一種同時檢測待測溶液中汞離子和鉛離子的含量的方法與流程
2023-12-10 05:19:16 5
本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種同時檢測待測溶液中汞離子和鉛離子的含量的方法。
背景技術：
重金屬汙染嚴重威脅人類健康和生態環境安全，已成為一個世界範圍的環境問題。鉛離子(Pb2+)和汞離子(Hg2+)汙染是我國常見的重金屬汙染，具有毒性大、致毒劑量低、易累積、難降解、難治理等特點，因而是目前環境監測和治理的重點。
為控制鉛離子和汞離子經攝入進入人體內，《生活飲用水衛生標準》(GB5749-2006)嚴格限定飲用水中Hg2+的濃度不能高於0.001mg/L，Pb2+濃度不能高於0.01mg/L，並基於原子吸收光譜(AAS)、電感耦合等離子體質譜(ICP/MS)等儀器開發了檢測痕量Pb2+和Hg2+的標準方法(如GB/T 20380.1-2006、GB/T 23362.4-2009)。儘管標準的儀器方法檢測飲用水中Pb2+和Hg2+具有靈敏、準確等優點，但也存在著樣品前處理複雜、儀器設備昂貴、檢測時間長等問題，難以實現快速現場檢測或對突發水汙染事件做出快速響應。
近年來，基於功能核酸(Functional Nucleic Acids，FNAs)方法檢測環境中重金屬離子展現出巨大的應用潛力，目前已開發了大量基於FNAs檢測Pb2+和Hg2+的方法。其中對於Hg2+檢測常用的核酸為MSO(Mercury Specific Oligonucleotide)，其主要功能是在Hg2+作用下，DNA中的T鹼基可以形成錯配；而對於Pb2+的檢測主要使用G-四連體(G-quartet，G4)或者8-17/GR-5DNAzyme，在鉛離子的作用下，G4催化ABTS2－的能力被抑制，而8-17/GR-5DNAzyme則可以將其部分互補的底物鏈切斷；其中GR-5DNAzyme是新近發現的僅對Pb2+有特異響應的DNAzyme，性能優於傳統8-17DNAzyme。上述研究均僅側重於單一重金屬離子快速檢測方法，實際應用中往往伴有多種重金屬離子的超標釋放，可見，尋找一種既可檢測汞離子又可檢測鉛離子的方法勢在必行。
技術實現要素：
本發明所要解決的技術問題是如何檢測待測溶液中汞離子或鉛離子的含量。
為解決上述技術問題，本發明提供了檢測待測溶液中汞離子或鉛離子的含量的方法，該方法以對鉛離子的響應的GR-5DNAzyme為基礎，在其中引入了對Hg2+有特異響應的DNA序列，經重新設計和優化出對Hg2+和Pb2+均能響應的DNA序列：Hg-Pb TD，Hg-Pb TD由酶鏈Hg-Pb TD-En和底物鏈Hg-Pb TD-Sub組成。該方法的原理：當加入Hg2+和Pb2+後，原雜交結合的酶鏈Hg-Pb TD-En與底物鏈Hg-Pb TD-Sub發生去雜交，根據去雜交的程度可檢測相應的離子濃度。
為解決上述技術問題，本發明首先提供了一種檢測待測溶液中汞離子的含量的方法。
本發明提供的檢測待測溶液中汞離子的含量的方法，可包括步驟(a)、步驟(b)和步驟(c)：
所述步驟(a)包括如下步驟：
(a-1)雜交液和鉛離子屏蔽劑混勻，孵育；
(a-2)完成步驟(a-1)後，加入待測溶液，孵育；
(a-3)完成步驟(a-2)後，採用Hg-Pb TD-PS探針檢測螢光信號強度；
所述步驟(b)包括如下步驟：
(b-1)所述雜交液和汞離子標準溶液混勻，孵育；
(b-2)完成步驟(b-1)後，採用所述Hg-Pb TD-PS探針檢測螢光信號強度；
所述步驟(c)：根據所述汞離子標準溶液中汞離子的濃度和相應螢光信號強度繪製標準曲線，將所述步驟(a-3)得到的螢光信號強度代入所述標準曲線，得到待測溶液中汞離子的含量。
上述方法中，所述雜交液可含有底物鏈Hg-Pb TD-Sub和酶鏈Hg-Pb TD-En。
