用於產生富含多不飽和脂肪酸的油的新δ9-延伸酶的製作方法

2023-12-03 04:52:16 2

專利名稱：用於產生富含多不飽和脂肪酸的油的新δ9-延伸酶的製作方法
用於產生富含多不飽和脂肪酸的油的新Δ9-延伸酶公開內容背景
本公開內容涉及編碼Λ9-延伸酶的分離的多核苷酸，由分離的多核苷酸編碼的Δ9-延伸酶，包含分離的多核苷酸的表達載體，包含表達載體的宿主細胞，和用於產生Δ 9-延伸酶和多不飽和脂肪酸的方法。多不飽和脂肪酸(PUFA)在生活型的適當起作用中發揮很多作用。例如，PUFA是細胞質膜的重要組分，在其中它們以磷脂的形式發現。它們還充當哺乳動物前列腺環素、類花生酸、白三烯和前列腺素的前體。另外，PUFA是發育中的嬰兒腦的適當發育以及組織形成和修復必需的。考慮到PUFA的生物學意義，做出有效產生其以及導致其產生的中間產物的嘗試。
許多酶，最值得注意的是去飽和酶和延伸酶，涉及PUFA生物合成(參見圖I)。去飽和酶催化在底物的脂肪酸烷基鏈內在碳原子之間不飽和(例如雙鍵)的引入。延伸酶催化
2-碳單位對脂肪酸底物的添加。例如，亞油酸(LA，18:2n-6)通過Λ 12-去飽和酶由油酸(0A，18:ln-9)產生。二十碳二烯酸(EDA，20: 2η_6)通過Λ 9-延伸酶由亞油酸(LA，18: 2η_6)產生。二高￥-亞麻酸(061^，20:311-6)通過八8-去飽和酶由二十碳二烯酸化0八，20:211-6)產生。花生四烯酸(ARA，20:4n-6)通過Λ5-去飽和酶由二高Y -亞麻酸(DGLA，20: 3n_6)產生(參見圖I)。延伸酶催化Y-亞麻酸(GLA，18:3n-6)至二高Y -亞麻酸(DGLA，20: 3n_6)的轉換和十八碳四烯酸(SDA, 18:4n-3)至二十碳四烯酸(ETA, 20:4n_3)的轉換。延伸酶還催化花生四烯酸(ARA，20:4n-6)至腎上腺酸(ADA，22: 4n_6)的轉換和二十碳五烯酸(EPA，20:5n-3)至(0 3-二十二碳五烯酸(22:511-3)的轉換。Λ 9-延伸酶延伸在碳9位置上含有不飽和的多不飽和脂肪酸。例如，Λ 9-延伸酶催化亞油酸(LA，18:2η-6)至二十碳二烯酸(EDA, 20: 2n-6 )的轉換和α -亞麻酸(ALA，18: 3η_3 )至二十碳三烯酸(ETrA, 20: 3η_3 )的轉換。0 341^隨後可以通過八8-去飽和酶轉換為(0 34了4。ω3_ΕΤΑ隨後可以用於產生其他多不飽和脂肪酸,例如ω3_ΕΡΑ，其可以加入藥物組合物、營養組合物、動物飼料以及其他產物例如化妝品中。在過去已鑑定的延伸酶依據它們作用於其的底物不同。此外，它們存在於動物和植物中。在哺乳動物中發現的那些具有作用於飽和、單不飽和和多不飽和脂肪酸的能力。相比之下，在植物中發現的那些對於飽和或單不飽和脂肪酸是特異性的。因此，為了產生在植物中的多不飽和脂肪酸，存在關於PUFA特異性延伸酶的需要。在植物和動物中，延伸過程被認為是4步機制的結果(Lassner等人，PlantCell 8:281-292 (1996))。CoA是醯基載體。步驟I涉及丙二醯-CoA與長鏈醯基-CoA的縮合，以獲得二氧化碳和酮醯基-CoA，其中醯基部分已延伸2個碳原子。後續反應包括還原為羥基醯基-CoA，脫水為烯醯-CoA，和第二次還原，以獲得延伸的醯基-CoA。起始縮合反應不僅是底物特異性步驟還是限速步驟。應當指出動物不能去飽和超過Λ 9位置，並且因此不能將油酸(0A，18: ln-9)轉換成亞油酸(1^，18:211-6)。同樣地，0-亞麻酸(麼1^，18:311-3)不能由哺乳動物合成，因為它們缺乏Λ 15-去飽和酶活性。然而，α -亞麻酸可以通過Λ 6-去飽和酶轉換為十八碳四烯酸(SDA, 18:4η-3)(參見WO 96/13591 ;還參見美國專利號5，552，306)，隨後為在哺乳動物和藻類中延伸為二十碳四烯酸(ΕΤΑ，20:4η-3)。這種多不飽和脂肪酸(即，ΕΤΑ，20:4η_3)隨後可以通過Λ 5-去飽和酶轉換為二十碳五烯酸(ΕΡΑ，20:5-3)。包括真菌和植物的其他真核生物具有在碳12 (參見WO 94/11516和美國專利號5，443，974)和15 (參見WO 93/11245)上去飽和的酶。動物的主要多不飽和脂肪酸因此衍生自飲食和/或亞油酸或α-亞麻酸的去飽和和延伸。考慮到哺乳動物無法產生這些必需長鏈脂肪酸，從天然產生這些脂肪酸的物種中分離涉及PUFA生物合成的基因且在微生物、植物或動物系統(其可以改變以提供一種或多種PUFA的商業數量的產生)中表達這些基因是具有顯著利益的。因此，存在關於延伸酶、編碼該酶的基因以及產生該酶的重組方法的明確需要。考慮到上述討論，還存在關於含有超過天然存在那些外的PUFA水平的油以及富含新PUFA的那些的確定需要。此類油可以通過延伸酶基因的分離和表達進行製備。最重要的長鏈PUFA之一是二十碳五烯酸(EPA)。EPA在真菌以及海產油中發現。 二十二碳六烯酸(DHA)是另一種重要的長鏈PUFA。DHA最通常在魚油中發現，並且還可以從哺乳動物腦組織中純化。花生四烯酸(ARA)是第三種重要的長鏈PUFA。ARA在絲狀真菌中發現，並且還可以從哺乳動物組織包括肝和腎上腺中純化。ARA, EPA和/或DHA例如可以經由替代Λ 8_去飽和酶/Λ9-延伸酶途徑或常規Λ6途徑產生(參見圖I)。先前已鑑定了在用於產生長鏈PUFA特別是ARA、EPA和DHA的常規Λ 6途徑中對底物脂肪酸有活性的延伸酶。用於將LA轉換為DGLA和ALA轉換為ω 3-ΕΤΑ的常規Λ6途徑利用Λ6-去飽和酶，以將LA轉換為GLA和ALA轉換為十八碳四烯酸(SDA)，和Λ 6-延伸酶，以將GLA轉換為DGLA和SDA轉換為ω3_ΕΤΑ。然而，在一些情況下，替代Λ 8-去飽和酶/ Λ 9-延伸酶途徑可以相對於常規Λ 6途徑優選。例如，如果特定殘留ω-6或ω -3脂肪酸中間產物例如GLA或SDA在DGLA、ω 3_ETA、ARA、EPA、ω 3_ 二十二碳五烯酸、ω 6-二十二碳五烯酸、ADA和/或DHA的產生過程中是不需要的，那麼替代Λ8-去飽和酶/Δ9-延伸酶途徑可以用作常規Λ 6途徑的替代物，以繞過GLA和SDA形成。在本公開內容中，已鑑定了 Λ9-延伸酶的新來源用於產生長鏈PUFA，特別是DGLA、ETA、ARA、EPA、ω 3-二十二碳五烯酸、ω 6-二十二碳五烯酸、ADA和/或DHA。本公開內容的Λ 9-延伸酶將例如LA轉換為co6-EDA和ALA轉換為co3_ETrA。來自co6_EDA的DGLA和來自DGLA的ARA產生隨後分別通過Λ 8-去飽和酶和Λ 5-去飽和酶催化。公開內容概述
