用於RNAi試劑同時遞送的多啟動子表達盒的製作方法

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專利名稱：用於RNAi試劑同時遞送的多啟動子表達盒的製作方法
用於RNAi試劑同時遞送的多啟動子表達盒本申請是申請日為2005年3月4日、申請號為200580013979. 5、發明名稱為「用於RNAi試劑同時遞送的多啟動子表達盒」的發明專利申請的分案申請。相關申請的交互參考本申請得益於系列號為60/553，920，提交日為2004年3月17日的美國臨時專利申請，以及系列號為60/550，504，提交日為2004年3月5日的美國臨時專利申請，這兩篇文獻在此引用作為參考。
背景技術：
使用雙鏈RNA通過序列特異性的方式來抑制基因表達已經給藥物發現工業帶來了變革。在哺乳動物中，RNA幹擾，或者RNAi，是由19到29的核苷酸長的、雙鏈RNA分子調控的，該雙鏈RNA分子指的是體內細胞中的長雙鏈RNA分子經酶促裂解而衍生出的小幹擾RNA。RNAi試劑可以在細胞外化學或酶學合成並進而遞送到細胞中(參見，例如Fire，等.,Nature, 391 :806-11 (1998) :Tuschl,等.，Genes and Dev. , 13 :3191-97 (1999);和Elbashir,等 ，Nature, 411 :494-498 (2001));或者可以通過細胞內適當的載體在體內表達(參見，例如 McCaffrey,等.Nature Biotech. 21 (6):639-644 (2003))。然而，在人體內遞送未修飾的RNAi以作為有效地治療用途面臨著許多的技術障礙。首先，由於細胞和血清中的核酸酶，注入體內的RNA的半壽期只有大約70秒(參見例如，Kurreck, Eur. T. Bioch. 270 1628-44 (2003))。已經採取了努力通過化學修飾來增加注入RNA的穩定性；然而，已經出現了一些由於化學改變導致毒性效果的增加例子。在一個具體的例子中，細胞無法耐受雙鏈 中每兩個磷酸被硫代磷酸酯替換的RNAi的劑量(Harborth，等.,Antisense Nucleic Acid Drug Rev. 13 (2):83-105 (2003))。其它的障礙包括提供組織特異性遞送，以及能夠遞送足夠引發治療反應但沒有毒性的RNAi試劑劑量。為了 RNAi的遞送已經發現了許多選擇，包括使用可以感染目標細胞，並且在原位遞送和表達RNAi分子的基於病毒的載體系統。一般地,大約70個核苷酸的小RNA從病毒載體骨架上轉錄為短髮夾前體(shRNA)。一旦被轉錄，shRNA被切丁酶(Dicer)加工成為合適的活性RNAi種。基於病毒的遞送途徑試圖開發病毒的靶向屬性以產生組織特異性，一旦正確地靶向定位，便依賴於內源細胞機器以產生足夠的RNAi種水平進而獲得治療有效的劑量。現在，最普遍使用的用於遞送目標序列的病毒是那些基於逆轉錄病毒、單純皰疹病毒(HSV)或者腺病毒(Ad)演化而來的系統。所有這些載體能夠容納相當大的插入並且能夠以治療性相關滴度生產。然而，所有的系統，都有和癌症的發展相關的擔心(Cavazzana-Calvo,等 ，Science, 288 :669-72 (2000)),並且伴隨有不希望的宿主免疫反應且在患者中造成毒性。另外一種可用於遞送RNAi的病毒是腺伴隨病毒(AVV)。RNAi治療的一個有效的應用是作為抗病毒試劑。總的來說，RNA病毒依賴於RNA/DNA依賴的RNA聚合酶來進行複製。這樣的RNA/DNA聚合酶以比較低的嚴謹度複製病毒基因組，其功能性後果是產生了具有異常多數突變的基因組。其結果是具有了迅速演化後代病毒顆粒的能力以逃避一般免疫和化學抗病毒試劑。因此，和已觀察到的小分子治療的效果相似，RNAi治療的相對潛能和效力可能會由於在長期治療過程中的病毒演化而減小。在一例研究中，將表達的shRNA遞送入體內35天之後出現了包含有單一核苷酸變化的HIV逃擗突奪體(Boden,等.，T. Virol. 77 (21) :11531-11535 (2003))。在另一例研究中，在使用預先合成的RNAi轉染的細胞中轉染後僅54小時就能夠檢測到脊髓灰質炎病毒逃避突變體。然而，同時遞送兩種針對病毒中多重目標序列的RNAi能夠顯著地延遲逃避突變體的出現(見 Gitlin，等.,Nature. 418 :430-434 (2002))。因此，本技術領域需要發展穩定、有效的RNAi治療。本發明滿足了本技術領域的這一需要。發明概述本發明涉及用於向靶細胞遞送RNAi種或試劑的創新的組合物和方法。RNAi種是優選通過病毒遞送系統而進行遞送的多啟動子表達構建體的一部分。因為三種或更多的RNAi試劑被用在每個構建體上，本發明可特別有效地用於使用具有變體間序列差異性(SNPs)的靶基因定位生物體，其中每一種導入的RNAi試劑能夠靶向一種或多種的變體亞型。相似地，本發明的組合物和方法也可有效地用於治療由迅速突變的病原導致的疾病，例如由基於RNA的病毒試劑導致的疾病；這就是說，病毒逃避突變體不太可能避開三種或更多的不同RNAi序列的作用。因此，本發明的實施方案提供了一種多啟動子表達盒包括至少三種啟動子/RNAi /終止子組分 ，其中每種啟動子/ RNAi /終止子組分包含啟動子元件、終止子元件和可操作地連接啟動子元件和終止子元件的RNAi種，其中每個RNAi種的序列彼此不相同。在這個實施方案的另一優選方面，在多啟動子表達盒中每個啟動子元件的序列彼此不相同。在這個實施方案的另一方面，在多啟動子表達盒中每個終止子元件的序列彼此不相同和/或每個終止子元件和相應的啟動子元件來自於相同的基因而相互天然成對。另外，在這個實施方案的一方面，本發明提供了一個包含有將治療載體包裝入感染性病毒顆粒的必需元件的多啟動子表達構建體。在本發明的另一個實施方案中，提供了一個處理在一個細胞中表達的一或多個核酸目標的方法，包括將一個表達三個或多個RNAi試劑來抑制一或多個核酸目標的多啟動子RNAi表達盒摻入病毒載體以便製造病毒的RNAi遞送構建體；包裝病毒RNAi遞送構建體入病毒顆粒；遞送該病毒顆粒到細胞；並且表達來自該多啟動子表達盒中三個或多個的RNAi試劑。在本發明這個實施方案的另一方面，所表達的一個或多個的核酸目標是引發或者維持疾病狀態所必需的基因，例如在細胞中的癌症狀態。在本發明這個實施方案的其它方面，所表達的一個或多個的核酸目標是病原體傳染細胞或者維持傳染所必需的基因。或者，多啟動子RNAi表達盒可以非病毒載體提供，並且通過本領域已知的非病毒方法遞送至細胞。附圖簡述為了便於詳細地理解以上所述的本發明的特徵、優點和目的，本發明更詳細的說明書、上面的簡要總結，可以引證在附圖中舉例說明的實施方案。然而，應該注意到，那些


僅僅用於確證本發明的實施方案並因此不能被認為限制了本發明的範圍，因為本發明可以包括其他同樣有效的實施方案。圖1是用於遞送本發明RNAi種的方法的一個實施方案的簡化框圖。
圖2A和2B是代表本發明多啟動子RNAi表達盒的實施方案的示意圖。圖3A和3B顯示了以shRNA前體遞送RNAi試劑的多表達載體的兩個實施方案。圖3C顯示了一個包含插入在啟動子/RNAi/終止子組分之間之填充區域的多表達載體的實施方案。圖3D和3E顯示遞送不帶shRNA前體的RNAi的多啟動子RNAi表達盒的實施方案。圖4A是製造包裝入病毒顆粒中的多啟動子RNAi表達盒的一種方法的簡要示意。圖4B是製造包裝入病毒顆粒中的多啟動子RNAi表達盒的另一種方法的簡要示意。圖5是試驗重組體AAV (rAAV)表達構建體和螢光素酶報告構建體的一個實施方案的示意圖。圖6是根據本發明的一個實施方案的自身互補(scAAV) RNAi表達載體的示意圖。圖7是一個代表性啟動子測試構建體和報告構建體的示意圖。圖8A是顯示本發明描述的實驗中檢測的RNAi試劑位置的HCV基因組的示意圖。SB是包含用於非結構蛋白的遺傳元件的螢 光素酶HCV融合複製子的示意圖。SC是包含用於結構和非結構蛋白的HCV遺傳元件的螢光素酶HCV融合複製子的示意圖。圖9是用於檢驗RNAi試劑的兩個螢光素酶HCV融合報告質粒的示意圖。在左邊的構建體包括一個融合到螢光素酶基因上的IOObp HCV序列；而在右方的構建體包括3個不同的融合到螢光素酶基因上的IOObp HCV序列。靶向至一個包含在該IOObp區域內的序列的RNAi試劑將(如果有效的)降解該HCV螢光素酶轉錄產物，因而降低(也許消除)螢光素酶的表達。圖10是一個顯示出具有用於多種RNAi試劑、啟動子元件和終止子元件的模塊裝配的獨特限制性位點的三重啟動子載體的實施方案之一的圖解說明。圖1lA是在圖3B中顯示的三重啟動子載體的序列(SEQ ID N031)的例子。圖11B/11C是在圖3C中顯示的三重啟動子載體的序列(SEQ ID N032)的例子。