Hmg1基因及其在家蠶微孢子蟲分子檢測中的應用的製作方法

2023-12-10 01:51:06 1

Hmg1基因及其在家蠶微孢子蟲分子檢測中的應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了家蠶微孢子蟲 HMG1 基因，以及一對特異性的快速檢測家蠶微孢子蟲的引物組及其應用。所述引物組包括上遊引物HMG1-sF和下遊引物HMG1-sR，上遊引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，下遊引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。該檢測引物的靶基因為與家蠶微孢子蟲性別有關的高移動蛋白基因 HMG1 ，以該基因作為家蠶組織特別是蠶卵微孢子蟲分子檢測的靶基因，檢測結果可靠、易於操作、特異性強、靈敏度高，可用於家蠶微孢子蟲高靈敏度快速分子檢測，尤其是蠶種家蠶微孢子蟲的早期檢測，具有重要的實際應用意義。
【專利說明】HMG1基因及其在家蠶微孢子蟲分子檢測中的應用

【技術領域】
[0001]本發明屬於昆蟲病原微生物分子檢測【技術領域】。更具體地，涉及基因及其在家蠶微孢子蟲分子檢測中的應用。

【背景技術】
[0002]家蠶微粒子病(又名家蠶微孢子蟲病)的研宄始於1845年發生在法國的全國流行微粒子病，巴斯德確定他觀察到的「微粒」是微粒子病的成因因素，後來Balbiani確定其為家蠶微孢子蟲bombyci^.V.Maddox等，2000)。家蠶微孢子蟲有水平傳播和垂直傳播兩種傳染途徑，其中垂直傳播對蠶業生產中的蠶種生產造成巨大的危害，同時對絲繭育蠶繭產量和品質帶來很大的負面影響，嚴重影響蠶絲產業鏈下遊經濟的發展(蔡順風等，2011)。自法國全國微粒子病爆發以來，家蠶微孢子蟲始終是各國蠶種生產和進出口貿易的重要檢測對象。19世紀末，在日本養蠶業最發達的時期，《母蛾鏡檢法》、《蠶病預防法》曾被寫入憲法(Takeshi Kawarabata，2003)，我國也將其列為進出口動物檢疫二類疫病[《中華人民共和國進境動物一、二類傳染病、寄生蟲病名錄》，(1992)農(檢疫)字第12號]。
[0003]最初人們判別家蠶微孢子蟲主要根據家蠶微粒子病的發病特點進行肉眼觀察。顯微鏡發明以後，人們根據微孢子蟲的形態和大小進行顯微鏡鏡檢，一定程度上提高了檢測的靈敏度和效率，並因此遏制了法國全國流行的微粒子病，拯救了世界的養蠶業。但是顯微鏡鏡檢有明顯的缺點，如對操作人員的技術及經驗要求較高，而且家蠶微孢子蟲個體及其微小，常用的顯微鏡鏡檢檢測方法特異性和靈敏度較低，難以區分微孢子蟲類似物，特別是蠶卵中的家蠶微孢子蟲一般都是未成熟的孢子，普通光學顯微鏡根本無法鑑別判定等。
[0004]隨著PCR技術的普及，人們開始使用PCR方法來檢測家蠶微孢子蟲並且達到了較高的靈敏度。「分子鐘」是分子水平分析生物系統進化中的有效手段，SSU rRNA (16S rDNA)是微生物進化研宄中常用的「分子鐘」(Pei A Y, et al., 2010)。家蠶微粒子病PCR檢測技術研宄中所設計的引物針對的靶基因多數也是SSUrRNA，針對其他微孢子蟲基因設計的引物較少或靈敏度較差，因而很少被報導。Baker et al (1995)和Terry et al (1999)根據相近種屬微孢子蟲SSU rRNA高度保守區設計的PCR引物Vlf/530r，可鑑別多種種屬的微孢子蟲的DNA模板擴增約450bp的特異目的條帶，但是對家蠶微孢子蟲不具有特異性，而且本發明人研宄發現，使用該引物檢測蠶卵微孢子蟲，檢測的靈敏度極低，暗示蠶卵抽提物中可能存在某種抑制因素幹擾了對家蠶微孢子蟲(N.b)DNA的PCR擴增。另一方面，微孢子蟲寄生於蠶卵中，且蠶卵含量明顯高於要檢測的微孢子蟲，在提取獲得的DNA樣品中，兩者DNA同時存在，家蠶蠶卵DNA對檢測造成嚴重的幹擾，因此，如果想要直接以蠶卵DNA為模板進行微孢子蟲的檢測，對檢測提出了更高的要求。


