一種銅綠假單胞菌的高效富集培養方法與流程
2023-12-02 16:19:16
本發明涉及一種菌種的富集培養方法，特別是涉及一種銅綠假單胞菌的高效富集培養方法。
背景技術：
銅綠假單胞菌是自然界分布最廣泛的細菌之一，廣泛存在於土壤、水、空氣和人體呼吸道及腸道內，是環境汙染和醫學研究中經常使用的代表性菌株。在科研工作中，傳統的銅綠假單胞菌擴大培養方法都是採用搖床震蕩培養，這種培養方式具有以下缺點：1)碳源供應與菌種生長速度不匹配。由於搖床震蕩培養屬於批式培養，營養液一次性加入，這就造成培養初期鞏固由於細菌量較少，碳源供應過量；而在培養後期，細菌大量增長導致碳源不足，致使細菌增殖速度降低甚至停止。
現有技術的搖床震蕩培養採用的培養瓶體積較小(一般250-300ml)，一次性培養出的細菌量非常有限，當細菌需求量較大時往往需要採用多臺搖床和大量培養瓶，培養過程非常繁瑣。
技術實現要素：
本發明的目的是克服現有技術的不足，提供一種銅綠假單胞菌的高效富集培養方法。
本發明的技術方案概述如下：
一種銅綠假單胞菌的高效培養富集方法，包括如下步驟：
1)使用連續培養富集裝置，所述裝置包括高位水箱1和培養富集器2，高位水箱的頂壁內表面設置有紫外滅菌燈3，在高位水箱的頂壁上設置有第一透氣孔4和加料孔10，脫脂棉與第一透氣孔活動連接，所述培養富集器包括培養富集器本體5，培養富集器本體的中上部呈圓筒狀，下部呈漏鬥狀，圓筒狀部分的徑深比為1:3.5-4，培養富集器本體的頂壁上設置有第二透氣孔6和菌種加入口11，脫脂棉與第二透氣孔活動連接，在培養富集器本體圓筒狀部分高的7/8-9/10的位置設置有高液位傳感器，在培養富集器本體圓筒狀部分高的3/5-2/3位置設置有低液位傳感器，在培養富集器本體內部設置有管式超濾膜組件7，管式超濾膜組件的出口通過管道與設置在培養富集器本體外的泵8連接，培養富集器本體的底部設置有濃菌液收集口9，高位水箱的底部通過管道與培養富集器本體的底部的切向進入口連接；高位水箱的底部與培養富集器本體頂部之間的高度差≧2米；高液位傳感器、低液位傳感器、營養液進液閥門12和泵8分別通過導線與自動控制系統連接；
2)用無菌水作溶劑配製含胰蛋白腖、酵母浸粉和氯化鈉的營養液,加入到高位水箱1中；
3)營養液進液閥門12打開，高位水箱中的營養液以流速2-3m/s，以重力流方式切向進入培養富集器本體5中，使營養液形成水力旋流攪拌；將銅綠假單胞菌從菌種加入口11加入到培養富集器本體內，使所述菌株與營養液混合併增殖，當培養富集器本體內液位達到高液位時，營養液進液閥門關閉，控制泵8以膜通量＝15-20L/m2·h的抽吸流速，使銅綠假單胞菌代謝產物和廢棄的營養液一起經管式超濾膜組件後，經泵排出，當培養富集器本體內液位達到低液位時，泵停止；
4)營養液進液閥門打開；高位水箱中的營養液以流速2-3m/s，以重力流方式切向進入培養富集器本體5中，使營養液形成水力旋流攪拌；當培養富集器本體內液位達到高液位時，營養液進液閥門關閉，控制泵8以膜通量＝15-20L/m2·h的抽吸流速，使銅綠假單胞菌代謝產物和廢棄的營養液一起經管式超濾膜組件後，經泵排出，當培養富集器本體內液位達到低液位時，泵停止；
5)重複步驟4)，菌株培養時間優選40-50小時；
6)培養富集後的銅綠假單胞菌被截留在培養富集器本體內並沉積在培養富集器本體漏鬥狀部，經濃菌液收集口9排出並收集。
優選的：營養液中胰蛋白腖的濃度為10g/L、酵母浸粉的濃度為5g/L和氯化鈉的濃度為10g/L。
本發明中碳源(營養液)是連續補入和排出的，保證了培養器內菌株始終處於碳源充足狀態，細菌能夠一直保持高速生長；代謝產物大量累積會抑制細菌活性，本發明及時排出菌代謝產物和廢棄的營養液，不存在代謝產物過度累積問題，細菌能夠一直保持較好的活性和增殖速度；本發明的方法中採用的連續培養富集裝置可以根據需要的細菌量靈活調整，即使細菌量需求較大時一套培養裝置也完全可以滿足需求。
附圖說明
圖1為本發明的方法採用的一種連續培養富集裝置結構示意圖。
圖2為本發明的方法與搖床震蕩培養下銅綠假單胞菌的增殖速度對比。
圖3為本發明的方法與搖床震蕩培養下菌液濃度對比。
具體實施方式
本發明各實施例使用的銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)CGMCC NO：1.10452；購買於：中國普通微生物菌種保藏管理中心；購買時間：2015年12月16日；聯繫方式：010-64807355。
本發明以上述菌株為例，是為了使本領域的技術人員能夠更好地理解本發明，但並不對本發明進行限制，其它的銅綠假單胞菌菌株也可以用於本發明。