圖12顯示在相對光單位(RLU)下測量由靶向至五種不同的HCVlOObp區域的不同的RNAi試劑抑制螢光素酶表達的結果。圖13顯示了表示為抑制百分比值的由不同RNAi試劑抑制螢光素酶表達的結果。圖14顯示了檢驗靶向至來自於HCV5』區域IOObp序列的多個節段的四種不同RNAi試劑之試驗結果的再現性。圖15顯示了針對靶向至來自於HCV5』區域IOObp序列的多個節段的五種不同RNAi試劑在轉染後24小時和48小時的螢光素酶表達抑制百分比的改變。圖16顯示了靶向至HCV5』區域IOObp序列的多個節段的兩個不同RNAi試劑、靶向至HCV3』區域IOObp序列的多個節段五個不同RNAi試劑和祀向至HCV開放讀碼框之外的IOObp序列的節段的RNAi試劑在轉染後44小時和72小時的螢光素酶表達抑制百分比的改變。圖17A和17B顯示了評價三個Pol III啟動子強度的數據。將一個特異針對於熒火蟲螢光素酶mRNA (McCfrey等，2002)的shRNA序列插入至上述Pol III啟動子的控制之下。產物質粒DNA和螢光素酶報告質粒共轉染至Huh7細胞(圖17A)或者293細胞(圖17B)。轉染72小時後測量螢光素酶水平。在來自於圖3B(每個圖區右側的三個構建體)的三重啟動子構建體中顯示出啟動子驅動shRNA。圖18顯示在螢光素酶HCV融合報告質粒試驗分析中不同的SiRNA試劑對螢光素酶表達的抑制。螢光素酶HCV報告質粒和每一種siRNA試劑共轉染至huh7細胞，並且在48小時以後測量螢光素酶活性。圖19顯示針對亞基因組螢光素酶HCV融合複製子的所選siRNA試劑的活性。試驗過的siRNA試劑和痕量的pGL3對照DNA (用於轉染效率的對照)一起轉染至29 E細胞。48小時後測量雷尼利亞(renilla)和突火蟲螢光素酶的水平。圖20顯示了在用包含並具有一或兩個活性的啟動子的啟動子/shRNA盒的質粒共轉染之後來自於螢光素酶HCV報告質粒的螢光素酶信號的抑制百分比。圖21顯示了來自於使用包含一個、兩個或三個活性啟動子/shRNA盒的質粒共轉染之後的包含C12編碼區(頂端)、C-9 (中間的)編碼區、或者5』 6區域(底端)的螢光素酶HCV報告質粒的螢光素酶信號的抑制百分比。發明詳述在描述本發明的組 合物和方法之前，應該理解本發明不局限於所描述的詳細的方法、產品和因素，因為這樣的方法、儀器和製劑當然可以改變。同時也應該理解在這裡使用的術語僅僅是為了描述詳細的實施方案，而並不想限制本發明的範圍，此範圍僅僅由權利要求書所限定。正如在這裡使用的，單數形式的「一」、「 一個」和「這個」包括複數對象，除非上下文清楚地另外規定。因而，例如，所說的〃 一個因素〃是指一個或者多個混合因素，並且所說的生產方法包括那些已經為本領域所公知的等同步驟和方法等等。除非另外有定義的，在這裡使用的所有技術和科學名詞具有和本發明所屬的技術領域中普通技術人員通常所理解的意義。所有提到的出版物在此引用作為參考，沒有任何限制，以用於描述和披露裝置、組成和方法，出版物中這些內容可能於本申請所描述的發明相關。在下面的描述中，闡述了許多細節以對本發明的更徹底的了解。然而，顯而易見地即使沒有這些細節中的一個或多個本領域技術人員也可能實現本發明。在另一方面，本領域技術人員已經熟知的內容就不在這裡描述。本發明涉及利用單一表達構建體同時遞送至少三個不同的RNAi試劑至細胞的創新的、穩定的遺傳組合物和方法。該組分和方法提供對目標核酸的穩定、持續的抑制。一般地，本發明使用了本領域慣用的分子生物學、微生物學、重組DNA技術、細胞生物學和病毒學方法。這樣的技術已經在文獻中充分地闡明，參見,例如ManiaisFritsch&Sambrook,分子克降實駘室指南(1982) :DNA克降實用件方法,卷I和11(D. N. Glover, ed. 1985):寡聚核昔酸合成(M. J. Gait, ed. 1984):核酸雜交(B. D. Hames&S.J. Higgins, eds. (1984)):動物細朐培養(R.1. Freshney, ed. 1986):和 RNA 病毒實用件方法,(Alan, J. Cann, Ed. , Oxford University Press, 2000)。「載體」是一個複製子，例如質粒、噬菌體、病毒構建體或者粘粒，其中可以裝配另外的DNA節段。載體通常用來在細胞中轉化和表達DNA節段。「啟動子」或者「啟動子序列」是一段在細胞中能夠結合RNA聚合酶並啟動轉錄的DNA調節區，轉錄的對象是多核苷酸或者多肽編碼序列諸如信使RNA、核醣體RNAs、核仁RNAs的小核或者由RNA聚合酶1、II或者III任何一種所轉錄的任何種類的RNA。當這樣的核酸已經導入細胞時此細胞就已經被外源的或者異源的核酸或者質粒所「轉化」、「轉導」或者「轉染」，例如，作為一個帶有轉染試劑的複合體或者包裝在病毒顆粒中。該轉化的DNA可能或者不能整合(共價連接)至細胞的基因組中。對於真核細胞而言，穩定轉化的細胞中，轉化DNA已經整合至寄主細胞染色體中或者是維持在染色體外，以便該轉化DNA在細胞複製期間由子細胞繼承或者該轉化DNA是非複製的、分化的細胞其中存在持久的游離基因。術語"RNA幹擾〃或者「RNAi」 一般是指這樣的過程，其中雙鏈RNA分子或者短的髮夾RNA改變了核酸序列的表達，它們具有基本的或者完全的同源性。術語「RNA種」或者「RNAi試劑」是指一段獨特的引發RNAi的RNA序列；並且術語"RNAi表達載體〃是指根據本發明實施方案的包含三個以上RNAi種的載體。圖1是簡化流程圖，它顯示了方法100的步驟，其中可以使用根據本發明的多啟動子RNAi表達構建體。首先，在步驟200中，構造了一個靶向至特定疾病目標的多啟動子RNAi表達盒。其次，在步驟300中，多啟動子RNAi表達盒被連接至適當的病毒遞送構建體中。在步驟400中該病毒RNAi表達遞送構建體繼而被包裝至病毒顆粒中，並且在步驟500中該病毒顆粒被遞送至需要治療的靶細胞中。這些步驟包括的細節和組成在下面詳述。根據本發明的基於病毒的多啟動子RNAi表達構建體可以利用許多的本領域熟知的操作規程通過合成或酶學手段來生產，並且利用標準重組DNA技術來純化，這些技術記載在，例如，sambrook等人,分子克隆實驗室指南第二版，冷泉港出版,冷泉港,NY (1989),和依照在例如美國HHS部，國家健康研究中心(NIH)的關於重組DNA研究指南所描述的規程而進行。在一個優選的實施方案中，該多啟動子RNAi表達盒是利用亞磷醯胺或類似物依照本領域熟知的操作規程合成的。圖2A和2B是根據本發明實施方案的多啟動子RNAi表達盒的簡圖。圖2A顯示了具有三個啟動子/RNAi/終止子組分(顯示在20)的多啟動子表達盒(10)的一個實施方案，並且圖2B顯示具有五個啟動子 /RNAi/終止子組分(顯示在20)的多啟動子表達盒(10)的一個實施方案。P1、P2、P3、P4 和 P5 代表啟動子元件。RNAil、RNAi2、RNAi3、RNAi4 和 RNAi5代表五個不同的RNAi種序列。Tl、T2、T3、T4、和T5代表終止元件。根據本發明的多啟動子RNAi表達盒可以包含三個或多個啟動子/RNAi/終止子組分，其中在任何多啟動子RNAi表達盒包含的啟動子/RNAi/終止子組分的數目受限於，例如，所選擇的遞送系統(例如，一些病毒，諸如AAV，有相對嚴格的大小限制)的包裝大小；細胞毒性，和最大有效量(例如，當四個RNAi序列的表達以用作治療時的有效性和十個RNAi序列表達的效果相同)。在包含有啟動子/RNAi/終止子組分的盒中三個或更多的RNAi種都具有不同的序列；也就是說RNAilRNAi2、RNAi3、RNAi4和RNAi5彼此各不相同。然而，在任意盒中的啟動子元件可能是一樣的(也就是說，例如，兩個或更多的P1、P2、P3、P4和P5的序列可能是一樣的)；任意盒內部的所有的啟動子可彼此各不相同；或者可能有在任一盒內部僅僅出現一次的啟動子元件與出現兩次或者以上的啟動子元件的集合。同樣地，在任一盒中的終止子元件可能是一樣的(也就是說，例如，Tl、T2、T3、T4和T5中兩個或更多的序列可能是一樣的，諸如4或更多T殘基的連續的伸展區)；任一盒內部的所有終止子元件可彼此不同；或者可能有在任一盒內部僅僅出現一次的終止子元件與出現兩次或者以上的終止子元件的集合。優選地，在每一包含任意盒的啟動子/RNAi/終止子組分中的啟動子元件和終止子元件全部不同以減少在組分和/或盒之間發生DNA重組事件的可能性。此外，在一個優選的實施方案中，用於每一啟動子/RNAi/終止子組分的啟動子元件和終止子元件是彼此相匹配的；也就是說，啟動子和終止子取自於它們天然地存在於其中的同一基因。圖3A，3B和3C顯示多啟動子RNAi表達構建體載體，其中包含有可表達短shRNAs的多啟動子RNAi表達盒的選擇性實施方案。shRNAs是短短的雙鏈形式其中有義和反義鏈是由髮夾環連接的。