【發明內容】

[0005]本發明要解決的技術問題是克服現有家蠶微孢子蟲檢測技術的不足，以家蠶微孢子蟲HMG 1基因為靶基因設計檢測引物，該引物可以以家蠶DNA/cDNA、家蠶蠶卵DNA/cDNA或家蠶中腸DNA/cDNA等為模板，並且檢測結果可靠、易於操作(簡單快速)、特異性強、靈敏度高，可用於家蠶微孢子蟲的快速檢測，尤其是侵染早期檢測和蠶卵中家蠶微孢子蟲的快速檢測。
[0006]本發明的目的是提供一種家蠶微孢子蟲基因。
[0007]本發明另一目的是提供一組以家蠶微孢子蟲基因為靶基因、快速檢測家蠶微孢子蟲的引物組及其在製備家蠶微孢子蟲檢測試劑盒方面的應用。
[0008]本發明的再一目的是提供一種家蠶微孢子蟲檢測試劑盒。
[0009]本發明上述目的通過以下技術方案實現:
本發明公開了一種家蠶微孢子蟲邏基因，其DNA全長核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，其cDNA全長核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0010]本發明還提供了一組以M2基因為靶基因的快速檢測家蠶微孢子蟲的引物組，所述引物組包括上遊引物HMGl-sF和下遊引物HMGl-sR，上遊引物HMGl-sF的核苷酸序列如SEQ ID N0.5所示，下遊引物HMGl-sR的核苷酸序列如SEQ ID N0.6所示。
[0011]基於本發明人對家蠶微孢子蟲—2基因的研宄實驗和針對性分析總結，選擇家蠶微孢子蟲基因序列作為本發明PCR檢測的靶基因，所述引物靈敏、快速、特異性高，依據本引物可有效地檢測家蠶微孢子蟲，尤其是對侵染早期的檢測和蠶卵中家蠶微孢子蟲的快速檢測，具有重要的意義。
[0012]本發明還提供所述快速檢測家蠶微孢子蟲的引物組在製備家蠶微孢子蟲檢測試劑盒方面的應用。提供了一種家蠶微孢子蟲檢測試劑盒，包括上遊引物HMGl-sF和下遊引物HMGl-sR，上遊引物HMGl-sF的核苷酸序列如SEQ ID N0.5所示，下遊引物HMGl-sR的核苷酸序列如SEQ ID N0.6所示。
[0013]優選地，所述試劑盒的使用方法如下:
以家蠶DNA/cDNA、家蠶蠶卵DNA/cDNA或家蠶中腸DNA/cDNA為模板，利用引物HMGl-sF和HMGl-sR進行PCR反應，反應結束後凝膠電泳檢測擴增產物，根據擴增DNA片段的大小判定結果。所述判定結果的標準為:瓊脂糖凝膠上出現特異性地684 bp的DNA片段產物，即該家蠶或蠶卵感染了家蠶微孢子蟲。
[0014]優選地，所述PCR反應的反應體系為:
2 X反應緩衝液1yL
ΙΟμΜ 引物 HMGl-sF0.5 μ L
ΙΟμΜ 引物 HMGl-sR0.5 μ L
模板DNAI μ L
ddH20補至 20 μ L ;
其中，2X反應緩衝液的組分為Taq DNA聚合酶，160 mM Tris-HCl,40 mM(NH4)2SO4,3.0 mM MgCl2,400 μ M dNTP。
[0015]優選地，所述PCR 反應的程序為:94°C 5 min ；94°C 30 s，50°C 45 s，72°C 45 s,32 個循環；72°C 10 min。
[0016]本發明具有以下有益效果:
本發明首次克隆了家蠶微孢子蟲HMGmi因的DNA和cDNA全長序列，並在此基礎上，設計獲得了一組特異性、靈敏性非常好的快速檢測家蠶微孢子蟲的引物組，該引物可用於家蠶微孢子蟲病的PCR檢測，能夠準確地判斷樣品是否含有家蠶微孢子蟲，且可為蠶種生產中「有毒」蠶卵(即感染微孢子蟲的蠶卵)的檢測及安全發種提供保證。