下面結合附圖和具體實施例對本發明作進一步的說明。
實施例1
一種銅綠假單胞菌的高效培養富集方法，包括如下步驟：
1)使用連續培養富集裝置，所述裝置包括高位水箱1和培養富集器2，高位水箱的頂壁內表面設置有紫外滅菌燈3，在高位水箱的頂壁上設置有第一透氣孔4和加料孔10，脫脂棉與第一透氣孔活動連接，所述培養富集器包括培養富集器本體5，培養富集器本體的中上部呈圓筒狀，下部呈漏鬥狀，圓筒狀部分的徑深比為1:3.5，培養富集器本體的頂壁上設置有第二透氣孔6和菌種加入口11，脫脂棉與第二透氣孔活動連接，在培養富集器本體圓筒狀部分高的7/8的位置設置有高液位傳感器，在培養富集器本體圓筒狀部分高的2/3位置設置有低液位傳感器，在培養富集器本體內部設置有管式超濾膜組件7，管式超濾膜組件的出口通過管道與設置在培養富集器本體外的泵8連接，培養富集器本體的底部設置有濃菌液收集口9，高位水箱的底部通過管道與培養富集器本體的底部的切向進入口連接；高位水箱的底部與培養富集器本體頂部之間的高度差＝2米；高液位傳感器、低液位傳感器、營養液進液閥門12和泵8分別通過導線與自動控制系統連接；
2)用無菌水作溶劑配製含胰蛋白腖、酵母浸粉和氯化鈉的營養液,加入到高位水箱1中；營養液中胰蛋白腖的濃度為10g/L、酵母浸粉的濃度為5g/L和氯化鈉的濃度為10g/L；
3)營養液進液閥門12打開，高位水箱中的營養液以流速3m/s，以重力流方式切向進入培養富集器本體5中，使營養液形成水力旋流攪拌；將銅綠假單胞菌從菌種加入口11加入到培養富集器本體內，使所述菌株與營養液混合併增殖，當培養富集器本體內液位達到高液位時，營養液進液閥門關閉，控制泵8以膜通量＝20L/m2·h的抽吸流速，使銅綠假單胞菌代謝產物和廢棄的營養液一起經管式超濾膜組件後，經泵排出，當培養富集器本體內液位達到低液位時，泵停止；
4)營養液進液閥門打開；高位水箱中的營養液以流速3m/s，以重力流方式切向進入培養富集器本體5中，使營養液形成水力旋流攪拌；當培養富集器本體內液位達到高液位時，營養液進液閥門關閉，控制泵8以膜通量＝20L/m2·h的抽吸流速，使銅綠假單胞菌代謝產物和廢棄的營養液一起經管式超濾膜組件後，經泵排出，當培養富集器本體內液位達到低液位時，泵停止；
5)重複步驟4)，菌株培養時間40小時；
6)培養富集後的銅綠假單胞菌被截留在培養富集器本體內並沉積在培養富集器本體漏鬥狀部，經濃菌液收集口9排出並收集。
實施例2
一種銅綠假單胞菌的高效培養富集方法，包括如下步驟：
1)使用連續培養富集裝置，除圓筒狀部分的徑深比為1:4；在培養富集器本體圓筒狀部分高的9/10的位置設置有高液位傳感器，在培養富集器本體圓筒狀部分高的3/5位置設置有低液位傳感器，高位水箱的底部與培養富集器本體頂部之間的高度差＝2.5米，其它部分同實施例1的連續培養富集裝置；
2)用無菌水作溶劑配製含胰蛋白腖、酵母浸粉和氯化鈉的營養液,加入到高位水箱1中；營養液中胰蛋白腖的濃度為10g/L、酵母浸粉的濃度為5g/L和氯化鈉的濃度為10g/L；
3)除高位水箱中的營養液的流速2m/s，泵8的膜通量＝15L/m2·h的抽吸流速外，其它同實施例1的步驟3)；
4)除高位水箱中的營養液的流速2m/s，泵8的膜通量＝15L/m2·h的抽吸流速外，其它同實施例1的步驟4)；
5)重複步驟4)，菌株培養時間50小時；
6)培養富集後的銅綠假單胞菌被截留在培養富集器本體內並沉積在培養富集器本體漏鬥狀部，經濃菌液收集口9排出並收集。
對比
取相同菌密度的銅綠假單胞菌(CGMCC NO：1.10452)菌液各5ml，分別加入搖床震蕩培養瓶和實施例1步驟1)的連續培養富集裝置，配製的營養液組分濃度為：胰蛋白腖10g/L，酵母浸粉5g/L，氯化鈉10g/L。
搖床震蕩培養瓶中營養液為一次性加入，兩者均培養40h，
培養期間每隔一段時間以脂磷法同時測定搖床震蕩培養瓶和實施例1步驟(1)中的連續培養富集裝置中銅綠假單胞菌總量，測定結果如圖2所示。
測定結果證明，本發明的培養方法能夠使銅綠假單胞菌在培養期間一直保持著指數增長，而搖床震蕩培養由於後期營養供應不足和代謝產物累積致使菌群很快從指數增長轉為靜止期。
培養40h，以脂磷法同時測定搖床震蕩培養瓶中銅綠假單胞菌總量和實施例1經濃菌液收集口9排出並收集的銅綠假單胞菌總量(見圖3，其中1為搖床震蕩培養獲得的銅綠假單胞菌，2為實施例1方法獲得的銅綠假單胞菌)，經測定，實施例1的方法獲得的銅綠假單胞菌總量是搖床震蕩培養瓶的2.8倍。
通過實驗可以看出，通過本發明可以連續、方便的獲得大量高活性、高濃度的銅綠假單胞菌液。