一種優化的小麥轉化方法
2023-12-10 04:33:06 4
專利名稱：一種優化的小麥轉化方法
技術領域：
本發明屬於小麥轉基因領域，涉及一種優化的農桿菌介導的縱切幼苗葉基座轉化小麥的方法。
背景技術：
小麥是總產量佔第二位的糧食作物，在世界各地廣泛種植。隨著世界人口的增長和人們生活水平的提高，人們對小麥的需求量越來越大，對小麥品質的要求也越來越高。常規育種已不能滿足人們對小麥品種和品質的要求。轉基因技術的發展打破了常規育種的種族限制，許多作物比如玉米、油菜等利用轉基因技術已經成功培育出了優質、高效的轉基因新品種。與其他作物相比，小麥的轉基因育種相對滯後，轉基因成功的例子較少，這由於小麥組織培養植株的再生頻率低，建立穩定高效的再生體系比較困難；另一方面，小麥是多倍體作物，基因組大，遺傳背景複雜，遺傳轉化體系不完善。目前，小麥轉基因的方法主要有花粉管通道法、基因槍法、PEG介導法以及農桿菌介導法。花粉管通道法是利用植物授粉後花粉萌發形成的花粉管，將外源DNA導入尚不具備正常細胞壁的卵、合子或早期胚胎細胞中。該方法具有操作簡單、耗費低廉、不需要經過繁瑣的組織培養過程等優點，但是目前該方法尚不成熟，DNA的導入時間和部位往往會影響植株的結實率，最終很難得到轉基因後代。基因槍法是小麥轉基因育種的主要方法，在獲得的小麥轉基因植株的報導中，基因槍法佔了絕大多數，這主要由於該方法不受作物基因型的限制、方法相對簡單，目前基因槍介導的小麥轉化體系已經比較完善。但是基因槍法需要經過複雜的組織培養和植株再生過程，成本花費高、周期長，不利於轉基因小麥的產業化。 PEG法主要是以原生質體為受體的轉化方法，由於小麥的原生質體再生困難，限制了該方法的使用。由於小麥不是農桿菌的天然宿主、穀物類作物對農桿菌沒有傷感反應等原因，農桿菌介導的小麥轉化一直是擺在分子生物學家和育種學家面前的一道難題。後來人們雖然實現了農桿菌介導的小麥轉化，但是受到基因型、組織培養條件、外植體類型、農桿菌菌株等限制，目前農桿菌介導的小麥轉化效率低，需要組織培養和植株再生階段，周期比較長， 不利於產業化的發展。由於農桿菌轉化方法具有易操作、低費用、高效率、插入片段的確定性好、拷貝數低等獨特優點，因此通過研究來提高農桿菌的轉化效率具有主要的意義。本發明提供了一種農桿菌介導的小麥活體轉化方法，除了具有上述農桿菌轉化的通用優點外， 還具有轉化植株存活率高、不需經過複雜的組織培養等優越性，具有很高的實際操作性和市場推廣價值。
發明內容
本發明的目的是提供一種優化的縱切幼苗葉基座轉化小麥的轉基因方法，包括 首先浸泡小麥種子使之吸水飽和，長出下胚軸；將含有目的基因的農桿菌用滲透培養基懸浮；用11號手術刀在小麥的葉基座中間部位縱切致傷。
本發明人經過長時間的探索發現，下胚軸的長度是影響小麥分化的關鍵因素，本發明下胚軸的長度優選為1. 5cm。含有目的基因的農桿菌的獲得，是將目的基因插入表達載體，再將該載體導入農桿菌中。常用的表達載體包括但不限於=PBin系列載體、pBI系列在、Gateway系列載體、 pCAMBIA系列載體；常用的農桿菌菌株包括但不限於AGL0、AGL1、GV3101、EHA105、LBA4404寸。小麥幼苗的致傷位置和方式是影響小麥轉基因效率的另一個重要因素。本發明人經過長期艱苦的實驗發現縱切部位為小麥幼苗的葉基座時轉化效率最高，具體操作為用 11號手術刀的刀尖插入葉基座的中央部位，刀刃向基部方向輕輕斜拉出，縱切傷口長度優選為1.5mm。刀刃不能穿透葉基座。在整個致傷過程中，小麥的幼苗植株是完整的，所以本發明中小麥縱切轉化後植株的生長狀態良好，能夠得到高轉化效率的轉基因後代。本發明所提供的縱切小苗幼苗葉基座轉化小麥的轉基因方法是一種優化的農桿菌介導的活體轉化方法，操作簡便、轉化效率高、不需經過複雜而漫長的組織培養階段、 轉化後小麥生長狀態良好，具有非常大的實際應用價值和市場推廣前景。為了便於理解，下面將結合附圖和實施例進一步詮釋本發明。具體實例和附圖僅是為了更好的闡述本發明， 並不構成對本發明範圍的限制。顯然本領域的普通技術人員可以根據本文說明，在本發明的範圍內對本發明做出各種各樣的修正和改變，這些修正和改變也納入本發明的範圍內。
附圖 1 :pcambial300-bar 的質粒圖譜。