在一個方面，本公開內容涉及包含分離的核苷酸序列或與之互補的分離的核酸分子或其片段，所述分離的核苷酸序列編碼具有延伸酶活性的多肽，其中所述多肽的胺基酸序列與選自SEQ ID NO 18和SEQ ID NO 20的胺基酸序列具有至少68%序列同一性。在另一個方面，本公開內容涉及包含選自SEQ ID Ν0:17和SEQ ID NO :19的核苷酸序列的至少68%或與之互補的分離的核苷酸序列或其片段。分離的核苷酸序列或其片段編碼利用多不飽和脂肪酸作為底物的功能上活性的延伸酶，且特別是功能上活性的Δ9-延伸酶。核苷酸序列可以來自例如類眼蟲屬物種(及sp.)，並且可以具體地從例 Euglena deses Ehr. CCMP 2916 中分離。
在另一個方面，本公開內容涉及由上述分離的核苷酸序列編碼的純化多肽，以及延伸在碳9位置上含有不飽和的多不飽和脂肪酸且與選自SEQ ID N0:18和SEQ ID NO 20的胺基酸序列具有至少68%胺基酸同一性的純化多肽。在另外一個方面，本公開內容涉及表達載體。表達載體包含與調節序列可操作地連接的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包含選自SEQ ID N0:17和SEQ ID NO : 19的核苷酸序列的至少68%或與之互補。本公開內容還涉及包含這種表達載體的宿主細胞。宿主細胞可以是例如真核細胞或原核細胞。合適的真核細胞和原核細胞在本文中闡述。本公開內容還涉及包含表達載體的轉基因種子。在另一個方面，本公開內容涉及包含上述表達載體的植物細胞、植物種子、植物或植物組織,其中表達載體的核苷酸序列的表達導致通過植物細胞、植物或植物組織產生至少一種多不飽和脂肪酸。多不飽和脂肪酸可以例如選自《6-EDA和《3-ETrA及其組合。本公開內容還包括由上述植物細胞、植物種子、植物或植物組織表達的一種或多種植物油或脂肪酸。
此外，本公開內容涉及產生Λ9-延伸酶的方法。該方法包含步驟a)分離包含選自SEQ ID NO : 17和SEQ ID NO 19的核苷酸序列的至少68%或與之互補的核苷酸序列；b)構建包含與ii)調節序列可操作地連接的i)分離的核苷酸序列的表達載體；和c)合適時，在足以表達Λ9-延伸酶的時間和條件下，將表達載體引入宿主細胞內。宿主細胞可以是例如真核細胞或原核細胞。特別地，真核細胞可以是例如哺乳動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞或真菌細胞。植物細胞可以來自選自大豆、芸苔屬iBras si ca )物種、紅花、向日葵、玉蜀黍、棉花和亞麻的油料種子植物。另外，本公開內容涉及用於產生多不飽和脂肪酸的方法，其包含步驟a)分離包含選自SEQ ID N0:17和SEQ ID NO :19的核苷酸序列的至少68%或與之互補的核苷酸序列山)構建包含與調節序列可操作地連接的分離的核苷酸序列的表達載體；c)在足以表達Λ 9-延伸酶的時間和條件下，將表達載體引入宿主細胞內；和(1)使所表達的Λ 9-延伸酶暴露於底物多不飽和脂肪酸，以便將底物多不飽和脂肪酸轉換為第一種產物多不飽和脂肪酸。「底物」多不飽和脂肪酸是例如LA或ALA，並且「第一種產物」多不飽和脂肪酸分別是例如co6-EDA或ω3-Ε Α。這種方法可以進一步包含使第一種產物多不飽和脂肪酸暴露於至少一種去飽和酶、至少一種另外的延伸酶或其組合的步驟，以便將第一種產物多不飽和脂肪酸轉換為第二種或後續多不飽和脂肪酸。第二種或後續產物多不飽和脂肪酸可以是例如 DGLA 或 ω 3-ETA、ARA, EPA、DPA, DHA 或其組合。在另一個方面，本公開內容涉及用於在宿主細胞中產生多不飽和脂肪酸的方法，其包含步驟a)分離包含選自SEQ ID NO 17和SEQ ID NO 19的核苷酸序列的至少68%或與之互補的核苷酸序列；b)構建包含與調節序列可操作地連接的分離的核苷酸序列的表達載體；c)在足以表達Λ 9-延伸酶和Δ 8-去飽和酶的時間和條件下，將i)表達載體和ii)包含分離的核苷酸序列的至少一種另外的重組DNA構建體引入宿主細胞內，所述分離的核苷酸序列編碼△ 8-去飽和酶且與至少一種調節序列可操作地連接；和d)使所表達的Δ 9-延伸酶和Λ 8-去飽和酶暴露於選自LA、ALA及其組合的底物多不飽和脂肪酸，以便將底物多不飽和脂肪酸轉換為第一種產物多不飽和脂肪酸。第一種產物多不飽和脂肪酸可以是例如DGLA、ω3-ΕΤΑ或其組合。這種方法可以進一步包含使第一種產物多不飽和脂肪酸暴露於至少一種去飽和酶、至少一種另外的延伸酶或其組合的步驟，以便將第一種產物多不飽和脂肪酸轉換為第二種或後續多不飽和脂肪酸。第二種或後續產物多不飽和脂肪酸可以是例如ARA、EPA、DPA、DHA或其組合。在一個方面，這種方法可以進一步包含將重組DNA構建體引入宿主細胞內，所述重組DNA構建體包含與ii)調節序列可操作地連接的i)編碼Λ 5-去飽和酶的分離的核苷酸序列。宿主細胞可以是如上所述的。在另一個方面，本公開內容涉及用於產生轉基因植物的方法，其包含用包含選自SEQ ID Ν0:17和SEQ ID NO :19的核苷酸序列的至少68%或與之互補的至少一種分離的核苷酸序列或其片段轉化植物細胞，且由經轉化的植物細胞再生轉基因植物。植物細胞可以來自選自大豆、芸苔屬物種、紅花、向日葵、玉蜀黍、棉花和亞麻的油料種子植物。在另一個方面，本公開內容涉及得自通過這種方法產生的轉基因植物的種子。還應當指出本文提及的每種核苷酸和胺基酸序列已指定特定序列鑑定編號。引入本文作為參考的序列表(其附於此)列出了每種此類序列及其相應編號。附圖
簡沭