一旦表達，shRNAs被加工成為RNAi種。圖框A、B和C代表三個不同的啟動子元件，並且箭頭標明了轉錄的方向。TERM1、TERM2和TERM3代表三個不同的終止序列，並且shRNA-1、shRNA-2和shRNA_3代表三個不同的shRNA種。在該實施方案中的多啟動子RNAi表達盒從標記為A的圖框中伸出到標記為TERM3的箭頭。圖3A顯示三個啟動子/RNAi終止子組分(20)中的每一個在該盒內都處於同樣的方向上，同時圖3B顯示對shRNA-1和shRNA-2而言啟動子/RNAi/終止子組分在一個方向上，對shRNA_3而言啟動子/RNAi/終止子組分在相反的方向上(例如，轉錄發生在載體的兩條鏈上)。圖3C顯示由DNA區域分隔以增加啟動子/RNAi終止子組分之間的距離的每一種盒。該插入的DNA，被稱為「填充"DNA，可以是在5-5000個核苷酸之間的長度。在啟動子之間可以有一或多個填充片段。對於多重填充片段，它們可以是同樣的或者不同的長度。該填充DNA片段優選地是不同的序列。該填充DNA片段可以用於增加本發明多啟動子盒的大小以便允許它適合於成為相應的遞送載體。該填充片段的長度是由與多啟動子載體相關的特定載體的尺寸需要所規定的。例如，在一個實施方案中填充片段總計長4000核苷酸(nt)以便恰當地滿足AAV載體的大小需要。在另外的實施方案中，填充片段總計2000nt以便恰當地滿足自身互補的AAV載體的大小需要。其它的變體也可以使用。圖3D和3E顯示了多啟動子RNAi表達構建體，其包含有可表達不帶有髮夾環的RNAi種的多啟動子RNAi表達盒的選擇性實施方案。在兩幅圖中，PU P2、P3、P4、P5和P6代表啟動子元件(箭頭標明了轉錄方向)；並且T1、T2、T3、T4、T5和T6代表終止元件。同樣在兩幅圖中，RNAil有義鏈 和RNAil反義鏈(a/s)是互補的，RNAi2有義鏈和RNAi2反義鏈(a/s)是互補的，並且RNAi3有義鏈和RNAi3反義鏈(a/s)是互補的。在圖3D顯示的實施方案中，所有三個RNAi有義序列是從一個鏈轉錄而來(通過PU P2和P3)，同時這三個RNAia/s序列是從互補鏈轉錄而來的(通過P4、P5、P6)。在這一特定的實施方案中，RNAiI a/s (T4)的終止元件落在啟動子Pl和RNAil有義序列之間；而RNAil (Tl)的終止元件落在RNAi la/s序列和它的啟動子P4之間。這些基序是重複的以致於如果圖3D中顯示的頂端鏈稱為(+ )鏈並且底端稱為(_)鏈，元件該從左至右移動將依次遭遇 Pl ( + )、T4 (-),RNAil (有義和 a/s)、Tl (+)、P4 (_)、P2 ( + )、T5 (_)、RNAi2 (有義和 a/s)、T2 ( + )、P5 (_)、P3 ( + )、T6 (_)、RNAi3 (有義和 a/s)、T3 ( + )和 P6 (_)。在圖3E所顯不的另一個實施方案中，所有的RNAi有義和反義序列是從同一鏈轉錄的。對於本領域技術人員而言圖3A到3E所顯示的任意一種多啟動子RNAi表達盒的實施方案都可以用於特定應用，而且也可以是組物或者變體。在一些實施方案中，可以使用強度可變的啟動子。例如，三個或多個的強啟動子(諸如Pol III型啟動子)的使用可能會對細胞造成負擔，通過例如耗盡轉錄所必需的可用的核苷酸或者其它的細胞的組分。此外或另外，數個強啟動子的使用可在細胞中引起RNAi試劑表達的毒性水平。因而在一些實施方案中在多啟動子RNAi表達盒中的一個或多個啟動子可能弱於盒中的其它啟動子，或者這一盒中所有的啟動子可以在低於最高率的水平上表達RNAi試劑。啟動子也可以被或者不被分子技術進行修飾,或者相反,例如,通過調控元件獲得較弱的水平的轉錄。啟動子可以是組織特異性的或者細胞特異性的。術語「組織特異性的」應用於啟動子時是指啟動子能夠指導目標核苷酸序列向特定類型組織(例如肝臟)進行選擇性表達，而另一方面在另一種特定類型組織(例如腦)中缺少同樣的目標核苷酸序列的表達。這樣的組織特異性啟動子包括諸如Ick、肌細胞生成素或者thyl。術語〃細胞特異性〃應用於啟動子時是指啟動子能夠指導目標核苷酸序列在特定類型的細胞中的選擇性表達，而另一方面在同一組織內的另一種特定類型細胞中缺少同樣的目標核苷酸序列的表達(參見，例如，Higashibata,等.，.T. Bone Miner. Res. Tanl9 (1):78-88 (2004) Hoggatt,等.，Circ.Res. , Dec. 91 (12) :1151-59 (2002) ;Sohal，等.，Circ. Res. Tu189 (1):20-25 (2001);和Zhang,等.，Genome Res. Tan 14 (1):79-89 (2004))。術語「細胞特異性」用於啟動子時也指啟動子能夠促進目標核苷酸序列在單一組織內部的一個區域內的選擇性表達。另外地，啟動子是組成型的和可調控的。另外，啟動子可以被修飾以便具有不同的特異性。術語「組成型」用於啟動子時是指該啟動子在缺乏刺激的條件下(例如、熱休克、化學的、光等等)仍能夠指導一段可操作性連接的核酸序列的轉錄。一般地，組成型啟動子能夠指導基本上任意細胞和組織的編碼序列的表達。用於轉錄RNAi種的啟動子優選的是組成型啟動子，諸如針對泛素、CMV、^肌動蛋白、組蛋白H4、EF-1alfa或pgk基因的啟動子，其由RNA聚合酶II控制，或者由RNA聚合酶I控制的啟動子元件。在優選的實施方案中，使用由RNA聚合酶III控制的啟動子元件，諸如U6啟動子(U6-l、U6-8、U6-9等)、H1啟動子、7SL 啟動子、人類 Y 啟動子(hYl、hY3、hY4 (參見 Maraia,等，Nucleic Acids Res22
(15):3045-52 (1994))、和 hY5 ((參見 Maraia,等.，Nucleic Acids Res24 (18) :3552-59(1994))、人類MRP-7-2啟動子、腺病毒VAl啟動子、人類tRNA啟動子、5s核糖體RNA啟動子、和上述任意啟動子的功能性雜交和組合。另外地在一些實施方案中，也許優選那些允許RNAi種誘導型表達的啟動子。本領域已經熟知許多用於誘導型表達的系統使用這樣的啟動子，包括然而並非限於四環素應答的系統和Iac操縱子-阻遏子體系(參見W003/022052A1 ;和US2002/0162126A1 )，蛻皮激素調節體系，或者由糖皮質激素、孕酮、雌激素、RU-486、留體、甲狀腺激素、環腺苷酸、細胞因子、鈣化醇族的調控子、或者金屬硫因啟動子(由無機的金屬調節)調節的啟動子。一或多個增強子也可能存在於該病毒多啟動子RNAi表達構建體中以增加目標基因的表達。適合於在本發明實施方案使用的增強子包括那些最近已經描述的Apo E HCR增強子、CMV增強子(參見，Xia等，Nucleic Acids Res31~17 (2003))，及其它本領域熟知的增強子。在本發明的一個實施方案中，ApoE增強子元件可以被加到本發明的多啟動子盒上。ApoE增強子是一大約155個鹼基對(bp)的來源於載脂蛋白E或者ApoE的增強子元件。一或多個拷貝的ApoE增強子可以加在本發明的多啟動子盒的第一個、第二個和/或第三啟動子的上遊或者下遊(或者超過三個啟動子的上遊或者下遊)。ApoE是載脂蛋白，可以調控脂蛋白粒子的結合、內化作用和降解代謝並且是針對低密度脂蛋白(ApoB/E)受體和針對肝組織ApoE受體的配基。與ApoE 基因相關的遺傳增強子是真核的控制元件，可以增加肝臟特異性核酸的轉錄。ApoE增強子可能位於肝臟特異性啟動子上遊或者下遊2000核苷酸的位置，並且可能存在一或多個拷貝。由本發明的多啟動子RNAi表達盒編碼的RNAi序列導致小幹擾性RNAs(也就是說在哺乳動物細胞沒有毒性的短的、雙鏈RNAs)的表達。只要它們沒有顯示細胞毒性，本發明的RNAi種的長度沒有特定限制的。RNAi可以是，例如，15到49bp長度，優選的15到35bp長度，並且更優選的19到29bp長度。RNAis的雙鏈RNA部分可以完全的同源，或者由於序列錯配(在每一鏈上的相應核苷酸不是互補的)、凸出(一個鏈上缺少相應的互補核苷酸)等等而導致可能包含非配對部分。這樣的非配對部分在它們沒有顯著地與RNAi形成或者發揮功效相牴觸的前提下是可以容忍的。只要RNAi能有效地沉默目標基因，根據本發明的RNAi種的終點可以是平端或者粘端(懸臂式的)。粘端(懸臂式的)的末端結構並不僅僅限制於3』懸臂，但是只要產物RNAi能夠誘導RNAi效果，5』懸臂式的結構可以包括在內。另外，懸臂式核苷酸數目可以是任何數量只要產物RNAi能夠誘導RNAi效果。例如，如果有的話，懸臂可能由I到8個核苷酸組成；優選地它由2到4個核苷酸組成。本發明使用的的RNAi種可以具有莖-環結構前體(shRNA)其中雙鏈RNA的末端由單連結頭RNA所連接。