劑的量沒有特別限定，但相對於溶解、分散有脂肪酶和大豆^分末的水溶液的體積優選j吏用1~IOO倍體積的溶劑，更優選使用2~IO倍體積的溶劑。而且，在溶劑沉澱後，可以在靜置後通過過濾獲得沉澱物，還可以通過1,000~3，000xg左右的輕度離心分離獲得沉澱物。獲得的沉澱物的乾燥可以通過例如減壓乾燥的方式進行。本發明中，在製備脂肪酶粉末製劑的過程中，還可以再添加脂肪酸酯和/或脂肪酸。具體是，可以使脂肪酸酯和/或脂肪酸與溶解、分散有脂肪酶和大豆粉末的水溶液接觸，然後進行乾燥，從而獲得。通過進行這種脂肪酸酯和/或脂肪酸的接觸，可以進一步提高脂肪酶活性和穩定性。作為使用的脂肪酸酯，可以例舉一元醇或多元醇與脂肪酸所成的脂肪酸酯。多元醇的脂肪酸酯可以是偏酯，也可以是全酉旨(fullester)。其中，作為一元醇，可以例舉烷基一元醇、植物甾醇等甾醇類。構成烷基一元醇的烷基部分優選碳原子數為612的中鏈烷基或碳原子數為13~22的長鏈烷基，可以是飽和的也可以是不飽和的，可以是直鏈也可以是支鏈。作為植物甾醇，優選是例如谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇、巖藻甾醇、菠菜甾醇、菜籽甾醇等。此外，作為多元醇，可以例舉甘油、雙甘油或十甘油等甘油縮合物、丙二醇等二醇類、山梨糖醇等。使用的脂肪酸酯的構成脂肪酸和使用的脂肪酸沒有特別限定，<100式中，C24表示l,2，3-三辛酸甘油酯，C34表示lJ，3-三辛酸甘油酯的1個脂肪酸被替換成油酸後的物質，area為它們的區域面積。基於各時間下的反應率，用分析軟體(originver.6.1)求出反應速率常數k值。脂肪酶粉末製劑的活性是以將酶溶液直接噴霧乾燥時的k值作為IOO,用相對活性表示。結果匯總後示於表l。比專交例1實施例l條件(體積比)脂肪酶溶液脂肪酶溶液豆漿=1:3(pH7.8)相對活性(％)100504根據表l的結果可知，根據本發明，脂肪酶活性大幅提高。實施例2一面攪拌一面在與實施例1中使用的脂肪酶相同的脂肪酶DF"Amano，，15-K的酶溶液(150000U/ml)中添加3倍量的10%脫臭全脂大豆粉(脂肪含量為23質量％、商品名AlphaplusHS-600、NisshinCosmoFoods,Ltd.制)7&;容液，用0.5N的NaOH溶液調整到pH7.8後，進行噴霧乾燥(東京理科器械(抹)公司、SD-1000型)(本發明1)。在脫臭全脂大豆粉水溶液的濃度為io質量％(以下，簡稱為％)、15%(本發明2)、20%(本發明3)下進行比較，結果通過添加10%水溶液，可以獲得酯交換活性最高的粉末。此外，預先對脫臭全脂大豆粉10%溶液進行高壓蒸汽滅菌(121°C、15分鐘)，冷卻到室溫程度後通過上述工序進行粉末化(本發明4)，可以獲得活性更高的酶粉末。結果匯總後示於表2。表2條件(體積比)相對活性(％)本發明1脂肪酶溶液10%HS-600=1:3(pH7.8)409本發明2脂肪酶溶液15%HS-600=1:3(pH7.8)209本發明3月旨肪酶溶液20%HS-600=1:3(pH7.8)227本發明4脂肪酶溶液10%HS-600=1:3(pH7.8)440實施例3研究在與實施例1中使用的脂肪酶相同的脂肪酶DF"Amano"15-K的酵〉容液(150000U/ml)中添力口的大豆4分的種類。大豆粉水溶液的濃度為10%。除了使用美國產大豆粉(商品名OrganicSoyFlour、ArrowheadMills公司制，使用通過攪拌器調整混合液後用紗布等過濾的溶液，脂肪含量為7質量％)或使用脫脂大豆粉末(商17品名SoyaFlourFT-N、NisshinCosmoFoods,Ltd.制、月旨肪含量為0.2質量％、比較例2)以外，其餘與實施例l同樣地製備脂肪酶粉末製劑。所得脂肪酶粉末製劑的脂肪酶活性示於表3。tableseeoriginaldocumentpage18根據表3結果可知，作為大豆粉末，釆用脂肪含量少的脫脂大豆粉末則無法使脂肪酶活性提高。實施例4在牛油樹油精(sheaolein)(商品名Lipex205、Aarhuskarlshamn^^司制)200g中添力口2g實施例2(本發明1)中獲得的脂肪酶粉末製劑，於60。C攪拌20小時進行酯交換反應。經時取樣10)il，用1.5ml己烷稀釋後，過濾粉末酶，將獲得的溶液作為氣相色譜(GC)用試樣。以三醯甘油酉旨(triacylglyceride)組成中的二石更脂醯單油醯甘油酯(SSO和SOS的混合物)的比例作為反應率。同樣地對比較例1中獲得的脂肪酶粉末製劑進行了酯交換反應。其結果，如圖l所示，可知實施例2中獲得的酶的活性明顯高。權利要求1.一種脂肪酶粉末製劑，其特徵在於，其是含有米根黴(Rhizopusoryzae)來源和/或德氏根酶(Rhizopusdelemar)來源的脂肪酶以及脂肪含量在5質量％以上的大豆粉末的顆粒物。2.根據權利要求l所述的脂肪酶粉末製劑，其中，大豆粉末的脂肪含量為10~25質量％。3.根據權利要求1或2所述的脂肪酶粉末製劑，其中，大豆粉末是全脂大豆粉。4.根據權利要求l~3任一項所述的脂肪酶粉末製劑，其中，90質量％以上的脂肪酶4分末製劑的粒徑在l~100|am。5.根據權利要求l~4任一項所述的脂肪酶粉末製劑，其用於酯交換或酯化。6.—種脂肪酶粉末製劑的製備方法，其特徵在於，對溶解、分散有米根黴來源和/或德氏根酶來源的脂肪酶以及脂肪含量在5質量％以上的大豆粉末的水溶液進行乾燥。7.根據權利要求5所述的製備方法，在乾燥前將水溶液的pH調整到7.5~8.5。8.根據權利要求6或7所述的製備方法，通過噴霧乾燥進行乾燥。9.根據權利要求6~8任一項所述的製備方法，在即將噴霧乾燥前，將含有脂肪酶和大豆粉末的水溶液的溫度調整到20~40°C,然後在70。C~13(TC的乾燥氣氛內噴霧。10.—種酯交換物或酯化物的製備方法，其特徵在於，使用權利要求l~5任一項所述的脂肪酶粉末製劑，對選自於脂肪酸酯、脂肪酸和醇中的l種以上物質進行酯交換反應或酯化反應。全文摘要一種脂肪酶粉末製劑，其為含有米根黴(Rhizopusoryzae)來源和/或德氏根酶(Rhizopusdelemar)來源的脂肪酶以及脂肪含量在5質量％以上的大豆粉末的顆粒物。通過製成這種脂肪酶粉末製劑，脂肪酶活性得到提高。文檔編號C12N9/16GK101675159SQ20088001472公開日2010年3月17日申請日期2008年3月12日優先權日2007年3月16日發明者山內良枝,根岸聰,真鍋珠美,鈴木順子申請人:日清奧利友集團株式會社