圖I顯示脂肪酸生物合成途徑和Λ 9-延伸酶在這個途徑中的作用。圖2Α和2Β顯示核苷酸序列SEQ ID NO :26和SEQ ID NO :27的比對，其分別是Eug-M07-EL0#10和Eug-M07-EL0#14變體的核苷酸序列，克隆到載體ρΥΧ242飽Bam HI/HindIII位點內，如實施例3中討論的。在變體周圍描繪框。圖 3A 和 3B 顯示來自 Euglermdeses Ehr. CCMP 2916 (Eug-M07-EL0_10) (SEQ IDNO :18)的Δ 9-延伸酶的胺基酸序列與來自小眼蟲gracialis) (SEQ ID NO :4)、球等鞭金藻galbana) (SEQ ID N0:2)的已知Δ 9-延伸酶；小鼠Elovl4延伸酶(登記 # AAG47667 ；SEQ ID NO :21 )、人 EL0VL2 延伸酶(登記 # NP_060240 ；SEQ ID NO:
22)、和秀麗隱杆線蟲(C elegans)延伸酶(登記# AF244356 ；SEQ ID NO :23)的胺基酸序列比對。非變體殘基是加陰影的。圖4A顯示來自鹽生巴夫藻的Δ 9_延伸酶胺基酸序列(登記#AAY15135 ；SEQ ID NO :1)。圖4B顯示來自球等鞭金藻的Λ9-延伸酶胺基酸序列(登記#AF390174;SEQ IDNO :2)。圖4C顯示來自裸藻屬物種5/7.)的Δ 9_延伸酶胺基酸序列(SEQID NO :3)。圖4D顯示來自小眼蟲的Δ 9-延伸酶胺基酸序列(登記# CAT16687 ；SEQ ID NO 4)。圖4E顯不來自anabena熱Δ 9_延伸酶胺基酸序列(SEQ ID NO :5)。圖5A顯示如實施例I中所述獲得的，克隆plate2_M07的核苷酸序列(SEQ ID NO 6)。圖5B顯示如實施例I中所述獲得的，克隆plate2_M07的推導胺基酸序列(SEQ IDNO :7)。圖6A顯示如實施例2中所述獲得的，plate2_M07基因片段假定3』末端的核苷酸序列(SEQ ID NO :13)。圖6B顯示如實施例2中所述獲得的，plate2_M07基因片段假定3』末端的預測胺基酸序列(SEQ ID NO :14和30-32)。SEQ ID NO : 14和30-32由代表終止密碼子的分開。圖6C 顯示 SEQ ID NO :14。圖6D 顯示 SEQ ID NO :30。圖6E 顯示 SEQ ID NO :31。圖6F 顯示 SEQ ID NO :32。圖7A顯示如實施例3中所述獲得的，來自Euglerm deses Ehr. CCMP 2916 (Eug-M07-EL0#10)的假定Λ 9-延伸酶的核苷酸序列(SEQ ID Ν0:17)。圖7Β顯示如實施例3中所述獲得的，通過來自及MmaAAr. CCMP 2916(Eug-M07-EL0#10)的假定Λ 9-延伸酶的核苷酸序列(SEQ ID NO : 17)編碼的預測胺基酸序列(SEQ ID NO :18)。 圖8Α顯示如實施例3中所述獲得的，來自Euglerm deses Ehr. CCMP 2916(Eug-M07-EL0#14)的變體Λ 9-延伸酶的核苷酸序列(SEQ ID Ν0:19)。圖8Β顯示如實施例3中所述獲得的，通過來自及AAr. CCMP 2916(Eug-M07-EL0#14)的變體Λ 9-延伸酶的核苷酸序列(SEQ ID NO : 19)編碼的預測胺基酸序列(SEQ ID NO :20)。圖9A顯示來自小鼠Elovl4延伸酶的胺基酸序列(登記# AAG47667 ；SEQ ID NO 21)。圖9B顯示來自人EL0VL2延伸酶的胺基酸序列(登記# NP_060240 ；SEQ ID NO:22)。圖9C顯示來自秀麗隱杆線蟲延伸酶的胺基酸序列(登記# AF244356 ；SEQ ID NO
23)。公開內容詳述
本公開內容涉及來自類眼蟲屬物種，例如Euglena deses Ehr.,特別是Euglena desesEhr. CCMP 2916的Λ9-延伸酶基因的核苷酸(例如基因)和翻譯的胺基酸序列。此外，本公開內容還包括基因和由基因編碼的酶的使用。例如，基因和相應酶可以用於產生多不飽和脂肪酸例如 ω6-Ε Α、ω 3-EtrA、DGLA、ω 3-ETA, ARA, ΕΡΑ、ω 3_ 二十二碳五烯酸、ω 6- 二十二碳五烯酸、ADA、DHA或其任何組合，其可以加入藥物組合物、營養組合物和其他有價值產物中。定義
如本文使用的，單數形式「一(a、an)」和「該(the) 」包括複數參考，除非上下文另有明確說明。對於本文數目範圍的敘述，明確考慮了具有相同精確度的在其中的每個插入數目。例如對於範圍6-9，除6和9外還考慮了數目7和8，並且對於範圍6. 0-7. O,明確考慮了數目 6. 0,6. 1,6. 2,6. 3,6. 4,6. 5,6. 6,6. 7,6. 8,6. 9 和 7. O。嵌合構建體:如本文使用的，短語「嵌合構建體」指在自然界中通常未發現在一起的核酸分子組合。相應地，嵌合構建體可以包含衍生自不同來源的調節序列和編碼序列，或衍生自相同來源但以與自然界中天然發現的那種不同的方式排列的調節序列和編碼序列。編碼序列:如本文使用的，術語「編碼序列」指編碼特異性胺基酸序列的DNA序列。「調節序列」指這樣的核苷酸序列，其位於編碼序列上遊(5』非編碼序列)、之內或下遊(3』非編碼序列)，並且影響所結合的編碼序列的轉錄、RNA加工或穩定性或翻譯。調節序列可以包括但不限於啟動子、翻譯前導序列、內含子和多腺苷酸化識別序列。互補性:如本文使用的，術語「互補性」指在2個DNA區段之間的關聯性程度。它通過測量在合適條件下，一個DNA區段的有義鏈與另一個DNA區段的反義鏈雜交以形成雙螺旋的能力進行測定。在雙螺旋中，腺嘌呤在一條鏈中出現，胸腺嘧啶在另一條鏈中出現。類似地，無論何處在一條鏈中發現鳥嘌呤，在另一條中發現胞嘧啶。2個DNA區段的核苷酸序列之間的關聯性越大，在2個DNA區段的鏈之間形成雜交雙鏈體的能力越大。由……編碼、雜交和嚴格條件:如本文使用的，短語「由……編碼」指編碼多肽序列的核酸序列，其中所述多肽序列或其部分含有來自由核酸序列編碼的多肽的至少3個連續胺基酸、更優選至少8個連續胺基酸、並且更加優選至少15個連續胺基酸的胺基酸序列。本公開內容還涵蓋分離的核苷酸序列，其編碼具有PUFA延伸酶活性的酶，並且在中等嚴格條件下可與核酸雜交，所述核酸具有包含含有SEQ ID N0:17或SEQ ID NO: 19的核苷酸序列或與之互補的核苷酸序列(圖7A和8A中分別顯示)。