一種用於痕量汞離子檢測的酶基電化學生物傳感方法

2023-12-10 05:18:46 1

一種用於痕量汞離子檢測的酶基電化學生物傳感方法
【專利摘要】本發明為一種用於痕量汞離子檢測的酶基電化學生物傳感方法，屬於環境分析領域。本發明利用胸腺嘧啶與汞離子特異性作用和核苷酸外切酶Ⅲ循環放大功能實現對痕量汞離子檢測。探針DNA與目標DNA通過捕獲汞離子雜交形成特殊結構的雙鏈DNA，結果pDNA被ExoⅢ消化，而tDNA游離出繼續與其他的pDNA雜交並重複上述過程。消化後殘留pDNA與[Ru(NH3)6]3+電信號強度成正比，故可實現對汞離子檢測。本發明的酶基電化學生物傳感方法具有靈敏度高、選擇性高、成本低等特點，對汞離子檢測線性範圍為0.01-500nM，檢測限為1pM。
【專利說明】—種用於痕量汞離子檢測的酶基電化學生物傳感方法

【技術領域】
[0001]本發明屬於環境分析領域，涉及一種用於痕量汞離子檢測的酶基電化學生物傳感方法。

【背景技術】
[0002]作為一種非必需元素，汞離子能對人體組織和內臟器官產生永久性的傷害[Bontidean I, Mortari A, Leth S，Brown N L, Karlson U, Larsen M M, VangronsveldJ, Corbisier P, Csoregi E.Environ.Pollut., 2004, 131 (2), 255-262]。汙水中的萊離子一旦通過食物鏈間進入人體後，人體自身的新陳代謝系統很難將其排出體外[Yu C J, Cheng TL, Tseng W L.B1sens.B1electron.2009, 25 (I): 204-210]。就萊離子的毒性而言，即使人體長期暴露在較低濃度汞源中，也能產生可遺傳的毒性。因此開發新型簡單的檢測方法以便高效地檢測痕量的汞離子是一件非常有意義的工作。
[0003]傳統的汞離子檢測方法主要為原子吸收或發射光譜、螢光分析、誘導耦合等離子體質譜、X射線吸收光譜等。然而每種方法至少有如下缺點之一:設備昂貴、方法複雜、穩定性差、耗時、靈敏度不高、選擇性一般。最近報導的一些傳感方法對汞離子檢測具有較好的靈敏度，但是這些方法主要集中在光傳感技術上，而光傳感技術嚴重依賴於複雜的設備和嚴格的操作技能。
[0004]作為最具潛力的檢測技術之一，電化學生物傳感器在汞離子檢測方面具有獨特的優勢。因為這種技術所需設備簡單、耗時少、成本低，而且可實現實時原位分析。特別是，汞離子能特異性與兩個胸腺嘧啶鹼基作用形成T-Hg2+-T絡合物，為開發高選擇性高靈敏度的檢測汞離子的電化學生物傳感器奠定了基礎。為了達到此目標，當前主要有三種信號放大方法來提高電化學生物傳感器對汞離子檢測的靈敏度，即納米材料[Zhang Y, Zhao
H,Wu Z, Xue Y, Zhang X, He Y, Li X, Yuan Z.B1sens.B1electron., 2013, 48, 180-187.] >酶[Dominguez-Renedo 0, Alonso-Lomillo M A, Ferreira-Goncalves L,Arcos-MartinezM J, Talanta, 2009，79 (5)，1306-1310.]、DNA 結構轉變[ffu D, Zhang Q, Chu X，Wang H, ShenG, Yu R, B1sens.B1electron.，2010，25 (5)，1025-1031.]。