shRNA的單鏈環部分的長度可以是5到20bp，並且優選的是5到9bp。任意一個轉錄的核酸序列可以是針對本發明多啟動子RNAi表達盒的靶目標。針對該RNAi的可能靶目標是這樣的基因，例如然而並非限於發育性基因(例如，粘著分子、細胞周期蛋白激酶抑制劑、fct家族成員、Pax家族成員、翼狀螺旋家族成員、細胞因子/淋巴因子和它們的受體、生長/分化因子和它們的受體、神經介質和它們的受體)；腫瘤基因(例如 ABLl、BCLl BCL2、BCL6、CBFA2、CBL、CSFl R、ERBA、ERBB, EBRB2、ETSl、ETSl、ETV6、FGR、FOS、FYN、HCR、HRAS, JUN, KRAS, LCK、LYN、MDM2、MLL、MYB、MYC、MYCLU MYCN, NRAS, PIMUPML、RET、SRC、TAL1 、TCL3 和 YES);腫瘤抑制基因(例如 APC，BRCAl，BRCA2，MADH4, MCC, NFl，NF2，RBl，TP53，和WTl);和酶(例如ACC合酶和氧化酶、ACP去飽和酶和羥化酶、、ADP-葡萄糖焦磷酸化酶、ATPases、乙醇脫氫酶、澱粉酶、澱粉葡糖苷酶、過氧化氫酶、纖維素酶、查耳酮合酶、殼多糖酶、環加氧酶、脫羧酶、糊精酶、DNA和RNA聚合酶、半乳糖苷酶、葡聚糖酶、葡萄糖氧化酶、顆粒結合澱粉合酶、GTPase、解旋酶、半纖維素酶、整合酶、菊粉酶、轉化酶、異構酶、激酶、乳糖酶、脂肪酶、脂氧合酶、溶菌酶、胭脂鹼合酶、章魚鹼合酶、果膠酯酶、過氧化物酶、磷酸酶、磷脂酶、磷酸化酶、肌醇六磷酸酶、植物生長調節劑合酶、多聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶和肽酶、支鏈澱粉酶、重組酶、逆轉錄酶、RUBISC0、拓撲異構酶、和木聚糖酶)；病毒的結構基因諸如殼體和包膜蛋白質；細菌的基因諸如那些涉及複製或者結構特徵，或者來自其它的病原體的涉及複製或者結構特徵的基因；另外，本發明的多啟動子RNAi表達盒可以用於靶向至特異性序列，所述特異性序列是在常染色體支配的疾病(諸如SCA)中導致病狀等位基因，導致Huntington病變的等位基因，或者導致成骨不全的膠原基因等位基因所特有的。本發明的一個重要的方面是由siRNA清除的病毒感染不會導致對感染細胞的任何傷害(Gitlin,等.Nature418 :430-434 (2002))。本發明的這個特徵區別於現有技術中的方法，其中清除來自於哺乳動物宿主病毒會在免疫系統或者由病毒引起的細胞凋亡的作用下導致受感染細胞的破壞(Guidotti等.Annu. Rev.1mmunol. 19 :65_91(2001))。因而本發明的這個方面提供了一個有效的RNAi試劑可在非細胞致病條件下清除病毒。
以靶向靶目標核酸序列的遺傳序列為基礎選擇RNAi種的序列；並且優選的以靶目標核酸序列保守區域為基準。例如，選擇針對治療病毒感染或者針對構建RNAi疫苗的RNAi序列時，優選的序列是那些在該病毒種間甚至亞種之間保守的序列。如本領域所公知病毒變異很快，保守序列的選擇要儘可能在一段時間內保留RNAi的功效。在選擇RNAi序列以治療癌症或者其它的疾病時，優選的序列是那些在基因或者腫瘤基因變體之間保守的序列。本領域已經熟知用於序列同源性比對和RNAi序列選擇的方法。兩個或更多序列之間同一性百分比的確定可以通過數學算法完成。優選的，非限制性的例子是Myers和Miller的算法(1988) ；Pearson和Lipman的搜索相似性方法(1988)；以及Karlin和Altschul的算法(1993)。優選的，使用計算機執行這些數學算法。這樣的例子包括但是不局限於個人計算機上的CLUSTAL基因程序(可以從Intelligenetics, Mountain View,Calif 中獲得 );ALIGN程序(版本 2. 0)、GAP、BESTFIT、FASTA，Megalign、(使用 Jotun Hein,Martinez,Needleman-Wunsch 算法)，DNAStar Lasergene (seewww. dnastar. com)和威斯康星遺傳學軟體包中的 TFASTA,版本 8(可以從 Genetics Computer Group(gcg), 575ScienceDrive Madison Wis. , USA中獲得)。使用這個程序的同源比對可以使用預設參數或者操作員選擇的參數來執行。CLUSTAL程序已經由Higgins詳細描述過。ALIGN程序以邁爾和Miller的為基準；並且BLAST程序以Karlin和Altschul的算法為基準；執行BLAST分析的軟體可通過 the National Center for Biotechnology Information 獲得(http ://www.ncb1. nim. nih. gov/)。為了進行序列比對，一個序列作為基準序列，待檢驗序列與其進行比對。在使用一個序列比對算法時，待檢驗和基準序列輸入電腦，如有必要指定子序列坐標，並且指定序列算法程序參數。接著，以指定的程序參數為基準，序列比較算法計算待檢驗序列(S)相對於基準序列的序列同一性百分率。

一般地被RNAi抑制的目標序列需要在目標序列和RNAi分子有義鏈之間很高的序列同源性。在一些實施方案中，這樣的同源性高於大約70%，並且可以是高於大約75%。優選地，同源性高於大約80%，並且高於大約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。在使用多啟動子RNAi表達構建體靶向病毒感染的實施方案中，病毒不同的亞種基因組一一甚至在保守的區域一一之間15到30個連續的核苷酸序列的同源性可能沒有到達超過90%甚至80%的水平。在這種情況下針對一些亞種的目標序列和RNAi有義鏈之間的序列同源性可以是80%或者更低。另一方面，當生物的靶基因沒有顯示出種、亞種或者變體之間的高度序列同源性時，本發明的多啟動子RNAi表達構建體特別的有用，此時多啟動子RNAi表達盒中的每一個RNAi種都可用於定位靶基因(s)或者變體或者亞種集合的不同部位。除了以目標序列的保守區域為基準選擇的RNAi序列之外，選擇RNAi序列可以其它的因子為基準。儘管已經有許多努力來設計針對鑑別序列一該鑑別序列是基於目標序列的特徵(例如，GC含量百分比、翻譯起始密碼子位置、或者基於用於搜索建議的RNAi同源性的序列資料庫的序列相似性)並在RNAi中是有效的一的選擇標準，目前還不能以很高的可信度預言無數可能的相應於靶目標的RNAi候選序列能夠引發實際的RNA沉默反應。相反的，通常，生產並檢測特異的候選RNAi多核苷酸序列以確定對靶目標表達的幹擾是否被引發出來。當前的抗病毒的療法的一個主要的問題是出現抗藥性變體，一般地稱為逃避突變體(Gitlin等.T.of Virol. 79 ;1027_1035，(2005))。本發明的一方面可壓製出現的逃避突變體。在本發明的一些實施方案中對治療病毒感染的多RNAi序列的選擇是基於來自被單鏈RNAi序列感染的細胞中的逃避突變體。出現的逃避突變體是由在細胞被病毒感染後使用包含RNAi單鏈序列的表達構建體進行的治療來確定的。包含有抗性病毒的細胞被收集起來並且對病毒基因組進行測序。測序結果顯示出現的主要突變體是用於抵抗病毒抑制的。產生本發明的多啟動子RNAi表達構建體，其包含有基於靶目標基因序列之RNAi序列以及附加的用於抵抗RNAi治療的點突變序列。如所述，多啟動子RNAi表達盒的RNAi編碼區域可操作的連接至終止子元件。在一個實施方案中，終止子包括具有四個或更多胸苷殘基的伸展區域。在一個優選的實施方案中，所有使用的終止子元件都是不同的，而且是和啟動子元件相匹配的，兩者源於同一基因。這樣的終止子包括SV40poly A、Ad VAl基因、5S核糖體RNA基因以及人類t_RNA的終止子。另外的，啟動子和終止子可以混合併匹配，正如通常使用RNA polll啟動子和終止子那樣。另外的，可以配置多啟動子RNAi表達盒使得多克隆位點和/或特定限制性位點可按一定的策略而定位，比如啟動子、RNA i和終止子元件可以輕易的移走或替換。而且多啟動子RNAi表達盒可以由小寡核苷酸組分裝配而來，該組分使用有策略地定位的限制性位點和/或互補粘末端。根據本發明實施方案的基礎載體之一包括了具有多重連接子的質粒，其中所有的位點都是特定的(雖然這並不是絕對的要求)。接著，每一個啟動子都插入到設計好的特定位點中形成了一個具有三個或更多啟動子的基礎盒，所有的啟動子可以具有不同的方向。然後，退火引物對插入到每個啟動子下遊的特定位點上，形成了三重表達載體構建體。這樣的插入可以移動到，例如，使用在三重表達載體插入位點側翼的兩個特定酶切位點(相同或不同)的AAV骨架上。在圖1的步驟300中，多啟動子RNAi表達盒連接到遞送載體上。