當在合適的溫度和離子強度條件下，單鏈形式的核酸分子可以對其他核酸分子退火時，核酸分子是可與另一個核酸分子「雜交的」(參見 Sambrook 等人，Molecular Cloning A Laboratory Manual,Second Edition (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,New York))。溫度和離子強度的條件決定雜交的「嚴格」。「雜交」要求2個核酸含有互補序列。然而，取決於雜交的嚴格，可以出現在鹼基之間的錯配。關於雜交核酸的合適嚴格性取決於核酸的長度和互補程度。此類變量是本領域技術人員眾所周知的。更具體而言，2個核苷酸序列之間的相似性或同源性程度越大，關於具有那些序列的核酸雜交物的Tm值越大。對於長度大於100個核苷酸的雜交物，已衍生用於計算Tm的等式(參見,Sambrook等人，同上)。對於由較短核酸的雜交，錯配的位置變得更重要，並且寡核苷酸的長度決定其特異性(參見，Sambrook等人，同上)。一般地，嚴格條件將是這樣的，其中在pH 7. O - 8. 3鹽濃度小於約I. 5 M Na離子，一般約O. 01 - 1.0 M Na離子濃度(或其他鹽)，並且溫度對於短探針(例如10 - 50個核苷酸)是至少約30°C並且對於長探針(例如大於50個核苷酸)是至少約60°C。嚴格條件還可以伴隨去穩定劑例如甲醯胺的添加來達到。低嚴格條件的例子包括在37°C用30 - 35%甲醯胺、I M NaClU% SDS (十二烷基硫酸鈉)的緩衝溶液雜交，和在50 - 55°C在I X -2 X SSC (20 X SSC=3. O M NaCl/0. 3 M檸檬酸三鈉)中洗滌。中等嚴格條件的例子包括在37°C在 40 - 45% 甲醯胺、I M NaCl、I % SDS 中雜交，和在 55 - 60°C在 O. 5 X - I X SSC中洗滌。高嚴格條件的例子包括在37°C在50%甲醯胺、I M NaCl、l% SDS中雜交，和在60-65°C在 O. I X SSC 中洗滌。外顯子如本文使用的，術語「外顯子」指基因序列的部分，其被轉錄且在衍生自基因的成熟信使RNA中發現，但不一定是編碼最終基因產物的序列部分。表汰、反義抑制和共阻抑如本文使用的，術語「表達」指功能最終產物的產牛。基因的表達涉及基因的轉錄和mRNA翻譯成前體或成熟蛋白質。如本文使用的，短語「反義抑制」指能夠阻抑靶蛋白質表達的反義RNA轉錄物的產生。如本文使用的，術語「共阻抑」指能夠阻抑等同或基本上相似的外源或內源基因表達的有義RNA轉錄物的產生(參見，美國專利號5，231，020)。功能上等價的片段或子片段:在本文中可互換使用的術語「其在功能上等價的片段或子片段」和「功能上等價的片段或子片段」指分離的核酸分子的部分或子序列，其中無論片段或子片段是否編碼活性酶，改變基因表達或產生一些表型的能力都被保留。例如，片段或子片段可以用於設計嵌合構建體，以在經轉化的植物中產生所需表型。通過以相對於植物啟動子序列合適的方向連接核酸片段或其子片段(無論它是否編碼活性酶)，可以設計嵌合構建體用於在共阻抑或反義抑制中使用。基因、天然基因、外源基因和轉基因:如本文使用的，術語「基因」指表達特異性蛋白質的核酸分子，包括在編碼序列前(5』非編碼序列)和後(3』非編碼序列)的調節序列。如本文使用的，短語「天然基因」指如在自然界中發現的具有其自身調節序列的基因。「外源」基因指在宿主生物中通常未發現，但通過基因轉移引入宿主生物內的基 因。外源基因可以包含插入非天然生物內的天然基因或嵌合構建體。如本文使用的，術語「轉基因」指已通過轉化程序引入基因組內的基因。棉屬(Gossypium)物種:如本文使用的，短語「棉屬物種」指木本棉(Gossypiumarboreum)、海島棉(Gossypium barbadense)、草棉(Gossypium herbaceum)、陸地棉(Gossypium hirsutum)、陸地棉陸地變種(Gossypium hirsutum var hirsutum)>Gossypiumhirsutum var marie-galante、Gossypium lapideum、Gossypium sturtianum、Gossypiumthuberi、Gossypium thurberi、夏威夷棉(Gossypium tomentosum)或 Gossypiumtormentosum的任何植物。同源件:術語「同源性」、「同源的」、「基本上相似的」和「基本上對應的」在本文中可互換使用，並且指核酸分子，其中一個或多個核苷酸鹼基中的變化不影響核酸分子介導基因表達或產生一些表型的能力。這些術語還指本公開內容的核酸分子的修飾，例如相對於起始、未經修飾的分子，基本上不改變所得到的核酸分子的功能性質的一個或多個核苷酸的缺失或插入。因此如本領域技術人員應當理解，公開內容涵蓋超過具體示例性序列。宿主細胞:如本文使用的,短語「宿主細胞」意指包含本公開內容的分離的核酸序列或其片段的細胞。宿主細胞可以是原核細胞(例如大腸埃希桿菌{Escherichia coli)、藍細菌和枯草芽孢桿菌(MacilIus或真核細胞(例如真菌、昆蟲、植物或哺乳動物細胞)。可以使用的真菌細胞的例子是酵母菌屬物種spp.)、假絲酵母屬物種spp.)、油脂酵母屬物種spp.)、耶氏酵母屬spp·)、克魯維酵母屬物種焊ces spp.)、漢遜酵母屬物種(Zfeflse/w/a spp.)、麴黴菌屬物種 spp.)、青黴菌屬物種spp.)、鏈抱黴屬物種
spp.)、木黴菌屬物種spp.)和畢赤酵母屬物種OcYcAia spp·)。特別優選的真菌細胞是釀酒酵母iSaccharomyces cerevisiae)。植物細胞可以是單子葉或雙子葉植物細胞。特別優選的植物細胞來自油料種子植物例如大豆(67_Fci/ e ffiar)(例如大豆)、芸苔屬物種、紅花(CkriAasMAs tinctorius L.)(例如紅花)、葵花annuus )(例如向日葵)、玉蜀黍(Zea mays)(例如玉蜀黍)、棉屬物種(棉花)和亞麻(Zi皿》usitatissimum)(例如亞麻)。