[0017]另外，本發明引物及相關試劑可組裝成試劑盒，使用方便。而且適用的PCR擴增模板非常多樣，適用範圍廣，如PCR模板可以是家蠶DNA/cDNA、家蠶蠶卵DNA/cDNA、家蠶中腸DNA /cDNA等，大大增加了檢測對象的範圍。
[0018]重要的是，本發明的檢測引物和試劑盒能夠在家蠶微孢子蟲侵染早期就能夠特異性的檢測出來，而且能夠直接以蠶卵DNA為模板進行家蠶微孢子蟲的快速檢測，為家蠶微孢子蟲病的早期檢測提供了一種簡單快速的方法。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1為HMGIF/ HMGlR引物的檢測結果；泳道:M:DL1000 ;1:有毒蠶卵DNA，2:純化的家蠶微孢子蟲(N.b) DNA, 3:(正常)無毒蠶卵DNA，4:ddH20。
[0020]圖2為HMGl-sF/ HMGl-sR引物的檢測結果；泳道:M:DL1000 ；1:有毒蠶卵DNA, 2:純化的家蠶微孢子蟲(N.b) DNA, 3:(正常)無毒蠶卵DNA，4:ddH20。
[0021]圖3為HMGl-xF/ HMGl-xR引物的檢測結果；泳道:M:DL1000 ；1:有毒蠶卵DNA, 2:純化的家蠶微孢子蟲(N.b) DNA, 3:(正常)無毒蠶卵DNA，4:ddH20。
[0022]圖4為HMGIF/ HMGlR引物的特異性檢測結果；泳道:M:DL1000 ；1:N.b (家蠶微孢子蟲)DNA ；2:N.a (柞蠶微孢子蟲)DNA ；3:N.f (玉米螟微孢子蟲)DNA ；4:水對照。
[0023]圖5為HMGl-sF/ HMGl-sR引物的特異性檢測結果；泳道:M:DL1000 ；1:N.b (家蠶微孢子蟲)DNA ；2:N.a (柞蠶微孢子蟲)DNA ；3:N.f (玉米螟微孢子蟲)DNA ；4:水對照。
[0024]圖6為HMGl-xF/ HMG1-xR引物的特異性檢測結果；泳道:M:DL1000 ；1:N.b (家蠶微孢子蟲)DNA ；2:N.a (柞蠶微孢子蟲)DNA ；3:N.f (玉米螟微孢子蟲)DNA ；4:水對照。
[0025]圖7為HMGIF/ HMGlR引物的靈敏性檢測結果；泳道:M:DL1000 ； 1-7分別為5.0XlO0、5.0X1'5.0X10_2、5.0X10_3、5.0X10_4、5.0X10_5、5.0X10_6 ng/μ L 的 N.bDNA，8為水對照。
[0026]圖8為HMGl-sF/ HMGl-sR引物的靈敏性檢測結果；泳道:M:DL1000 ；1~7分別為5.0XlO0、5.0X1'5.0X10_2、5.0X10_3、5.0X10_4、5.0X10_5、5.0X10_6 ng/μ L 的 N.bDNA，8為水對照。
[0027]圖9為HMGl-xF/ HMG1-xR引物的靈敏性檢測結果；泳道:M:DL1000 ；1~7分別為5.0XlO0、5.0X1'5.0X10_2、5.0X10_3、5.0X10_4、5.0X10_5、5.0X10_6 ng/μ L 的 N.bDNA，8為水對照。

【具體實施方式】
[0028]以下結合說明書附圖和具體實施例來進一步說明本發明，但實施例並不對本發明做任何形式的限定。除非特別說明，本發明採用的試劑、方法和設備為本【技術領域】常規試劑、方法和設備。
[0029]除非特別說明，以下實施例所用試劑和材料均為市購。
[0030]實施例1家蠶微孢子蟲HMG 7基因
1、根據分子生物學的基因克隆技術中基因同源克隆的方法，克隆獲得了家蠶微孢子蟲HMG 2基因的cDNA和DNA全長序列。
[0031]2、cDNA全長的獲得，具體方法如下:
(I)運用Primer premier 5.0軟體，結合綜合分析，設計了引物引物HMGIF/ HMG1R，序列分別如SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示。
[0032]上遊引物HMGlF (SEQ ID N0.3):
5』 ATGACTGCTCAAAAAGACGATAC 3』
下遊引物 HMGlR (SEQ ID N0.4):
5』 TTATTCATCACTATCTCCTACTTCT 3』。
[0033](2)以純化的家蠶微孢子蟲(N.b)孢子DNA為模板，以引物HMGIF/ HMGlR進行PCR擴增。
[0034](3)PCR產物經過純化，連接到pMD19T中，並轉化到E，coli DH- 5α中培養。
[0035](4)提取重組質粒，並測序，獲得邏基因的cDNA全長，如SEQ ID N0.2所示。
[0036]3、DNA全長的獲得
利用基因組高通量測序的方法，並經過大量的基因預測對比分析，最後經PCR測序驗證，獲得了家蠶微孢子蟲HMG 2基因的DNA全長序列，如SEQ ID N0.1所示。
[0037]4、根據測序結果的多次確認，得出家蠶微孢子蟲M 2基因的DNA全長序列，如SEQ ID N0.1所示，其cDNA全長核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0038]實施例2檢測引物設計及PCR擴增方法的建立
1、引物設計
在獲得家蠶微孢子蟲/3私7基因的基礎上，應用Primer premier 5.0軟體設計，設計了多對引物，通過大量的抗藥性、特異性和靈敏性檢測，最終選取了 3對引物有代表性的引物組，各組引物序列如下:
(I)第一對:
上遊引物 HMGlF (SEQ ID N0.3):
5』 ATGACTGCTCAAAAAGACGATAC 3』
下遊引物 HMGlR (SEQ ID N0.4):
5』 TTATTCATCACTATCTCCTACTTCT 3』。
[0039](2)第二對:
上遊引物 HMGl-sF (SEQ ID N0.5):
TTCCGAAATAATCTTCTTTTAATTG
下遊引物 HMGl-sR (SEQ ID N0.6):
TTGTGCACCGAATCGTAAATAG
(3)第三對:
上遊引物 HMGl-xF (SEQ ID N0.7):
TCCCTAGGAACTTTTAAAGAGAAG
下遊引物 HMGl-xR (SEQ ID N0.8):
TCCTTTTATTCATCACTATCTCCT
2、PCR擴增方法的建立
(I)家蠶或家蠶蠶卵的總DNA的提取採用QIAGEN公司生產的植物DNA小提試劑盒(DNeasy Plant mini kit試劑盒)抽提蠶卵基因組DNA，步驟如下(按照說明書進行):
取20粒蠶卵放入研缽中，液氮充分研磨，將研磨後的粉末收集至1.5mL的離心管中。加Λ 400 μ L裂解緩衝液APl和4 uL Rnase Α，渦旋混勻(400 μ L裂解緩衝液APl和4 μ LRnase A勿在使用前混合)；混勻後的溶液，65°C，孵育10 min (期間上下顛倒試管2~3次)；加130 μ L緩衝液ΑΡ2，混合後冰浴5 min ;然後14，000 rpm，離心5 min ;吸取上清於過濾柱(QIAshredder spin column)中的收集管，14，OOOrpm，離心2min ;將離心管中上清液移至新管(勿攪動出現的殘渣)，加入1.5倍體積的AP3/E，移液器混合；將650 yL混合液移至吸附柱(DNeasy Mini spin column)中，4200 rpm，離心I min ;剩下的液體重複此步驟；將吸附柱放入新收集管中，加入500 μ L緩衝液AW，4200 rpm,離心I min ;棄上清；再加入500μ L緩衝液AW，14000 rpm，離心2 min(保證收集管不接觸到底部上清);移收集管至1.5 mL或2 mL離心管中；加入40 μ L緩衝液AE洗脫，室溫放置5 min ；4200 rpm離心I min ;重複上一步(即加入40 μ L緩衝液AE洗脫，室溫放置5 min, 4200 rpm離心I min);將提取好的總DNA置於-20°C冰箱保存備用。