具體實施例方式下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法，具體步驟可參見 《Molecular Cloning: A Laboratory Manual》 (Sambrook， J. ， Russell, David W.， Molecular Cloning: A Laboratory Manual，3rd edition,2001,NY,Cold Spring Harbor)。 所用引物及DNA序列均由上海英駿生物技術有限公司合成。實施例一、縱切幼苗葉原基轉化小麥
1.實驗材料
質粒含有bar基因，帶有潮黴素篩選標記基因的pCambial300-bar載體，具有抗草銨磷除草劑。PCR擴增bar基因連接到pcambial300 (購自hvitrogen公司)載體上得到 pcambial300-bar i^f 本。農桿菌菌株AGLO。供轉化的小麥品種京麥9158
2.農桿菌的培養
挑取甘油凍存的含有目的基因的農桿菌，於YEB平板上畫線，黑暗培養箱培養2 天。挑取單菌落接種於40ml抗性YEB液體培養基中黑暗搖床200rpm搖過夜，至 OD600 1。吸取上述培養物250 300 μ 1塗布於平板直徑為15cm的YEB固體培養基上， 黑暗培養箱培養2天後，此備用的新鮮平板當天使用，約20°C室溫黑暗待用，不要繼續存留於黑暗培養箱或轉存於4°C冰箱。
3.滲透培養基的製備
首先按照下述配方配製AA培養基。AA培養基配製(IL) MgSO40. 12209g KCl 2.95g NaH2PO4 2H20 0. 15g 肌醇 0. Ig 穀氨酸 0.876g
天門冬氨酸 0. 266g 精氨酸0. 174g
酪蛋白水解物 0. 3g 蔗糖20g
鐵鹽溶液5ml ① EDTA-2Na 7. 46g/L 調 pH=8. 0
②再加4. 5ml/L 5M NaCl
③FeSO4 7H20 5. 56g/L
CaCl2 溶液 4. 5ml25.06g/L
VB1 溶液IOmllg/L
VB6 溶液Imllg/L
畑酸溶液Iml0. lg/L
B5 微量ImlMnSO4 H2O 7. 58g/L
ZnSO4 7H20 2. Og/L H3BO33. Og/L
KI0. 75g/L
Na2MoO4 2H20 0. 25g/L
CuSO4 5H20 0. 025g/L
CoCl2 6H20 0. 025g/L
在IL AA培養基中添加下列成分
As (100 200 ii M )； KT (0. 2mg)； 2，4_D (Img)5DTT (ImM )； L-Cysteine (200 400mg) ；silwet-L77 (100 400 ぬ)。
將培養好的農桿菌用上述滲透培養基懸浮，使懸浮菌液的0D_值為0. 4 0. 7，pH至 5. 0 5. 5，轉化滲透培養液製備完畢。4.植株選擇準備
浸泡小麥種子使之吸水飽和後25 0C，14小時光照10小時黑暗，保溼條件下萌發3 4天，每天早晩各清洗一次，至胚軸長至1. 5cm。5.農桿菌菌液浸染小麥幼苗葉基座
(1)幼苗浸泡在上述滲透培養基中，用11號手木刀的刀尖插入葉基座的中央部位， 刀刃向基部方向輕輕斜拉出，縱切傷ロ長度為1. 5mm,不要穿透葉基座，使小麥植株是完整 的；
(2)致傷處理後的小麥幼苗浸沒在滲透培養基中，28°C，24小時黑暗條件下140 170rpm 培養 15 30min ；
(3)侵染後的小麥幼苗在吸水紙上空幹，隨後種入溼潤的蛭石+營養土(2 :1)混合土中，覆土，25 ^°C，M小時黑暗條件下培養2天，然後移栽到大棚中培養。
權利要求
1.一種優化的農桿菌介導的縱切幼苗葉基座轉化小麥的轉基因方法，包括首先浸泡小麥種子使之吸水飽和，長出下胚軸；將含有目的基因的農桿菌用滲透培養基懸浮；用11 號手術刀在小麥的葉基座中間部位縱切致傷。
2.權利要求1所述的小麥轉基因方法，其特徵在於浸泡小麥種子使之吸水飽和，長出下胚軸，下胚軸的長度為1. 5cm。
3.權利要求1所述的小麥轉基因方法，其特徵在於用11號手術刀在小麥的葉基座中間部位縱切致傷口長度為1. 5mm。
全文摘要
本發明提供了供一種優化的縱切幼苗葉基座轉化小麥的轉基因方法，包括首先浸泡小麥種子使之吸水飽和，長出下胚軸；將含有目的基因的農桿菌用滲透培養基懸浮；用11號手術刀在小麥的葉基座中間部位縱切致傷。
文檔編號C12N15/82GK102329814SQ20111010025
公開日2012年1月25日 申請日期2011年4月21日 優先權日2010年12月14日
發明者何峰, 夏勉, 張建新, 張斌 申請人:北京未名凱拓作物設計中心有限公司