同一性、序列同一性和序列同一性百分率(％同一性)當在核苷酸或多肽序列的背景中使用時，在本文中可互換使用的術語「同一性」或「序列同一性」指，當在指定比較窗上就最大限度對應比對時，在2個序列中相同的核酸鹼基或胺基酸殘基。因此，同一性定義為在2個DNA或多肽區段的相同鏈(有義或反義)之間的一致性、對應或等價程度。「序列同一性百分率」或同一性」通過下述進行計算在特定區域上比較2個最佳比對的序列，測定在其上等同鹼基在2個序列中出現的位置數目，以便獲得匹配位置數目，將此類位置數目除以待比較的區段中的總位置數目，並且將結果乘以100。序列的最佳比對可以通過下述進行計算Smith & Waterman, AppI. Math. 2:482 (1981)的算法，Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)的算法，Pearson & Lipman,Proc. Natl. Acad. Sci· (USA) 85:2444 (1988)的方法和實現相關算法的電腦程式(例如 Higgins 等 A, CABI OS. 5L151-153 (1989))、FASTDB (Intelligenetics)、BLAST (National Center for Biomedical Information ；Altschul 等人，Nucleic AcidsResearch 25:3389-3402 (1997))、PILEUP (Genetics Computer Group, Madison, WI)或GAP、BESTFIT、FASTA 和 TFASTA (Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0，Genetics Computer Group, Madison, WI)。(參見，美國專利號 5，912，120)。序列同一 性百分比的有用例子包括但不限於 68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 %,92%,93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。這些同一性可以使用本文描述的任何程序進行測定。間接或肓接地:如本文使用的，當與基因及其相應酶在多不飽和脂肪酸產生中的使用結合使用時，術語「間接地」涵蓋這樣的情況，其中第一種酸通過第一種酶(例如通過例如Λ 9-延伸酶的LA至《6-EDA)轉換為第二種酸(即途徑中間產物)，且隨後第二種酸通過使用第二種酶轉換為第三種酸(例如通過例如Λ8-去飽和酶的co6-EDA至DGLA)。如本文使用的，當與基因及其相應酶在多不飽和脂肪酸產生中的使用結合使用時，術語「直接地」涵蓋其中酶直接將第一種酸轉換為第二種酸的情況，其中第二種酸隨後用於組合物中(例如通過例如Λ 9-延伸酶的LA至ω 6-EDA轉換，或通過例如Λ 8_去飽和酶的 co3_ETrA 至 ω3_ΕΤΑ 轉換)。內含子如本文使用的，術語「內含子」指在基因中不編碼蛋白質序列部分的間插序列。因此，此類序列被轉錄成RNA且隨後被切除並且不翻譯。該術語還用於被切除的RNA序列。分離的:如本文使用的，術語「分離的」指使用本領域已知的常規技術，從其天然存在的環境或來源中取出的核酸分子(DNA或RNA)或蛋白質或其生物學活性部分(例如從細菌、藻類、真菌、植物、脊椎動物、哺乳動物等中)。分離的核酸分子或蛋白質實質上或基本上不含通常伴隨在其天然存在的環境中的核酸分子或蛋白質或與之相互作用的組分。分離的核酸片段或分離的核酸序列:如本文使用的，短語「分離的核酸片段」或「分離的核酸序列」指RNA或DNA的聚合物，其是單鏈或雙鏈的，任選含有合成、非天然或改變的核苷酸鹼基。DNA聚合物形式的分離的核酸片段可以由cDNA、基因組DNA或合成DNA的一個或多個區段組成。(指定多核苷酸的「片段」指這樣的多核苷酸序列，其包含與指定核苷酸序列的區域等同或互補的大概至少約6個連續核苷酸、優選至少約8個連續核苷酸、更優選至少約10個連續核苷酸、至少約15個連續核苷酸、至少約20個連續核苷酸、至少約25個連續核苷酸等的鄰接序列)。核苷酸(通常以其5』單磷酸形式發現)通過其單字母指名如下提及「A」用於腺苷酸或脫氧腺苷酸(分別用於RNA或DNA)，「C」用於胞苷酸或脫氧胞苷酸，「 G」用於鳥苷酸或脫氧鳥苷酸，「U」用於尿苷酸，「T」用於脫氧胸苷酸，「R」用於嘌呤(A或G)，「Y」用於嘧啶(C或T)，「K」用於G或T，「H」用於A或C或T，「I」用於肌苷，和「N」用於任何核苷酸。成熟的和前體:如本文使用的，當與術語「蛋白質」結合使用時，術語「成熟的」指翻譯後加工的多肽；即初級翻譯產物中存在的任何前或原肽已從其中去除的那種。如本文使用的，當與術語「蛋白質」結合使用時，術語「前體」指mRNA的初級翻譯產物；即仍存在前和原肽。前和原肽可以是但不限於細胞內定位信號。3』非編碼序列:如本文使用的，短語「3』非編碼序列」指位於編碼序列下遊且包括多腺苷酸化識別序列和其他序列的DNA序列，所述其他序列編碼能夠影響mRNA加工或基因表達的調節信號。多腺苷酸化信號通常特徵在於影響多腺苷酸束對於mRNA前體的3』末端的添加。不同3』非編碼序列的使用由Ingelbrecht等人，(1989)/7a/ i Cell 1:671 680 示例。非天然存在的:如本文使用的，短語「非天然存在的」指其為人工的，與自然界中天然發現的那種不一致的某物。可操作地連接的:如本文使用的，短語「可操作地連接的」指核酸序列在單個核酸分子上的結合，從而使得一個的功能由另一個調節。例如，當啟動子能夠調節編碼序列的表達時(即，編碼序列在啟動子的轉錄控制下)，啟動子與該編碼序列是可操作地連接的。編碼序列可以以有義或反義方向與調節序列可操作地連接。在另一個例子中，公開內容的互補RNA區可以直接或間接地在靶mRNA 5』、或靶mRNA 3』，或在靶mRNA內可操作地連接，或第一個互補區對於靶mRNA是5』並且其互補體是3』。植盤如本文使用的，術語「植物」指全植物、植物器官、植物組織、種子、植物細胞、種子及其後代。植物細胞包括但不限於來自種子、懸浮培養、胚胎、分生組織區域、愈傷組織、葉、根、枝條、配子體、孢子體、花粉和小孢子的細胞。聚合酶鏈反應或PCR :如本文使用的，短語「聚合酶鏈反應」或「PCR」指用於合成大量特異性DNA區段的技術，由一系列重複循環組成(Perkin Elmer Cetus Instruments,Norwalk, CT)0 一般地，使雙鏈DNA熱變性，使與靶區段的3』邊界互補的2個引物在低溫退火，且隨後在中間溫度延伸。