多啟動子RNAi表達盒所插入的並用於在多種細胞中有效地轉導並表達RNAi試劑的構建體是來源於病毒的並且可以容納病毒遞送。該構建體的生產可以本領域公知的任意基因工程技術實現，包括但不限於，標準PCR技術、寡核苷酸合成、限制性內切酶消化、連接、轉化、質粒純化和DNA測序。構建體優選包括，例如，將多啟動子RNAi表達構建體包裝至病毒顆粒所需的序列和/或允許多啟動子RNAi表達構建體插入至靶細胞基因組的序列。病毒構建體也可以包含允許病毒複製和增殖的基因，儘管在優選實施方案中這樣的基因是順式的。另外的，病毒構建體可以包括任意已知生命體中天然的或經修飾的基因組中的基因或遺傳序列。例如，優選的病毒構建體包括了用於在細菌中複製的序列。該構建體也可以包含附加的遺傳元件。可包括在構建體中的元件種類不受任何限制並且可由本領域技術人員選擇。例如，附加的遺傳元件可以包括報告基因，諸如一個或多個螢光標記蛋白(如GFP或RFP)，一個易於檢測的酶如￠-半乳糖苷酶、螢光素酶、￠-葡糖醛酸糖苷酶，氯黴素乙醯轉移酶或者分泌的胚胎鹼性磷酸酶；或者可用於免疫分析的蛋白如激素或者細胞因子。可用於本發明實施方案的其它遺傳元件包括那些編碼蛋白質的元件一所述蛋白質可給細胞帶來選擇性生長優勢，例如腺苷脫氨酶、氨基糖苷磷酸轉移酶、二氫葉酸還原酶、潮黴素一 3 —磷酸轉移酶，或者編碼可提供在營養缺陷型中缺失的生物合成能力的蛋白質。如果包含順著多啟動子RNAi表達盒的報告基因，那麼內在核糖體進入位點(IRES)序列也可包含在其中。優選地，附加的遺傳元件可操作性地被連接並由獨立的啟動子/增強子所控制。基於合適病毒的病毒遞送系統可以用於遞送本發明的多啟動子RNAi表達構建體。另外的，可以使用雜交病毒系統。病毒遞送系統的選擇依賴於多種參數，例如遞送的靶組織、系統的轉導效率、致病性、免疫和毒性等等。考慮到可使用本發明的多啟動子RNAi表達盒所幹擾的目標疾病的多樣性，沒有一個單一的病毒系統可以適合所有的應用。當選擇病毒遞送系統來應用到本發明中的時候，選擇這樣系統是很重要的，所述系統中包含多啟動子RNAi表達盒的病毒顆粒優選是1)可再生並穩定增殖的；2)可以純化至很高的滴度；和3)能夠調控靶向遞送(將多啟動子RNAi表達構建體遞送至目標組織或器官而不帶有大範圍的擴散)；4)能夠以組成型或可調節型的方式進行表達。總的來說，根據基因組是整合到宿主細胞染色體中(腫瘤逆轉錄病毒和豆狀病毒)還是主要作為染色體外游離基因存在於細胞核中，五種最常見的適用於基因治療的病毒遞送系統被分為兩類。這種區分是決定每種針對特定用途載體的適用性的重要因素；非整合型載體可以，在某些情況下，在非增殖細胞中調節持續的基因表達，但如果在分裂的細胞中需要維持穩定的遺傳改變，整合型載體就成為選擇的工具。

例如，在本發明的一個實施方案中，使用了來自細小病毒科家族的病毒。細小病毒科是一個具有大約5000核苷酸長度基因組的單鏈、非包膜DNA病毒家族。成員之一是腺伴隨病毒(AAV),該病毒是依賴性細小病毒需要和另外的病毒(一般的是腺病毒或者皰疫病毒)協同感染以便引發及維持一個有生產效能的感染周期。缺乏這樣的一個輔助病毒的情況下，AAV仍然有能力經過受體調節的結合和內化作用感染或者轉導至靶細胞，滲入非分裂和分裂期細胞的細胞核。一旦進入細胞核，病毒打開外殼並且從許多不同的形式表達該轉化基因一其中最穩定的是環形的單體。AAV將整合至1-5%的穩定轉導的細胞基因組中(Nakai,等.，1-Virol. 76 =11343-349 (2002)。該轉化基因的表達可以是特別穩定的並且在一個關於使用AAV遞送因子IX的研究中，在該病毒直接侵入5年後犬體模型仍持續表達治療水平的因子IX蛋白。因為在缺乏輔助病毒的情況下子代病毒不是由AAV傳染產生的，轉導的程度僅僅受限於感染上該病毒的起始細胞。這一特徵使得AAV成為了本發明一個優選的基因治療載體。而且，不同於反向病毒、腺病毒及單純皰疫病毒，AAV顯不出缺乏對人類的致病性和毒性(Kay,等 ，Nature. 424 :251 (2003)和 Thomas,等 ，Nature Reviews, Genetics4 346-58 (2003))。一般地，AAV的基因組包含僅僅兩個基因。「r印」基因編碼在DNA複製中使用的至少四個不同的蛋白質。「cap」基因產物被不同地剪接以產生包含該病毒殼體的三個蛋白質。在將基因組包裝至初期的病毒的時候，僅僅末端反向重複序列(ITRs)是必需的序列；rep和cap可以從該基因組上刪掉並且可被侯選的異源序列替換。然而，為了製造該蛋白質需要複製並將基於AAV的異源構建體包裝至初期的病毒顆粒，rep和cap蛋白質必須是順式的。一般說來通過輔助病毒協同感染來提供該輔助功能，諸如上述的腺病毒或者皰疹病毒也可是以一或多個DNA表達質粒的形式表現為順式。既然該基因組一般地僅僅編碼兩個基因，不令人驚訝的是，作為遞送工具，AAV限制在4. 5kb單鏈的包裝容量。然而，雖然這一大小限制可能限制了那些可以傳遞的用於基因治療的基因，相反地它沒有影響較短的序列諸如RNAi的包裝和表達。AAV在RNAi應用中的用途在這樣的實驗中展示，其中AAV用於在體外傳遞shRNA以抑制p53和胱天蛋白酶8的表達(Tomar等.,Oncogene. 22 :5712_15(2003))。隨著克隆適當的序列到易消化的AAV-2載體中，在HEK293細胞中生產了傳染性的AAV病毒顆粒並且用於感染HeLa S3細 胞。已經顯示出來內生胱天蛋白酶8和p53水平有一個劑量依賴的減少。Boden等人也使用AAV在體外傳遞shRNA抑制在組織培養系統中的HIV複製(Boden，等.,T. Virol. 77 (21):115231-35 (2003))，正如通過在餘下的培養基中存在的p24產品來評價的。然而，在使用AAV作為載體用於多啟動子RNAi表達構建體時的技術障礙也必須說明。例如，不同的百分數人類人口可以具有針對某AAV血清型的中和抗體。然而，既然有好幾個AAV血清型，對某些類型而言攜帶有中和抗體的個體百分比急劇的減少，其它的血清型能被使用或者擬類型也可以使用。至少有八種不同的血清型已經被鑑定，而其它許多類型雖然已經被分離但還沒有被充分地描述。另一個限制是，作為一個可能的針對AAV免疫反應的結果，基於AAV的治療僅僅可以執行一次；然而，使用替換的、非人類起源的血清型可以允許重複給藥。給藥途徑、血清型和傳遞基因組的組成都會影響組織特異性。利用多啟動子RNAi表達構建體的未修飾的AAV系統在使用中的另一個限制是轉導可能效率低。體內穩定的轉導可能限於5-10%的細胞。然而，本領域已經獲知不同的方法來促進穩定的轉導水平。一個方法是利用擬型，其中使用來源於其它血清型的cap蛋白質包裝AAV-2基因組。例如，通過使用AAV-2配對物取代AAV_5cap基因，Mingozzi等人在大約15% 的肝細胞中增加了穩定的轉導(Mingozzi，等.,T. Virol. 76 (20):10497-502 (2002))。Thomas等人使用AAV8殼體基因在體內轉導了 30%的鼠肝細胞(Thomas，等.，T. Virol, inpress)。virion Grimm 等人(Blood. 2003-02-0495)使用 AAV-1、AAV-3B、AAV-4、AAV-5 和AAV-6窮盡了 AAV-2的擬型以用於組織培養研究。最高的轉化基因表達水平是由使用AAV-6的擬型病毒顆粒誘導的；產生了比AAV-2高將近2000%的轉化基因表達。因而，本發明打算使用一個擬型化的AAV來實現高度的轉導水平，帶來RNAi多啟動子表達構建體表達的一個相應的增加。使用本發明的啟動子RNAi表達構建體的另一個病毒遞送系統是一個基於逆轉錄病毒科(Retroviridae)家族的病毒系統。逆轉錄病毒包含具有兩個獨特特徵的單鏈RNA動物病毒。首先，逆轉錄病毒的基因組是二倍體，由兩個拷貝的RNA組成。第二，這個RNA經過病毒顆粒關聯的酶逆轉錄至雙鏈DNA。這一雙鏈DNA或者原病毒能因此整合至宿主基因組並且作為該宿主基因組的穩定的整合元件從母細胞傳遞到後代細胞。在一些實施方案中，慢病毒是用於本發明的逆轉錄病毒的優選成員。通常使用泡狀滑石病毒糖蛋白(VSV-G)來擬型慢病毒載體，並且已經起源自人類免疫缺陷性病毒(HIV)-人類愛滋病(AIDS)的病原；羊腦炎-慢性進行性肺炎，它可在綿羊中導致腦炎(visna)或肺炎；馬傳染性貧血病毒(EIAV)，它在馬匹中導致自身免疫性溶血性貧血和腦病；貓免疫缺陷病毒(FIV)，它在貓科動物中導致免疫缺陷；在牛中導致淋巴結病和淋巴細胞增多的牛免疫缺陷病毒(BIV);猿的免疫缺陷病毒(SIV)，它在非人類靈長目中導致免疫缺陷和腦病。基於愛滋病病毒的載體一般地保持〈5%的親本的基因組，並且〈25%的基因組是合併進入包裝構建體，最小化了恢復複製能力HIV的產生可能性。