[0040](2) PCR擴增方法
以家蠶或家蠶蠶卵的總DNA為模板，用實施例1所述三對引物進行PCR擴增。
[0041 ] 所述PCR反應體系(總體積20 μ L):
2 X Taq Master Mix (反應緩衝液)1yL
10μ M 上遊引物 HMGlF0.5 μ L
10μ M 下遊引物 HMGlR0.5 μ L
模板 DNAI μ L ；
ddH20補至 20 yLo
[0042]其中，2XTaq Master Mix (反應緩衝液)的組分為Taq DNA聚合酶，160 mMTris-HCl,40 mM(NH4)2SO4, 3.0 mM MgCl2,400 μΜ dNTP。
[0043]PCR 反應的程序為:94°C 5 min ；94°C 30 s，50°C 45 s，72°C 45 s，32 個循環；72°C 10 min。
[0044](3)結果判斷
第一對引物HMG1F/HMG1R:PCR反應結束後進行瓊脂糖凝膠電泳，根據是否擴增到561bp的DNA片段判定蠶卵樣品是否感染了家蠶微孢子蟲。當能特異性地擴增出561 bp的DNA片段產物，即可判斷該家蠶或蠶卵感染了家蠶微孢子蟲。
[0045]第二對引物HMGl-sF/HMGl-sR:PCR反應結束後進行瓊脂糖凝膠電泳，根據是否擴增到684 bp的DNA片段判定蠶卵樣品是否感染了家蠶微孢子蟲。當能特異性地擴增出684bp的DNA片段產物，即可判斷該家蠶或蠶卵感染了家蠶微孢子蟲。
[0046]第三對引物HMGl-xF/HMGl-xR:PCR反應結束後進行瓊脂糖凝膠電泳，根據是否擴增到251 bp的DNA片段判定蠶卵樣品是否感染了家蠶微孢子蟲。當能特異性地擴增出251bp的DNA片段產物，即可判斷該家蠶或蠶卵感染了家蠶微孢子蟲。
[0047](4)分別取50粒「有毒」蠶卵(即感染家蠶微孢子蟲的家蠶所產的蠶卵)、健康蠶卵和純化的家蠶微孢子蟲樣本，分別提取DNA，按照上述的PCR方法進行PCR擴增。
[0048]瓊脂糖凝膠電泳檢測結果分別如附圖1~3所示，三對引物均可在「有毒」蠶卵和純化的家蠶微孢子蟲中檢出特異性的DNA片段，而健康蠶卵中未檢測出特異性片段。表明三對引物和建立的PCR方法均可以很好的用於家蠶微孢子蟲的快速檢測。
[0049]實施例3引物特異性檢測
1、分別以家蠶微孢子蟲(N.b )、柞蠶微孢子蟲(N.a )、玉米螟微孢子蟲(N.f )的DNA為模板，以引物 HMGIF/ HMG1R，HMG1-sF/ HMGl-sR，HMG1-xF/ HMGl-xR，以實施例 2 的方法進行PCR擴增，擴增結束後瓊脂糖凝膠電泳檢測結果。
[0050]2、三對引物的擴增結果分別如附圖4~6所示。結果顯示，只有引物HMGl-sF/HMGl-sR能特異的檢測家蠶微孢子蟲，而引物HMGIF/ HMGlR和引物HMGl-xF/ HMGl-xR均能夠檢測到所有的微孢子蟲，具有很好的通用檢測性，但是不具有對家蠶微孢子蟲的特異性。
[0051]實施例4引物靈敏性檢測
1、提取家蠶微孢子蟲(N.b)的DNA，原始濃度為5.0 ng/ μ L。
[0052]將上述N.b DNA用ddH20進行稀釋，分別稀釋10°、1iUO2UO3UO4UO'16倍。即得到濃度梯度為 5.0Χ10'5.ΟΧΙΟ'5.0Χ10_2、5.0Χ10_3、5.0Χ10_4、5.0Χ10_5、5.0X10—6ng/ μ L0