一組這3個連續步驟被稱為一個循環。PCR是在短時間段中，通過模板的反覆複製，用於將DNA擴增數百萬倍的有力技木(Mwllis 等}\，Cold Spring Harbor Sytnp. Quant. Biol. 51:263 273 (1986) ；Erlich等人，歐洲專利申請50，424 ;歐洲專利申請84，796 ;歐洲專利申請258，017,歐洲專利申請237，362 ;Mullis，歐洲專利申請 201，184，Mullis 等人美國專利號 4，683，202 ;Erlich，美國專利號4，582，788 ;和Saiki等人，美國專利號4，683，194)。該過程利用特異性體外合成的寡核苷酸組，以引發DNA合成。引物的設計取決於希望進行分析的DNA的序列。該技術通過在高溫使模板解鏈，允許引物對模板內的互補序列退火且隨後用DNA聚合物複製模板的許多循環(通常20 50)執行。PCR反應的產物通過在瓊脂糖凝膠中分離隨後為溴化乙啶染色和用UV透視顯現進行分析。可替代地，放射性dNTP可以加入PCR中，以便將標記摻入產物內。在這種情況下,通過使凝膠暴露於X射線膠片顯現PCR的產物。放射性標記的PCR產物的附加優點是可以定量個別擴增產物的水平。啟動子和增強子如本文使用的，術語「啟動子」指能夠控制編碼序列或功能RNA表達的DNA序列。啟動子序列由近端和更遠端的上遊元件組成，後一元件通常被稱為增強子。如本文使用的，術語「增強子」指這樣的DNA序列，其可以刺激啟動子活性，並且可以是啟動子的先天性元件或插入以增強啟動子的水平或組織特異性的異源元件。啟動子序列還可以位於基因的轉錄部分內和/或轉錄序列的下遊。啟動子可以以其整體衍生自天然基因，或可以由衍生自在自然界中發現的不同啟動子的不同元件組成，或甚至包含合成DNA區段。本領域技術人員應當理解不同啟動子可以指導在不同組織或細胞類型中、或在不同發育階段或響應不同環境條件的基因表達。引起基因在大多數時間在大多數細胞類型中表達的啟動子通常被稱為「組成型啟動子」。在植物細胞中有用的多個類型的新啟動子不斷被開發；眾多例子可以在由 Okamuro 和 Goldberg, (.l^^Biochemistry of Plants 15:1 82的彙編中發現。進一步認識到因為在大多數情況下，調節序列的確切邊界並未完全限定，所 以某些變異的DNA分子可以具有等同啟動子活性。重組體如本文使用的，術語「重組體」指例如通過化學合成或通過由基因工稈技術進行核酸分離區段的操作，2個否則分離的序列區段的人工組合。重組構津體、表汰構津體和重組表汰構津體:短語「重組構建體'「表達構建體」和「重組表達構建體」在本文中可互換使用，並且指遺傳材料的功能單位，其可以使用本領域技術人員眾所周知的標準方法插入細胞的基因組內。此類構建體可以是其自身或可以與載體結合使用。如果使用載體，那麼載體的選擇取決於將用於轉化宿主植物的方法，如本領域技術人員眾所周知的。例如，可以使用質粒載體。技術人員充分知道必須存在於載體上的遺傳元件，以便成功轉化、選擇且繁殖包含公開內容的任何分離的核酸分子的宿主細胞。技術人員還將認識到不同獨立轉化事件將導致表達的不同水平和模式(Jones等人，(1985 沿J. 4:2411 2418 ；De Almeida 等人，(1989)#ο7· Gen. Genetics 218:78 86)，並且因此必須篩選多重事件，以便獲得展示出所需表達水平和模式的品系。此類篩選可以通過DNA的DNA分析、mRNA表達的RNA分析、蛋白質表達的蛋白質分析或表型分析完成。RNA轉錄物、信使RNA、cDNA、功能RNA和內源RNA :如本文使用的，短語「RNA轉錄物」指起因於RNA聚合酶催化的DNA序列轉錄的產物。當RNA轉錄物是DNA序列的完全互補拷貝時，它被稱為初級轉錄物，或它可以是衍生自初級轉錄物的轉錄後加工的RNA序列，並且被稱為成熟RNA。如本文使用的，短語「信使RNA (mRNA)」指不含內含子且可以通過細胞翻譯成蛋白質的RNA。如本文使用的，術語「cDNA」指與mRNA模板互補且使用酶逆轉錄酶由mRNA模板合成的DNA。cDNA可以是單鏈的或使用DNA聚合酶I的Klenow分子轉換成雙鏈形式。「有義」RNA指包括mRNA且可以在細胞內或在體外翻譯成蛋白質的RNA轉錄物。「反義RNA」指與靶初級轉錄物或mRNA的全部或部分互補且阻斷靶基因表達的RNA轉錄物(美國專利號5，107，065)。反義RNA的互補性可以是對於特異性基因轉錄物的任何部分，即在5』非編碼序列、3』非編碼序列、內含子或編碼序列。
如本文使用的，短語「功能RNA」指反義RNA、核酶RNA、或可以不翻譯但仍對細胞過程具有作用的其他RNA。術語「互補體」和「反向互補體」在本文中就mRNA轉錄物而言是可互換使用的，並且意欲定義信使的反義RNA。如本文使用的，短語「內源RNA」指在用本公開內容的重組構建體轉化前，由宿主的基因組中存在的任何核酸序列編碼的任何RNA，無論是天然存在還是非天然存在的，即通過重組方法、誘變等引入的。相似性當指的是2個胺基酸序列、蛋白質或多肽之間的「相似性」時，術語「相似性」指2個序列中一系列等同以及保守胺基酸殘基的存在。2個胺基酸序列之間的相似性程度越高，2個序列的對應、一致性或等價性越高。穩定轉化、瞬時轉化和轉化:如本文使用的，短語「穩定轉化」指核酸分子轉移到宿主生物的基因組內，包括核和細胞器基因組，導致遺傳上穩定的繼承。 相比之下，如本文使用的，短語「瞬時轉化」指核酸分子轉移到宿主生物的核或含DNA細胞器內，導致基因表達而無整合或穩定繼承。含有經轉化的核酸分子的宿主生物被稱為「轉基因」生物。稻、玉米和其他單子葉植物的細胞轉化優選方法是使用粒子加速或「基因槍」轉化技術(Klein 等人，(1987>Vaitfre (London)327:70 73 ;美國專利號 4，945，050)，或使用含轉基因的合適Ti質粒的土壤桿菌屬介導的方法(Ishida Y.等人，(1996)M itfreBiotech. 14:745 750)。如本文使用的，術語「轉化」指穩定轉化和瞬時轉化。翻譯前導序列:如本文使用的，短語「翻譯前導序列」指位於基因的啟動子序列和編碼序列之間的DNA序列。翻譯前導序列存在於翻譯起始序列上遊的完全加工的mRNA。翻譯前導序列可以影響初級轉錄物至mRNA的加工、mRNA穩定性或翻譯效率。翻譯前導序列的例子已得到描述(Turner, R.和 Foster, G. D. (1995) Molecular Biotechnology3:225)。本文引用的所有專利、專利申請和優先權文件在此整體引入作為參考。A 9~延伸酶基因和由此編碼的酶