通過自我失活載體的發展已經進一步增加了生物安全性，自我失活載體包含了在長末端重複序列下遊的調控元件刪除，消除了載體動員需要的包裝信號的轉錄。逆轉錄病毒RNA基因組的逆轉錄發生在細胞質中。不同於C-型逆轉錄病毒，和其它的病毒因子複合在一起的慢病毒cDNA—被稱為前起始複合物一能越過核膜發生移位並且轉導入非分裂細胞。該病毒cDNA的結構特徵一DNA副翼一似乎有助於有效率地進入細胞核。這個副翼依賴於位於病毒的聚合酶基因上的中央多嘌呤區域(cPPT)的完整，所以大多數的慢病毒起源的載體保持了這個序列。慢病毒有廣泛的向性，低的炎症性潛能，並且導致形成整合載體。主要的 限制是在一些運用中整合可以導致腫瘤生成。使用慢病毒載體主要的優點是在大多數的組織或者細胞類型中基因轉移是持續的。用來表達RNAi試劑的基於慢病毒的構建體優選地包含有來自慢病毒長末端重複(LTRs)5』和3』的序列。更加優選地該病毒構建體包含有來自於慢病毒的一個失活或者自我失活的3』LTR。LTR可以根據本領域熟知的任意方法通過自我失活而製造。在一個優選的實施方案中，3』 LTR的U3元件包含增強子缺失的序列，優選的增強子是TATA box.Spl和NF-kappa B位點。作為3』LTR自我失活的結果，整合到宿主基因組的原病毒將包含一個失活的5』LTR。LTR序列可以是來自任意慢病毒種的LTR序列。另外，可以使用病毒構建體中的一個啟動子序列替換來自慢病毒5』 LTR的U3序列。這可以增加從包裝細胞系中恢復的病毒的滴度。同時也可以包括一個增強子序列。本領域技術人員熟知的其它的病毒或者非病毒系統可以用於傳遞本發明的多啟動子RNAi表達載體到目標細胞，包括然而並非限於通過整合至寄主細胞在體內穩定地維持病毒編碼轉化基因的基因缺失腺病毒-轉座子載體(參見Yant，等.，NatureBiotech. 20 :999-1004 (2002));來源於辛德畢斯病毒(Sindbis virus)或者西門利克森林病毒(Semliki forest virus)的系統(參見 Perri，等.，T. Virol. 74(20):9802-07(2002));來源於新城疫病毒或者仙臺病毒的系統；或者缺少細菌的DNA序列的小環狀DNA載體(參見Chen,等.，Molecular Therapy. 8 (3):495-500 (2003))。在美國公開 No. 2004/0214329中描述的小環狀DNA展示了用於持續高度水平地轉錄核苷酸的載體。該環狀載體的特點在於缺乏表達沉默的細菌序列，並且除表達盒之外可能包括一個單向的位點特異性重組產品序列。此外，雜種病毒系統可以用於組合兩個或更多病毒的系統有用特性。例如，野生型AAV的位點特異性整合機器可以耦聯腺病毒的高效內化作用及核靶向特性。腺病毒或者皰疹病毒中存在的AAV經歷了一個高產的複製循環；然而，在缺乏輔助功能的情況下，AAV基因組整合至染色體19上的特異性位點。AAV基因組的整合需要AAV rep蛋白質的表達。因為常規的AAV載體刪除了包括rep在內的所有病毒基因，它們不能特異地整合至染色體19上。然而，這個特徵可以在適當的雜交系統中開發出來。此外，非病毒遺傳元件可以用於實現在一個病毒的輸送系統中所需的特性要求，諸如那些允許位點特異性重組的遺傳元件。在圖1的步驟400中，多啟動子RNAi表達構建體包裝至病毒顆粒中。本領域熟知的任意方法可以用於生產傳染性病毒顆粒其基因組包含有該病毒多啟動子RNAi表達構建體的一個拷貝。圖4A和4B顯示用於包裝本發明多啟動子RNAi表達構建體至被遞送的病毒顆粒中的另外的方法。在圖4A中的方法使用了包裝細胞，該細胞按照順式穩定地表達將病毒多啟動子RNAi表達構建體結合至病毒顆粒所需要的病毒蛋白質，以及用於特定的病毒的輸送系統的必要的或者優選的其它的序列(例如，複製需要的序列，結構蛋白質和病毒裝配)和針對組織進入的或病毒起源的或人工來源的配體。在圖4A中，多啟動子RNAi表達盒連接到病毒遞送載體上(步驟300)，並且產物病毒多啟動子RNAi表達構建體用來轉染包裝中的細胞(步驟410)。包裝細胞繼而複製病毒序列，表達病毒蛋白質並且包裝病毒多啟動子RNAi表達構建體至傳染性病毒顆粒(步驟420)。包裝細胞系可以是能夠表達病毒蛋白質的任意細胞系，包括然而並非限於293、HeLa、A549、PerC6、D17、MDCK、BHK、bing cherry、phoenix、Cf2Th或者其它任意的本領域技術人員熟知或製造的細胞系。例如，在美國專利No. 6，218，181中描述的包裝細胞系。另外地，不能穩定地表達必要的病毒蛋白質的細胞系可以由兩個或更多構建體共轉染以實現功能性粒子的有效生產。這樣的構建體包含有病毒多啟動子RNAi表達構建體，並且另一個質粒(s)包含有編碼允許細胞生產功能性病毒(複製並且包裝構建體)所必需蛋白質的核酸以及其它的輔助功能。圖4B顯示的方法使用了用於包裝那些沒有穩定地表達的病毒複製品和包裝基因。在這個例子中，啟動子RNAi表達構建體連接到病毒遞送載體(步驟300)中然後和一或多個表達複製所需病毒序列以及傳染性病毒顆粒產品的載體進行共轉染(步驟430)。細胞複製病毒序列，表達病毒蛋白質並且包裝病毒多啟動子RNAi表達構建體至傳染性病毒顆粒中(步驟420)。包裝細胞系或者複製及包裝構建體可能不表達包膜基因產物。在這些實施方案中，編碼包膜蛋白的基因可以在一個單獨的構建體上提供也就是說和病毒多啟動子RNAi表達構建體共轉染。因為包膜蛋白在某種程度上負責病毒顆粒的寄主範圍，病毒可以是擬型的。如同在上面描述的，「擬型化」病毒是具有來自於病毒包膜蛋白的病毒顆粒，此病毒並不是該基因組起源的病毒。本領域技術人員可以選擇適當的擬型用於使用的輸送系統及靶向的細胞。除給予特異性 寄主範圍之外，選擇的擬型可以準許病毒濃縮至很高的滴度。另外地病毒可以由用於限制向特異性種傳染的嗜環境性包膜蛋白質進行擬型(例如，嗜環境性包膜僅僅允許傳染鼠科動物細胞，而兩向性包膜允許傳染人類和鼠科動物細胞)。此外，遺傳修飾的配體能用於細胞特異性靶向，諸如用於肝細胞的脫唾液酸糖蛋白，或者用於受體調控結合的鐵傳遞蛋白)。經過在包裝細胞系中生產之後，包含多啟動子RNAi表達盒的病毒顆粒進行純化和定量(滴定)。純化策略包括密度梯度離心，或者，優選的，柱層析法。本發明的病毒多啟動子RNAi表達盒可特別適合用作處理疾病的治療手段或者預防疾病的疫苗。例如，多啟動子RNAi表達構建體可以被引入癌症細胞或者腫瘤中以抑制維持致癌症/腫瘤發生表現型所必需的基因的表達。同樣地，多啟動子RNAi表達構建體可以被引入感染上病原體諸如病毒的細胞中以抑制一個或多個的維持病原體所必需的基因的表達。多啟動子RNAi表達構建體可以是用作疫苗來靶向引發或者維持疾病或者病狀所需的基因。本發明的病毒多啟動子RNAi表達構建體可以用於治療癌症，包括實性腫瘤及白血病，包括胺前體攝取與脫羧細胞瘤、迷芽瘤、鰓原瘤、惡性類癌症候群、良性腫瘤心臟病、惡性腫瘤(例如，Walker、基細胞、嗜鹼性鱗狀細胞、褐色皮爾斯、導管、Ehrlich腫瘤、原位、Krebs2、Merkel細胞、粘質的、非小細胞肺、燕麥細胞、乳頭的、硬癌的、支氣管、支氣管播散、鱗狀上皮細胞、及移行細胞)，組織細胞紊亂，白血病(例如B細胞、混合細胞、裸細胞、T細胞、慢性T細胞、HTLV-1I關聯的、急性淋巴細胞、慢性淋巴細胞、肥大細胞及脊髓)，惡性hystiocytosis、霍奇金病、小免疫增生、非霍奇金淋巴瘤、漿細胞瘤、網狀內皮組織增殖、黑素瘤、成軟骨細胞瘤、軟骨瘤、軟骨肉瘤、纖維瘤、纖維肉瘤、巨細胞瘤、組織細胞瘤、脂肪瘤、脂肉瘤、間皮瘤、粘液瘤、粘液肉瘤、骨瘤、骨肉瘤、尤因肉瘤、滑膜瘤、腺纖維瘤、腺淋巴瘤、癌肉瘤、脊索瘤、顱咽瘤、無性細胞瘤、錯構瘤、間葉性腫瘤、中腎瘤、肌肉瘤、造釉細胞瘤、牙骨質瘤、牙瘤、畸胎瘤、胸腺瘤、滋養葉瘤、腺癌、腺瘤、膽管瘤、膽脂瘤、圓柱瘤、囊腺癌、囊腺瘤、淋巴管肉瘤、肌肉瘤、粘液肉瘤、卵巢惡性腫瘤、橫紋肌肉瘤、肉瘤(例如,尤因、實驗的、考波希、及肥大細胞)，贅生性腫瘤(例如，骨、乳房、消化系統、結腸直腸、肝臟、胰腺、垂體、睪丸、眼眶、頭、及頸、中樞神經系統、聽覺的、骨盆、呼吸道及泌尿生殖器)神經纖維瘤、及子宮頸非典型增生、及針對其它的情況的治療其中細胞變成不死的或者改造的。此外，本發明的多啟動子RNAi表達構建體可被用於與其它的治療方式的聯合，諸如化學療法、外科手術、冷凍療法、聞溫、放射治療等等。參與病原體複製、病原體遞送、或者維持傳染的基因可以經過病毒多啟動子RNAi表達構建體來進行祀向。這 樣的病毒多啟動子RNAi構建體可以用於治療處於被病原體傳染的危險中的細胞(例如疫苗)或者已經被感染的細胞。