[0053]2、以上述各濃度的 N.b DNA 為模板，以引物 HMGIF/ HMG1R, HMGl-sF/ HMGl-sR，HMG1-xF/ HMGl-xR,以實施例2的方法進行PCR擴增，擴增結束後瓊脂糖凝膠電泳檢測結果O
[0054]3、三對引物的擴增結果分別如附圖7~9所示。結果顯示，引物HMGIF/ HMGlR和引物HMGl-sF/ HMGl-sR均能檢測到5.0X 10_4 ng/ μ L濃度的N.b DNA,具有很好的檢測靈敏性。而引物HMGl-xF/ HMGl-xR的靈敏性差了 I個數量級，能檢測到5.0X 10_3 ng/μ L濃度的 N.b DNAo
[0055]因此，綜上所述，從特異性和靈敏性的角度考慮，只有引物HMGl-sF/ HMGl-sR既能夠特異性的檢測家蠶微孢子蟲，又具有很好的檢測靈敏性，尤其是檢測蠶卵家蠶微孢子蟲，為蠶種生產中「有毒」蠶種的檢測及安全發種提供了保證，在家蠶微孢子蟲的實際檢測以及早期蠶卵是否感染了家蠶微孢子蟲的檢測應用中具有重要的意義。實驗結果也表明，HMGl基因是一個很好的檢測家蠶微孢子蟲的分子靶標。
【權利要求】
1.一種家蠶微孢子蟲趟似基因，其特徵在於，其DNA全長核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，其cDNA全長核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
2.—組快速檢測家蠶微孢子蟲的引物組，其特徵在於，所述引物組包括上遊引物HMGl-sF和下遊引物HMGl-sR，上遊引物HMGl-sF的核苷酸序列如SEQ ID N0.5所示，下遊引物HMGl-sR的核苷酸序列如SEQ ID N0.6所示。
3.權利要求2所述快速檢測家蠶微孢子蟲的引物組在製備家蠶微孢子蟲檢測試劑盒方面的應用。
4.一種家蠶微孢子蟲檢測試劑盒，其特徵在於，包括上遊引物HMGl-sF和下遊引物HMGl-sR，上遊引物HMGl-sF的核苷酸序列如SEQ ID N0.5所示，下遊引物HMGl-sR的核苷酸序列如SEQ ID N0.6所示。
5.根據權利要求4所述試劑盒，其特徵在於，所述試劑盒的使用方法如下: 以家蠶DNA/cDNA或家蠶蠶卵DNA/cDNA為模板，利用引物HMGl-sF和HMGl-sR進行PCR反應，反應結束後凝膠電泳檢測擴增產物，根據擴增DNA片段的大小判定結果。
6.根據權利要求5所述試劑盒，其特徵在於，所述PCR反應的反應體系為: 2 X反應緩衝液1yL ΙΟμΜ 引物 HMGl-sF0.5 μ L ΙΟμΜ 引物 HMGl-sR0.5 μ L模板DNAI μ L ddH20補至 20 μ L ; 其中，2Χ反應緩衝液的組分為Taq DNA聚合酶，160 mM Tris-HCl, 40 mM(NH4)2SO4, 3.0mM MgCl2,400 μM dNTP。
7.根據權利要求5所述試劑盒，其特徵在於，所述PCR反應的程序為:94°C5 min ；94°C 30 s,50°C 45 s,72°C 45 s，32 個循環；72°C 10 min。
8.根據權利要求5所述試劑盒，其特徵在於，所述判定結果的標準為:瓊脂糖凝膠上出現特異性地684 bp的DNA片段產物，即該家蠶或蠶卵感染了家蠶微孢子蟲。
【文檔編號】C12Q1/68GK104498509SQ201410755670
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年12月11日 優先權日:2014年12月11日
【發明者】劉吉平, 宋小景, 程偉 申請人:華南農業大學