由本公開內容的Λ 9-延伸酶基因編碼的酶是經由替代Λ 8-去飽和酶/ Λ 9-延伸酶途徑，具有長度20個或更多個碳的長鏈多不飽和脂肪酸(LC-PUFA)產生中必需的。分離的Euglena deses Ehr. CCMP 2916 Δ 9-延伸酶基因的核苷酸序列顯示於圖7A中，並且相應蛋白質的預測胺基酸序列顯示於圖7B中。使用Λ 9-延伸酶和Λ 8-去飽和酶的LA至DGLA和ALA至ω 3-ΕΤΑ轉換被稱為替代Λ 8-去飽和酶/ Λ 9-延伸酶途徑。用於將LA轉換為DGLA和ALA轉換為ω 3-ΕΤΑ的常規Δ 6途徑分別利用Λ 6-去飽和酶，以將LA轉換為GLA和ALA轉換為SDA，和Λ 6-延伸酶，以將GLA轉換為DGLA和SDA轉換為ω 3-ΕΤΑ。在任一途徑中，ARA或EPA的產生隨後通過例如Λ 5-去飽和酶催化。例如，DHA可以在EPA至ω 3_ 二十二碳五烯酸(DPA)和ω3_ 二十二碳五烯酸至DHA的轉換後產生，分別利用例如Λ 5-延伸酶和Λ 4-去飽和酶。儘管例如DGLA、co3-ETA、ARA、EPA、ω 3- 二十二碳五烯酸、ω6_ 二十二碳五烯酸、ADA和/或DHA可以經由替代Λ 8-去飽和酶/ Λ 9-延伸酶途徑或常規Λ 6途徑產生，但在一些情況下，替代Λ 8-去飽和酶/ Λ 9-延伸酶途徑可以優選超過常規Λ 6途徑。例如，如果特定殘留ω -6或ω -3脂肪酸中間產物例如GLA或SDA在DGLA、ω 3-ETA, ARA, EPA,ω 3- 二十二碳五烯酸、ω 6- 二十二碳五烯酸、ADA和/或DHA的產生過程中是不需要的，那麼替代Λ8-去飽和酶/Λ9-延伸酶途徑可以用作常規Λ 6途徑的替代物，以繞過GLA和SDA形成。如上所述，Δ 9-延伸酶是替代Δ 8-去飽和酶/ Λ 9-延伸酶途徑中的必需酶。例如，如果沒有Λ 9-延伸酶基因和由此編碼的酶，EPA無法經由替代Λ 8-去飽和酶/ Λ 9-延伸酶途徑合成。如圖I中所示，本公開內容的分離的Λ 9-延伸酶將例如ALA轉換為co3-ETrA和LA轉換為ω 6-EDA。來自ω 3-ETrA的ω 3-ΕΤΑ和來自ω 3-ΕΤΑ的EPA產生隨後分別通過例如Λ 8-去飽和酶和Λ 5-去飽和酶催化。由於使用替代Λ 8-去飽和酶/ Λ 9-延伸酶途徑，中間產物GLA和SDA脂肪酸被繞過。應當指出本公開內容還涵蓋具有這樣的序列的核苷酸序列(和相應的編碼蛋白質)，所述序列包含在序列(即與之具有序列同一性)SEQ ID NO ,Euglena deses Ehr.CCMP 2916的Λ 9-延伸酶基因的分離的核苷酸序列)或SEQ ID NO 19 (.^,Euglena desesEhr. CCMP 2916 的變體 Λ 9-延伸酶基因)中的至少 68 %、69 %、70 %、71 %、72 %、73 %、 74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 核苷酸、或由其組成或與之互補。此類序列可以來自人來源以及其他非人來源(例如秀麗隱杆線蟲或小鼠)。此外，本公開內容還涵蓋包含SEQ ID NO 17 (顯示於圖7Α中)或SEQ ID NO 19(顯示於圖8Α中))的核苷酸序列或由其組成的片段和衍生物，以及來自其他來源且具有上述互補性或對應的序列。上述序列的功能等價物(即具有△ 9-延伸酶活性的序列)也由本公開內容涵蓋。衍生自SEQ ID NO :17或SEQ ID NO 19的片段可以具有這樣的長度，其包含10 -約780個核苷酸、10 -約700個核苷酸、10 -約650個核苷酸、10 -約500個核苷酸、10-約250個核苷酸、10 -約100個核苷酸、10 -約50個核苷酸、或15 - 40個核苷酸，或由其組成。在一個方面，SEQ ID Ν0:17和SEQ ID NO :19的片段編碼具有Λ9-延伸酶活性的多肽。在另一個方面，SEQ ID Ν0:17和SEQ ID NO :19的片段可以用作引物和探針。製備引物和探針的方法是本領域技術人員眾所周知的。此類引物和探針可以具有10 - 50個核苷酸、優選15-40個核苷酸的長度。本文還考慮了 SEQ ID Ν0:17或SEQ ID NO :19的核苷酸序列的變體。此類變體可以含有一個或多個鹼基對添加、置換或缺失。由本公開內容涵蓋的SEQ ID Ν0:17的核苷酸變體的非限制性例子顯示於下表A中。SEQ ID NO: 17的變體的一個具體例子是SEQ IDNO 19 (參見圖 8Α)。表A
權利要求
1.ー種包含分離的核苷酸序列或與所述分離的核苷酸序列互補的分離的核酸分子或其片段，所述分離的核苷酸序列編碼具有延伸酶活性的多肽，其中所述多肽的胺基酸序列與選自SEQ ID NO 18和SEQ ID NO 20的胺基酸序列具有至少68%序列同一性。
2.ー種包含選自SEQ ID N0:17和SEQ ID NO :19的核苷酸序列的至少68%或與之互補的分離的核苷酸序列或其片段。
3.權利要求I或2的分離的核苷酸序列，其中所述分離的核苷酸序列編碼利用多不飽和脂肪酸作為底物的功能上活性的延伸酶。
4.權利要求I或2的分離的核苷酸序列，其中所述分離的核苷酸序列來自類眼蟲屬物ft KEuglenoid sp.)。
5.權利要求4的分離的核苷酸序列，其中所述分離的核苷酸序列來自EngIenadesesEhr. CCMP 2916。
6.ー種純化多肽，其由權利要求I或2的分離的核苷酸序列編碼。
7.ー種純化多肽，其延伸在碳9位置上含有不飽和的多不飽和脂肪酸，且與選自SEQID NO 18和SEQ ID NO 20的胺基酸序列具有至少68%胺基酸同一性。
8.—種表達載體，其包含與調節序列可操作地連接的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包含選自SEQ ID NO 17和SEQ ID NO 19的核苷酸序列的至少68%或與之互補。