可以由本發明的多啟動子RNAi表達構建體及方法治療的病原體包括來自細小病毒科家族的病毒、乳多空病毒科(包括乳頭狀瘤病毒等等)，腺病毒科、皰疹病毒科(包括皰疹病毒類型I到7)，痘病毒科、嗜肝脫氧核糖核酸病毒科、小核糧核酸病毒(柯薩基A和柯薩基B病毒及艾柯病毒)，萼狀病毒科、呼腸孤病毒科、toga病毒科、(腦炎病毒)，黃素病毒科(腦炎病毒)、沙粒病毒科、逆轉錄病毒科、布尼亞病毒科、冠狀病毒科、正粘液病毒科、副粘液病毒科、彈狀病毒科及絲狀病毒科，一般的細菌，分枝桿菌、真菌、瘧疾、錐蟲血吸蟲屬等等。在圖1的步驟500中，多啟動子RNAi表達構建體被遞送至需要治療表達細胞。本發明的多啟動子RNAi表達構建體可以在體外引入細胞然後接著放入動物中以影響治療過程，或者通過體內給藥直接地給藥至有機體、器官或細胞。通過病毒感染的遞送是優選的遞送方法；然而，可用於多啟動子RNAi表達構建體的任意適當遞送方法都是可使用的。利用任意適當的操作規程包含有多啟動子盒的載體可以給藥至哺乳動物宿主，本領域已經熟知許多這樣的操作規程。核酸可以通過許多途徑被引入組織或者寄主細胞中，包括病毒感染、顯微注射、或者囊泡融合。注射也可能用於肌肉給藥，如同Furth等Anal. Biochem. 115 (205) :365-368(1992)描述的。核酸可以覆蓋在金顆粒上，並且通過文獻中描述的顆粒轟擊裝置或者「基因槍」(參見落入，Tang等.，Nature. 356 :152-154 (1992))遞送至真皮內，其中金顆粒被DNA所包裝，繼而轟擊至皮膚細胞。另一個可用於本發明的遞送方法包含了使用如Daviset等在美國專利No. 6,509,323中描述的Cyclosert 技術。Cyclosert 技術平臺是基於被稱為環糊精的葡萄糖杯狀周期重複分子。環糊精分子的"杯"可以與其它分子形成「內含物複合物」，使得對Cyclosert 聚合體與其它部分進行組合以提高穩定性或者增加靶向配體成為可能。此外，一般地環糊精已經被認為對人類是安全的(單獨的環糊精普遍地提高FDA批准和IV藥物的溶解度)。
包含多啟動子盒的載體可以通過在水性或非水性溶液中溶解、懸浮和乳化製備成用於注射或者給藥的製品，非水性溶液可以是例如油、合成的脂肪酸甘油酯、高級脂肪酸酯、或者丙二醇；並且如果需要，可以使用常規的添加劑例如增容劑、等滲劑、懸浮劑、乳化齊U、穩定劑和防腐劑。此外，包含多啟動子盒的載體可以和適當的、藥學上可接受的載體或稀釋液一起製備成藥物組合物。在製藥學劑型中，包含多啟動子盒的載體可以單獨給藥或者和其它藥學活性成分聯合或組合給藥。本領域技術人員可以很容易理解包含多啟動子盒的載體的劑量水平可以作為遞送系統天然性質、靶目標細胞轉化的相對難易性、靶目標細胞中RNAi種的表達水平等等的函數而變化。
實施例C型肝炎病毒(HCV)是一種可以使用本發明多啟動子RNAi表達構建體治療的疾病。根據疾病控制預防中心彙編的統計資料，幾乎2%的美國人一將近4百萬一現在已經感染了 HCV。起初，大部分的HCV個人感染沒有顯示出任何症狀；然而，超過80%的將發展成慢性和逐步發展的肝臟疾病並最終導致肝硬化或肝細胞癌。在美國HCV是導致肝移植的最主要原因並且每年導致8000到10000名美國人的死亡。世界衛生組織估計在全球有超過I億七千萬的感染者，在某些國家感染率高達總人口的10-30%。HCV是正義單鏈包膜RNA病毒，屬於黃素病毒科家族。HCV的感染周期一般地開始於受體介導的結合及內化作用後病毒顆粒進入細胞。在細胞質中打開外殼之後，包含基因組的RNA正義鏈可以和宿主細胞翻譯機器直接相互作用。缺少5』 cap的甲基化，RNA在5』非翻譯區(UTR)形成了一個充分的二級結構，其中UTR提供了內在核糖體進入位點(IRES)並允許40S亞基的直接結合以作為翻譯程序的起始步驟。HCV基因組，大約9600個核苷酸的長度，編碼了名為多聚蛋白(在圖8A中顯示)的一個長開放讀碼框。病毒蛋白質從多聚蛋白上以連接的前體形式生產出來，多聚蛋白隨後由多種病毒和細胞中的酶切割為成熟產品。這些基因中編碼了結構蛋白，包括核心與包膜糖蛋白，這樣命名是因為它們在後代病毒顆粒中是完整的結構組分。非機構性蛋白質，提供了不可缺少的功能例如依賴RNA的RNA聚合酶，也被生產出來。病毒顆粒複製機器在被感染細胞的細胞質內建立起來並可以將正義RNA轉錄成為負鏈中間體。因此，HCV基因組細胞同時作為自身複製的模板以及用於翻譯病毒編碼蛋白的信使RNA。負鏈被轉錄回正鏈RNA，因此增加了細胞中正鏈拷貝的數量。在這個階段，正鏈RNA可以和宿主細胞翻譯機器再一次相互作用或者，如果已經有足夠的結構蛋白質的積累，被包裝成病毒顆粒。隨著從細胞中的釋放，病毒在整個感染周期中重複。實施例1 :用於體內遞送shRNA序列的AAV-2表達載體的開發在對經由感染性粒子的shRNA遞送進行檢驗之前，合適的表達質粒被構建並驗證。在設計多啟動子RNAi表達構建體時 至少有兩個特徵需要考慮1)構建體必須能有效地包裝進入後代病毒顆粒；和2)質粒必須提供高水平的shRNA表達。此外，為了檢測多啟動子RNAi表達構建體，必須有評估轉染和轉導效率的手段。已經被rep和cap序列摻入(gut)的AAV-2載體提供了用於病毒RNAi表達構建體的骨架(在下文中指的是rAAV載體)。這一載體已經廣泛應用於AVV研究中並且對高效率包裝的需要已經有了很好的理解。U6和Hl啟動子已用於shRNA序列的表達，雖然有報導顯示針對每一啟動子獨立驅動的同一 shRNA有非常不同程度的抑制。然而，如果這樣的變異存在的話載體構建中的啟動子可以很容易地替換。事實上和任何病毒遞送系統一樣，rAAV載體必須滿足特定的標準大小以便被有效地包裝。總的來說，rAAV載體長度必須是4300-4900個核苷酸(McCarty,等Gene Ther8 1248-1254 (2001))當rAAV載體低於此限制時，必須加入填充片段(Muzyczka,等.Curr.Top. Microbiol.1mmunol. 158 :970129 (1992))。另外地，rAAV 多啟動子 RNAi 表達構建體必須加載兩個或更多的多啟動子RNAi表達盒。在這裡所描述的rAAV載體的實施方案中，每一個啟動子/ RNAi /終止子組件長度大約400個核苷酸，留下了足夠的空間用於在每個表達盒中容納多個啟動子/ RNAi /終止子組件。另外地，可以在rAAV多啟動子RNAi表達構建體中加入一個或多個選擇性標記盒以便用於評估rAAV表達構建體的轉染效率，並允許使用經感染的病毒顆粒遞送的rAAV表達構建體來對靶目標細胞的轉導效率進行量化。初始的檢驗表達載體驅動了 shRNA種的表達，該shRNA種根據已證明具有抑制來自報告構建體的螢光素酶活性能力的序列而設計(參見，Elbashir,等.Embo.1. 20 (23)6877-6888 (2001))。RNAi盒 的元件，包括啟動子、shRNA和終止子序列，是短的並且利用長、互補寡核苷酸獨立地從新裝配，該寡核苷酸繼而使用多克隆位點克隆入病毒載體中。商業可得的表達載體編碼螢光素酶功能產物作為報告物以便於證明shRNA向下調控靶目標序列(如在圖5中所顯示的)的能力。雖然針對螢光素酶的shRNA先前已經被驗證，由rAAV所遞送的shRNA的功效首先在體外進行評估。利用標準技術將檢測和報告構建體轉染至許可的細胞。使用不相關的shRNA序列替換螢光素酶特異性shRNA的rAAV表達構建體在試驗中被用作負對照。通過螢光顯微技術評估選擇性標記物的水平並由此直接估計轉染效率的相對百分比。為了評估shRNA的抑制活性，使用標準的商業試劑盒測量螢光素酶的活性。另外地，使用定量實時PCR分析(Q-PCR)技術分析從平行實驗板中收穫並純化的RNA。相對於從使用不相關shRNA種處理過的細胞裂解液中測得的活性，超過90%的活性減少顯示了 shRNA是具有高度功能的。執行後續實驗以評估shRNA對於螢光素酶報告系統的影響，該系統被轉染至小鼠肝臟，與McCaffrey等人在Nature. 418 38~39 (2002)上發表的工作相似。通過水動力轉染法遞送至小鼠的核酸主要定位在肝臟。與在細胞培養中支配共轉染的原理非常類似，來自於混合物的多質粒的同時注射通常所有的表達構建體滲透進入相同的細胞。因此，即使已經證明尾靜脈注射程序只能轉染肝臟中5-40%的肝細胞(McCaffrey,等.NatureBiotech. 21 (6) :639-644 (2003))，共轉染也允許將報告系統和表達構建體遞送至相同的細胞中。攜帶有針對與螢光素酶的shRNA序列的rAAV表達構建體和編碼螢光素酶基因的報告構建體一起共注射。在接受了陰性對照的動物中，攜帶不相關shRNA的表達構建體和報告構建體一起共注射。基於產生於肝臟一部分的溶解產物來測量螢光素酶的活性。肝臟的剩餘部分用於Q-PCR測量和組織學分析以確定標記蛋白質的表達從而獲得標準化數據。評估轉染效率的其它方法包括對來自小鼠的血清進行的ELISA測量，其中使用第三個用於分泌蛋白質諸如人類a I 一抗胰島素(hAAT) (Yant,等 Nature Genetics. 