其中酶作為一種特異性和高效性的催化劑，被廣泛應用於電化學生物傳感器的構建，去監測食品和環境安全[A.Amine，H.Mohammadi,1.Bourais, G.Palleschi, B1sens.B1electron., 2006, 21 (8), 1405-1423.]。但是目前酶基電化學生物傳感器對汞離子檢測的研究很少，並且用於構建電化學生物傳感器的酶主要集中在鏈黴親和素-過氧化氫酶(HRP)和脲酶，而這兩種酶基電化學生物傳感器對汞離子的最低檢出限遠高於另外兩種(基於納米材料或DNA結構轉變)電化學生物傳感器的最低檢出限。因此篩選新的高效酶和設計新的檢測方法是構建用於汞離子檢測的高選擇性高靈敏度的酶基電化學生物傳感器的關鍵。


【發明內容】

[0005]發明的目的:本發明的目的通過篩選新的酶體系和設計新的檢測路線，利用T-Hg2+-T特異性作用和核苷酸外切酶III (Exo III)循環放大效應的協同作用，在保證對汞離子的高選擇性的前提下，極大地提高酶基電化學生物傳感器的靈敏度。
[0006]本發明的技術方案是:
[0007]本發明提供了一種用於痕量汞離子檢測的酶基電化學生物傳感方法，包括如下步驟:
[0008](I)將10-20 μ L的含有I μ M的探針DNA(pDNA)的孵化緩衝液滴加到清潔後的金電極表面,在4°C下孵化24小時，即得到pDNA修飾後的金電極(pDNA/Au);其中，pDNA的孵化緩衝液的成分為:0.1M NaCl、10 μ M三(2-羧乙基)膦(TCEP)和pH = 7.4的1mM三(羥甲基)氨基甲烷緩衝液(Tris-HCl)。
[0009](2)將步驟⑴得到的pDNA/Au浸入到6_巰基己_1_醇(MCH)緩衝溶液中，保持
1-2小時，用於減少pDNA在金電極表面的非特異性地吸附，即得到處理後的pDNA/Au。其中，MCH緩衝溶液的成分為l-5mM MCH和pH = 7.4的1mM Tris-HCl。
[0010](3)將經過步驟⑵處理後的pDNA/Au用pH = 7.4的Tris-HCl淋洗，再浸入含有濃度不大於10 μ M汞離子的核苷酸外切酶III (Exo III)消化緩衝液中，在37-40°C恆溫水浴中反應10-30分鐘，即得到消化後的pDNA/Au電極。其中，Exo III消化緩衝液的成分為pH =8 的 50mM Tris-HCl、5mM MgCl2、ImM 二硫蘇糖醇(DTT)、0.1-1 μ M tDNA、1.8units/μ L ExoIII和 0.2-0.6Μ NaCl。
[0011](4)將步驟(3)得到的消化後的pDNA/Au電極浸入含有pH = 7.0的1mM Tris-HCl和50 μ M氯化六氨合釕(Ru (NH3)63+或RuHex)電解質溶液中，利用方波伏安(SWV)進行測試並分析結果。測試參數為:初始電壓-0.6V，終止電壓0V，頻率25Hz。由於靜電作用，帶正電的Ru (NH3) 63+會強烈的吸附到帶負電pDNA的磷酸骨架上，並被還原為Ru (NH3) 62+，因此產生電信號。由於電信號的強度與被Exo III消化後殘餘的pDNA量成正比，所以能實現對溶液中汞離子的檢測。
[0012]所述的探針DNA為5』端巰基修飾的單鏈核苷酸。
[0013]與pDNA雜交的互補鏈tDNA是具有4個胸腺嘧啶失配的單鏈核苷酸，其鹼基數比pDNA的鹼基數至少多5個。
[0014]步驟⑴中金電極在使用前需要清潔，具體方法如下:
[0015]將金電極分別在I μ m、0.3 μ m和0.05 μ m粒徑的氧化鋁拋光粉的懸浮液中依次研磨5-10分鐘，每次研磨後分別用乙醇和高純水超聲清洗5分鐘，待電極乾燥後，浸入體積比為3:1的濃硫酸和雙氧水的混合溶液中保持30分鐘,然後用高純水清洗,作為工作電極浸入0.5M的H2SO4溶液中，進行循環伏安掃描，直到掃描曲線穩定，最後用高純水清洗並用N2吹乾。
[0016]本發明具有如下效果:
[0017](I)靈敏度高，檢測限可達IpM(S/N = 3)。
[0018](2)選擇性高，噪聲值低。
[0019](3)成本低和操作簡單，利用普通的恆電位儀掃描和分析即可，不需要複雜昂貴的大型設備，而且避免納米材料基電化學生物傳感器的繁瑣的材料製備過程。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1是本發明所述的一種用於痕量汞離子檢測的酶基電化學生物傳感方法的檢測過程示意圖。
[0021]圖2是本發明所構建的酶基電化學生物傳感方法對不同濃度的汞離子的SWV響應圖。
[0022]圖3A為不同濃度的汞離子與其SWV峰電流的關係圖。
[0023]圖3B為不同濃度的汞離子與其SWV峰電流的線性範圍圖(0.01_500nM範圍內R2=0.9987)。
[0024]圖4為所構建的酶基電化學生物傳感方法對汞離子的選擇性測試圖(圖中金屬離子濃度均為10 μ Μ，其電流值是通過SWV測定所得)。
[0025]圖中:a為OnM汞離子的SWV響應圖；b為0.002nM汞離子的SWV響應圖；c為
0.0lnM汞離子的SWV響應圖；d為0.05nM汞離子的SWV響應圖；e為0.5nM汞離子的SWV響應圖；f為5nM汞離子的SWV響應圖；g為50nM汞離子的SWV響應圖；h為500nM汞離子的SWV響應圖；i為1000nM汞離子的SWV響應圖。

【具體實施方式】
[0026]以下結合附圖和技術方案，進一步說明本發明的【具體實施方式】。
[0027]本發明涉及一種用於痕量汞離子檢測的酶基電化學生物傳感方法，本方法通過PDNA與具有4個胸腺嘧啶(T)失配的tDNA雜交，形成T-Hg2+-T絡合物，來保證該傳感器對汞離子檢測的高選擇性。由於這種雜交形成的雙鏈DNA具有pDNA的3』端為平端而tDNA的3』端多出一定量鹼基的特殊結構，導致雙鏈DNA中pDNA被Exo III消化，而tDNA完整地游離出來繼續與其他的PDNA雜交，並重複上述過程，在這過程中pDNA被循環利用，產生了累積放大的效應，這樣實現該傳感器對汞離子檢測的高靈敏度。
[0028]下面對本發明技術方案進行詳細說明，但是本發明的保護範圍不局限於所述實施例。
[0029]實施例1:一種用於痕量汞離子檢測的酶基電化學生物傳感方法，如圖1所示，包括如下步驟:
[0030](I)將直徑為2mm金電極分別在I μ m、0.3 μ m和0.05 μ m粒徑的氧化鋁拋光粉的懸浮液中依次研磨5-10分鐘，每次研磨後需用乙醇和高純水超聲清洗5分鐘，待電極乾燥後，浸入新製備的濃硫酸和30%雙氧水(體積比3:1)的混合溶液中保持30分鐘,然後用高純水清洗，作為工作電極浸入0.5M的H2SO4溶液中，進行循環伏安掃描，直到掃描曲線穩定，最後用高純水清洗並用N2吹乾。
[0031](2)將10 μ L的含有I μ M的探針DNA (pDNA)孵化緩衝液加到清潔後的金電極表面，將其在4°C下孵化24小時，通過自組裝形成pDNA修飾的金電極(pDNA/Au)。其中，pDNA孵化緩衝溶液的成分為:0.1M NaClUO μ M三(2-羧乙基)膦(TCEP)、pH = 7.4的1mM三(羥甲基)氨基甲烷緩衝液(Tris-HCl)。pDNA為19個鹼基的5』端有巰基修飾的單鏈DNA，其序列為:
[0032]5，-SH- (CH2) 6-GATTCCGTGCATGACTCAG_3'。
[0033](3)進一步地，將pDNA/Au浸入到6_巰基己_1_醇(MCH)的緩衝溶液中，保持2小時，用於減少PDNA在金電極表面的非特異性地吸附。其中，MCH緩衝溶液的成分為5mM MCH和 1mM Tris-HCl(pH = 7.4)。
[0034](4)進一步地，將電極用1mM Tris-HCl (pH = 7.4)淋洗後，浸入到加有不同濃度汞離子的核苷酸外切酶III (Exo III)的消化緩衝液中，在37°C恆溫水浴中反應10-30分鐘。最後將電極取出用1mM Tris-HCKpH = 7.4)淋洗後，浸入含有1mM Tris-HCl (pH = 7.0)和50 μ M氯化六氨合釕電解質溶液中，利用方波伏安進行測試並分析結果。其中，核苷酸外切酶III (Exo III)的消化緩衝液的成分為 50mM Tris-HCl (pH = 8), 5mM MgCl2, ImM 二硫蘇糖醇(01'1')，1「]?目標0嫩&0嫩)，1.81111^8/^1^ Exo III 和 0.4Μ NaCl ; tDNA 為 24 個鹼基的單鏈DNA，且與pDNA具有4個鹼基T失配，其鹼基序列為:
[0035]5』 -CTGTGTCTTGCTCGGTATCAAGCG-3』 。
[0036]實施例2:—種用於痕量汞離子檢測的酶基電化學生物傳感方法，如圖1所示，包括如下步驟:
[0037](I)將直徑為2mm金電極分別在I μ m、0.3 μ m和0.05 μ m粒徑的氧化鋁拋光粉的懸浮液中依次研磨5-10分鐘，每次研磨後需用乙醇和高純水超聲清洗5分鐘，待電極乾燥後，浸入新製備的濃硫酸和30%雙氧水(體積比3:1)的混合溶液中保持30分鐘,然後用高純水清洗，作為工作電極浸入0.5M的H2SO4溶液中，進行循環伏安掃描，直到掃描曲線穩定，最後用高純水清洗並用N2吹乾。
[0038](2)將10 μ L的含有I μ M的探針DNA (pDNA)孵化緩衝液滴加到清潔後的金電極表面，將其在4°C下孵化24小時，通過自組裝形成pDNA修飾的金電極(pDNA/Au)。其中，pDNA孵化緩衝溶液的成分為:0.1M NaClUO μ M三(2-羧乙基)膦(TCEP)、pH = 7.4的1mM三(羥甲基)氨基甲烷緩衝液(Tris-HCl)。pDNA為19個鹼基的5』有巰基修飾的單鏈DNA，其序列為:
[0039]5，-SH- (CH2) 6-GATTCCGTGCATGACTCAG_3'。
[0040](3)進一步地，將步驟(2)中的pDNA/Au浸入到6_巰基己_1_醇(MCH)的緩衝溶液中，保持2小時，用於減少pDNA在金電極表面的非特異性地吸附。其中，MCH緩衝溶液的成分為 5mM MCH 和 1mM Tris-HCl (pH = 7.4)。
[0041](4)進一步地，將電極取出用1mM Tris-HCl (pH = 7.4)淋洗後，浸入到加有不同濃度汞離子的核苷酸外切酶III (Exo III)的消化緩衝液中，在37°C恆溫水浴中反應10-30分鐘。最後將電極用1mM Tris-HCKpH = 7.4)淋洗後，浸入含有1mM Tris-HCl (pH =
7.0)和50 μ M氯化六氨合釕電解質溶液中，利用方波伏安進行測試並分析結果。其中，核苷酸外切酶III (Exo III)的消化緩衝液的成分為 50mM Tris-HCl (pH = 8), 5mM MgCl2, ImM 二硫蘇糖醇(DTT)，I μ M 目標 DNA(tDNA)，1.8units/ μ L Exo III 和 0.4M NaCl。tDNA 為 27鹼基單鏈DNA，且與pDNA具有4個鹼基T失配，其鹼基序列為:
[0042]5』 -CTGTGTCTTGCTCGGTATCAAGCGAAA-3』 。
【權利要求】
1.一種用於痕量汞離子檢測的酶基電化學生物傳感方法，其特徵在於，步驟如下: (1)將10-20μ L的含有I μ M的探針DNA的孵化緩衝液滴加到清潔後的金電極表面，在4°C下孵化24小時，即得到pDNA修飾後的金電極；其中，pDNA的孵化緩衝液的成分為:0.1MNaClUOyM三(2-羧乙基)膦和pH= 7.4的1mM三(羥甲基)氨基甲烷緩衝液； (2)將步驟⑴得到的pDNA/Au浸入到6-巰基己-1-醇緩衝溶液中，保持1-2小時，即得到處理後的pDNA/Au ;其中，MCH緩衝溶液的成分為l_5mM MCH和pH = 7.4的1mMTris-HCl ； (3)將經過步驟(2)處理後的pDNA/Au用pH= 7.4的Tris-HCl淋洗，再浸入含有濃度不大於10 μ M汞離子的核苷酸外切酶III消化緩衝液中，在37-40°C恆溫水浴中反應10-30分鐘，即得到消化後的pDNA/Au電極；其中，Exo III消化緩衝液的成分為pH = 8的50mMTris-HCl、5mM MgCl2、ImM二硫蘇糖醇、0.1-1 μ M tDNA、1.8units/μ L Exo III 和 0.2-0.6MNaCl ； (4)將步驟(3)得到的消化後的pDNA/Au電極浸入含有pH= 7.0的1mM Tris-HCl和50μΜ氯化六氨合釕的電解質溶液中，利用方波伏安進行測試並分析結果；測試參數為:初始電壓-0.6V，終止電壓0V，頻率25Hz。
2.根據權利要求1所述的酶基電化學生物傳感方法，其特徵在於，探針DNA為5』端巰基修飾的單鏈核苷酸。
3.根據權利要求1或2所述的酶基電化學生物傳感方法，其特徵在於，與pDNA雜交的互補鏈tDNA是具有4個胸腺嘧啶失配的單鏈核苷酸，其鹼基數比pDNA的鹼基數至少多5個。
4.根據權利要求1或2所述的酶基電化學生物傳感方法，其特徵在於，步驟(I)中金電極在使用前需要清潔，具體方法如下: 將金電極分別在ΙμπκΟ.3μηι和0.05 μ m粒徑的氧化招拋光粉的懸浮液中依次研磨5-10分鐘，每次研磨後分別用乙醇和高純水超聲清洗5分鐘，待電極乾燥後，浸入體積比為3:1的濃硫酸和雙氧水的混合溶液中保持30分鐘,然後用高純水清洗,作為工作電極浸入0.5M的H2SO4溶液中，進行循環伏安掃描，直到掃描曲線穩定，最後用高純水清洗並用N2吹乾。
5.根據權利要求3所述的酶基電化學生物傳感方法，其特徵在於，步驟(I)中金電極在使用前需要清潔，具體方法如下: 將金電極分別在I μ m、0.3 μ m和0.05 μ m粒徑的氧化招拋光粉的懸浮液中依次研磨.5-10分鐘，每次研磨後分別用乙醇和高純水超聲清洗5分鐘，待電極乾燥後，浸入體積比為.3:1的濃硫酸和雙氧水的混合溶液中保持30分鐘,然後用高純水清洗,作為工作電極浸入.0.5M的H2SO4溶液中，進行循環伏安掃描，直到掃描曲線穩定，最後用高純水清洗並用N2吹乾。
【文檔編號】G01N27/26GK104198557SQ201410445931
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年9月3日 優先權日:2014年9月3日
【發明者】趙慧敏, 甘小榮, 全燮 申請人:大連理工大學