9.ー種宿主細胞,其包含權利要求8的表達載體。
10.權利要求9的宿主細胞，其中所述宿主細胞選自真核細胞和原核細胞。
11.權利要求10的宿主細胞，其中所述真核細胞選自哺乳動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞和真菌細胞。
12.權利要求11的宿主細胞，其中所述植物細胞來自選自下述的油料種子植物大豆、芸苔屬物種、紅花、向日葵、玉蜀黍、棉花和亞麻。
13.—種包含權利要求8的表達載體的植物細胞、植物種子、植物或植物組織，其中所述表達載體的核苷酸序列的表達導致通過所述植物細胞、植物種子、植物或植物組織產生至少ー種多不飽和脂肪酸。
14.權利要求13的植物細胞、植物種子、植物或植物組織，其中所述多不飽和脂肪酸選自(0 6-ニ十碳ニ烯酸(《640ム)、^^-ニ十碳三烯酸ぐ^^ィむム彡及其組合。
15.一種產生A 9-延伸酶的方法，所述方法包含步驟 a)分離包含選自SEQID NO 17和SEQ ID NO 19的核苷酸序列的至少68%或與之互補的核苷酸序列； b)構建包含與ii)調節序列可操作地連接的i)分離的核苷酸序列的表達載體；和 c)在足以產生A9-延伸酶的時間和條件下，將所述表達載體引入宿主細胞內。
16.權利要求15的方法，其中所述宿主細胞選自真核細胞和原核細胞。
17.權利要求16的方法，其中所述真核細胞選自哺乳動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞和真菌細胞。
18.權利要求17的方法，其中所述植物細胞來自選自大豆、芸苔屬物種、紅花、向日葵、玉蜀黍、棉花和亞麻的油料種子植物。
19.一種用於產生多不飽和脂肪酸的方法，其包含步驟 a)分離包含選自SEQ ID NO 17和SEQ ID NO 19的核苷酸序列的至少68%或與之互補的核苷酸序列； b)構建包含與ii)調節序列可操作地連接的i)分離的核苷酸序列的表達載體； c)在足以表達A9-延伸酶的時間和條件下，將所述表達載體引入宿主細胞內；和 d)使所表達的A9-延伸酶暴露於底物多不飽和脂肪酸，以便將所述底物多不飽和脂肪酸轉換為第一種產物多不飽和脂肪酸。
20.權利要求19的方法，其中所述底物多不飽和脂肪酸是亞油酸(LA)，並且所述第一種產物多不飽和脂肪酸是《6- 二十碳ニ烯酸((0 6-EDA)。
21.權利要求19的方法，其中所述底物多不飽和脂肪酸是^-亞麻酸(41^)，並且所述第一種產物多不飽和脂肪酸是《3- 二十碳三烯酸(《3-ETrA)。
22.權利要求19的方法，其進ー步包含使所述第一種產物多不飽和脂肪酸暴露於至少ー種去飽和酶、至少ー種另外的延伸酶或其組合的步驟，以便將所述第一種產物多不飽和脂肪酸轉換為第二種或後續產物多不飽和脂肪酸。
23.權利要求22的方法，其中所述第二種或後續產物多不飽和脂肪酸選自ニ高Y-亞麻酸(DGLA)、(0 3-ニ十碳四烯酸(《34了4)、花生四烯酸(ム狀)、ニ十碳五烯酸ぴ 八)、二十ニ碳五烯酸(DPA)、二十ニ碳六烯酸(DHA)及其組合。
24.一種用於在宿主細胞中產生多不飽和脂肪酸的方法，其包含步驟 a)分離包含選自SEQID NO 17和SEQ ID NO 19的核苷酸序列的至少68%或與之互補的核苷酸序列； b)構建包含與ii)調節序列可操作地連接的i)分離的核苷酸序列的表達載體； c)在足以表達A9-延伸酶和A8-去飽和酶的時間和條件下，將i)表達載體和ii)包含分離的核苷酸序列的至少ー種另外的重組DNA構建體引入宿主細胞內，所述分離的核苷酸序列編碼AS-去飽和酶且與至少ー種調節序列可操作地連接；和 d)使所表達的A9-延伸酶和A 8-去飽和酶暴露於選自亞油酸(LA)、a-亞麻酸(ALA)及其組合的底物多不飽和脂肪酸，以便將所述底物多不飽和脂肪酸轉換為第一種產物多不飽和脂肪酸。
25.權利要求24的方法，其中所述第一種產物多不飽和脂肪酸選自ニ高Y-亞麻酸(DGLA)、(0 3-ニ十碳四烯酸(《34了ム)及其組合。
26.權利要求24的方法，其進ー步包含使所述第一種產物多不飽和脂肪酸暴露於至少ー種另外的去飽和酶或至少ー種另外的延伸酶的步驟，以便將所述第一種產物多不飽和脂肪酸轉換為第二種或後續多不飽和脂肪酸。
27.權利要求26的方法，其中所述第二種或後續多不飽和脂肪酸選自花生四烯酸(ARA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十ニ碳五烯酸(DPA)、二十ニ碳六烯酸(DHA)及其組合。
28.權利要求24的方法，其中所述宿主細胞選自原核細胞和真核細胞。
29.權利要求28的方法，其中所述真核細胞選自哺乳動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞和真菌細胞。
30.權利要求29的方法，其中所述植物細胞來自選自大豆、芸苔屬物種、紅花、向日葵、玉蜀黍、棉花和亞麻的油料種子植物。
31.權利要求24的方法，其進ー步包含將重組DNA構建體引入所述宿主細胞內，所述重組DNA構建體包含與ii)調節序列可操作地連接的i)編碼A 5-去飽和酶的分離的核苷酸序列。
32.一種用於產生轉基因植物的方法，其包含用權利要求2的至少ー種分離的核苷酸序列或其片段轉化植物細胞，且由所述經轉化的植物細胞再生轉基因植物。
33.權利要求32的方法，其中所述植物細胞來自選自大豆、芸苔屬物種、紅花、向日葵、玉蜀黍、棉花和亞麻的油料種子植物。
34.ー種轉基因種子，其得自通過權利要求32的方法製備的轉基因植物。
35.ー種轉基因種子,其包含權利要求8的表達載體。
全文摘要
本公開內容涉及編碼Δ9-延伸酶的分離的多核苷酸，由分離的多核苷酸編碼的Δ9-延伸酶，包含分離的多核苷酸的表達載體，包含表達載體的宿主細胞，和用於產生Δ9-延伸酶和多不飽和脂肪酸的方法。
文檔編號C12N9/02GK102782124SQ201080041384
公開日2012年11月14日 申請日期2010年7月14日 優先權日2009年7月17日
發明者P.克裡什南, P.穆克吉, S.佩雷拉, T.達斯 申請人:雅培製藥有限公司