25 :35-41(2000),也參見 McCaffrey,等.Nature Biotech. 21 (6):639-644 (2003))的標記質粒共轉染小鼠。一旦確認了表達構建體在體外細胞培養系統和使用裸露DNA質粒共轉染的小鼠模型中同樣具有功能，從rAAV表達構建體包裝成為感染性病毒顆粒開始進行檢驗。從商業可得的AAV無輔助子系統製造感染性粒子，該無輔助子系統需要三個單獨的表達構建體進行共轉染，包括I)表達針對螢光素酶的shRNA (側翼是AAV ITRs)的rAAV構建體；2)編碼AAV rep和cap基因的構建體；和3)包含有生產高滴度病毒所需的輔助腺病毒基因的表達構建體。在標準純化程序之後，病毒顆粒可用於實驗。在小鼠被注入rAAV顆粒之前，小鼠肝臟中已經建立了一套報告系統。水動力的轉染被用來遞送螢光素酶報告構建體和為了對照動物之間轉染效率差異的針對hAAT的表達質粒。小鼠被允許恢復幾天以便產生足夠水平的報告物活性。在肝臟中確證了螢光素酶報告活性之後，通過門靜脈或者尾靜脈將rAAV粒子注入正常C57B1/6小鼠。攜帶有不相關shRNA表達構建體的rAAV粒子被用作陰性對照。起初，使用較高的劑量(2xl012載體基因組(vg))注入小鼠，在隨後的實驗中降低劑量以產生劑量一反應曲線。經過七到十天後，處死小鼠，收集肝臟和血清的樣本。從分離的肝臟中利用螢光素酶分析和前面描述的QPCR程序來決定肝臟螢光素酶活性與RNA的相關水平。另外地，通過測量肝臟組織連續切片中的標記蛋白質來評估轉導的效率。實驗的結果可能有很寬的範圍。前面已經證明水動力的轉染程序可能導致5-40%肝細胞的轉染。使用AAV-2遞送程序轉導肝細胞的結果顯示了 5-10%的轉導效率。雖然AAV可能優先地轉導通過初始尾靜脈注射程序轉染的同樣的肝細胞庫，每一種技術影響的細胞子集可能是不重疊的。如果發生前者情況，可以看到相對於由不相關shRNA種轉導的小鼠而言有一個螢光素酶活性的減少。如果發生後者的情況，那麼不會觀察到螢光素酶活性的降低。

必須要證明由三重表達構建體遞送的AAV粒子在體外抑制了螢光素酶一HCV融合蛋白報告物。許可的組織培養細胞被圖9詳述的報告構建體所轉染。此外，每一種共轉染混合物都具有編碼hAAT的質粒。培育48小時之後，使用攜帶有針對HCV的三重啟動子shRNA表達質粒的感染性粒子對細胞進行給藥。包含表達三種不相關shRNA種的三重啟動子構建體的AAV顆粒被用作陰性對照。測量螢光素酶的活性以驗證AAV遞送的shRNA是高度有功能的。實施例2 :增強AAV轉導肝臟組織效率的修飾雖然已經證明基於AAV的載體能夠遞送需要的序列至肝細胞，一般而言發生在那些組織中的轉導的相對水平是相當的低。當前使用AAV-2以遞送和表達血液因子IX的血友病臨床研究中，未取得有重大意義的結果。為了治療血友病，關鍵的因素僅僅是補充分泌蛋白使其達到可發揮療效的水平。這樣的補充可能發生在少數能夠表達大量所需蛋白的轉導細胞中。然而，因為RNAi作用機制是細胞內的並且其效果並不能直接在細胞間傳播，必須增加轉導的效率以便AAV能表達shRNA並用於治療。McCarty等人能夠生產自身互補AAV載體(scAAV)，該載體在其衣殼中同時具有同一表汰盒的if鏈和負鏈(Gene Ther. 8 1248-1254 (2001))。這是通過突變5』ITR並且保留3』 ITR不變而完成的。通過突變或者刪除末端分離位點其它非基本AAV序列，因而消除了野生型AAV和這個構建體之間可能的重組，創造了一個DNA模板其中複製在3』 ITR起始。一旦複製機器到達5』 ITR，不會發生分離並且複製持續到3』 ITR0結果產物具有正鏈和互補負鏈，仍然可有效地包裝。使用scAAV載體，轉導的肝臟細胞增加到總肝細胞的30% (Fu,等.Molec Therapy. 8 (6):911-7. (2003))。當在內質網液泡間遞送時,超過50%的小腦梨狀神經元被sckkN粒子轉導。Thomas等人報導自身互補載體能夠在小鼠肝臟中產生比以相同劑量注入小鼠肝臟中的相應的單鏈AAV表達載體高50倍的螢光素酶轉基因表達水平(Thomas,等.，J. Virol, (in press))。雖然略微下降,注射後將近一年在載體之間表達的相對差異度維持在20倍。此處使用了相似的策略。由於與包裝rAAV多啟動子RNAi表達構建體關聯的大小限制，可用於遞送治療性序列一同其它病毒遞送系統相比已經相當的小一的空間數量由於使用scAAV而減半。因此，大小的限制被降低到2250個核苷酸而不是能夠包裝4500個核苷酸。不管這些，多啟動子RNAi表達h盒的大小允許這樣的構建體。圖6顯示了 ScAAV內部主要元件的圖解。AAV遞送系統的其它修飾也被用於極大地增加轉導的效率，包括使用來自其它血清型的Cap蛋白包裝rAAV-2載體基因組以生產擬型化的病毒顆粒。即使有經過使用擬型化策略而獲得的優點，對肝細胞轉導效率的極限可能僅僅增加到總人口的15%。然而，12個其它的AAV血清型已經被分離並鑑別，但還沒有能夠具體描述至可評估的程度。例如，其中之一的是AAV-8，它最初從恆河猴心臟組織中分離出來。在測定新的cap蛋白對轉導所具有的作用時，擬型化的病毒被創造出來，其中單鏈AAV-2基因組是用AAV-Scap擬型的。載體攜帶LacZ基因以便評估注射增加劑量的感染性顆粒後對小鼠肝臟轉導的相對效率。對結果的總結(Thomas,等.T Virol. 78 (6) =3110-22. (2004))顯示在下面的表I中表1AAV-2/2和AAV-2/8的劑量反應(％ beta-gal陽性的肝細胞)
權利要求
1.包含多啟動子表達盒的遺傳構建體，所述多啟動子表達盒包含至少三個啟動子/RNAi/終止子組分，其中每個啟動子/RNAi/終止子組分包含啟動子元件、終止子元件和與啟動子元件和終止子元件可操作地連接的編碼RNAi種的序列，並且其中每個RNAi種彼此各不相同，且其中所述RNAi種中的至少一個由SEQ ID N0:19編碼。
2.根據權利要求1的遺傳構建體，其中所述RNAi種中的至少一個由SEQID NO 6或SEQ ID NO :8 編碼。
3.根據權利要求1的遺傳構建體，其中所述RNAi種由SEQID NO :8、19和22編碼。
4.根據權利要求1至3中任一項的遺傳構建體，其中所述遺傳構建體還包含將該構建體包裝進入感染性病毒顆粒中所必需的元件。
5.根據權利要求1至3中任一項的遺傳構建體，其中存在有在任一盒內部出現一次的終止子元件與出現兩次或者以上的終止子元件的集合。
6.根據權利要求1至3中任一項的遺傳構建體，其中存在有在任一盒內部出現一次的啟動子元件與出現兩次或者以上的啟動子元件的集合。
7.根據權利要求1至3中任一項的遺傳構建體，其中所述RNAi種靶向至具有變體之間序列單核苷酸多態性(SNP)的基因，並且每個RNAi種可以靶向至一或多個變體的亞型。
8.根據權利要求1至3中任一項的遺傳構建體，其中所述RNAi種靶向經歷快速突變的病毒序列。
9.根據權利要求1至3中任一項的遺傳構建體，其中所述RNAi種的序列靶向基因的一個或多個變體。
10.根據權利要求1的遺傳構建體，其中所述RNAi種基於靶基因的序列，以及附加地基於具有用於抵抗RNAi治療的點突變的序列。
11.權利要求1至10中任一項的遺傳構建體在製備用於治療C型肝炎病毒感染的藥物中的用途。
12.權利要求1至10中任一項的遺傳構建體在製備用於修飾在細胞中表達的一或多個核酸靶的藥物中的用途，包括 a)將權利要求1至10中任一項的遺傳構建體包裝進入病毒顆粒； b)將該病毒顆粒遞送至細胞；和 c)在待修飾的核酸靶足以表達的條件下表達來自權利要求1至10中任一項的多啟動子表達盒中的三個或更多個RNAi種， 其中所述核酸靶基本上與在病毒中發現的基因相同，並且所述病毒是C型肝炎病毒。
13.權利要求1至10中任一項的遺傳構建體在製備用於修飾在細胞中表達的一或多個核酸靶的藥物中的用途，包括 a)將權利要求1至10中任一項的遺傳構建體包裝進入非病毒顆粒； b)將該非病毒顆粒遞送至細胞；和 c)在待修飾的核酸靶足以表達的條件下表達來自權利要求1至10中任一項的多啟動子表達盒中的三個或更多個RNAi種， 其中所述核酸靶基本上與在病毒中發現的基因相同，並且所述病毒是C型肝炎病毒。
14.權利要求1至10中任一項的遺傳構建體在製備用於抑制在細胞中表達的一或多個C型肝炎病毒核酸靶的藥物中的用途，其中每個RNAi種基本上與所述核酸靶或所述核酸靶的變體 的序列相同。
全文摘要
本發明提供一種用於RNAi同時遞送，優選地在體內向哺乳動物細胞遞送的多啟動子表達盒。
文檔編號A61K38/28GK103060324SQ201210556628
公開日2013年4月24日 申請日期2005年3月4日 優先權日2004年3月5日
發明者P·W·羅爾溫克, D·A·蘇海, A·A·科雷哈洛夫 申請人:貝尼泰克生物製藥有限公司