上述方法中，所述底物鏈Hg-Pb TD-Sub可為單鏈核酸分子，自3』末端到5』末端依次可包括如下元件：S1片段、S2片段和S3片段。所述S1片段可由n1個T組成。所述S2片段的核苷酸序列可為AAGGrA，rA代表腺嘌呤核糖核苷酸。所述S3片段可由n2個T組成。所述底物鏈Hg-Pb TD-Sub的末端可具有螢光猝滅基團。n1和n2均為大於等於12且小於等於18的自然數。n1>n2。所述底物鏈Hg-Pb TD-Sub的末端具體可為所述底物鏈Hg-Pb TD-Sub的5』末端。所述螢光猝滅基團可為螢光淬滅基團BHQ2、螢光淬滅基團Dabcyl、螢光淬滅基團BHQ1或螢光淬滅基團BHQ3。
上述方法中，所述酶鏈Hg-Pb TD-En可為單鏈核酸分子，自5』末端到3』末端依次可包括如下元件：E1片段、E2片段和E3片段。所述E1片段可由n3個A組成。所述E2片段的核苷酸序列可為TGAAGTAGCGCCGCCGT。所述E3片段可由n4個A組成。所述酶鏈Hg-Pb TD-En的末端可具有螢光基團。n3和n4均為大於等於12且小於等於18的自然數。n3>n4。所述酶鏈Hg-Pb TD-En的末端具體可為所述酶鏈Hg-Pb TD-En的3』末端。所述螢光基團可為花青素螢光染料Cy3、羧基螢光素FAM、花青素螢光染料Cy5或花青素螢光染料Cy5.5。
上述方法中，所述Hg-Pb TD-PS探針可為單鏈核酸分子，自5』末端到3』末端依次可包括如下元件：P1片段和P2片段。所述P1片段可由n5個脫氧核糖核苷酸組成，且不能與所述酶鏈Hg-Pb TD-En和所述底物鏈Hg-Pb TD-Sub進行雜交。所述P2片段可由n6個T組成。n5和n6均為大於等於12且小於等於16的自然數。所述Hg-Pb TD-PS探針的末端可具有修飾基團。所述Hg-Pb TD-PS探針的末端具體可為所述Hg-Pb TD-PS探針的5』末端。所述修飾基團可為NH2-(CH2)12。所述修飾基團可使所述Hg-Pb TD-PS探針和傳感光纖進行連接。
上述方法中，n1＝n3。n2＝n4＝n6。優選為n1＝n3＝18。優選為n2＝n4＝n6＝12。優選為n5＝15。
上述方法中，A為腺嘌呤脫氧核糖核苷酸。T為胸腺嘧啶脫氧核糖核苷酸。G為鳥嘌呤脫氧核糖核苷酸。C為胞嘧啶脫氧核糖核苷酸。
上述方法中，「採用Hg-Pb TD-PS探針檢測螢光信號強度」可為採用所述Hg-Pb TD-PS探針通過與脫落的帶螢光標記的雜交後，通過儀器激發螢光標記並檢測螢光信號強度。「採用Hg-Pb TD-PS探針檢測螢光信號強度」具體可為採用具有所述Hg-Pb TD-PS探針的全光纖倏逝波生物傳感器檢測螢光信號強度。所述全光纖倏逝波生物傳感器可按照中國專利號為200610089497.4、授權公告號為CN 1873450B的發明專利的實施例製備。
上述方法中，所述雜交液可由所述酶鏈Hg-Pb TD-En和所述底物鏈Hg-Pb TD-Sub組成。所述底物鏈Hg-Pb TD-Sub可由所述S1片段、所述S2片段和所述S3片段組成。所述酶鏈Hg-Pb TD-En可由所述E1片段、所述E2片段和所述E3片段組成。所述Hg-Pb TD-PS探針可由所述P1片段和所述P2片段組成。
上述方法中，所述底物鏈Hg-Pb TD-Sub的核苷酸序列可如序列表中序列3所示。所述酶鏈Hg-Pb TD-En的核苷酸序列可如序列表中序列2所示。所述Hg-Pb TD-PS探針的核苷酸序列可如序列表中序列1所示。
上述方法中，所述鉛離子屏蔽劑具體可為PDCA。所述PDCA具體可為Sigma-Aldrich公司的產品。
為解決上述技術問題，本發明還提供了一種檢測待測溶液中鉛離子的含量的方法。
本發明所提供的檢測待測溶液中鉛離子的含量的方法，可包括步驟(A)、步驟(B)和步驟(C)：
所述步驟(A)可包括如下步驟：
(A-1)上述任一所述雜交液和汞離子屏蔽劑混勻，孵育；
(A-2)完成步驟(A-1)後，加入待測溶液，孵育；
(A-3)完成步驟(A-2)後，採用上述任一所述Hg-Pb TD-PS探針檢測螢光信號強度；
所述步驟(B)可包括如下步驟：
(B-1)上述任一所述雜交液和鉛離子標準溶液混勻，孵育；
(B-2)完成步驟(B-1)後，採用上述任一所述Hg-Pb TD-PS探針檢測螢光信號強度；
所述步驟(C)：根據所述鉛離子標準溶液中鉛離子的濃度和相應螢光信號強度繪製標準曲線，將所述步驟(A-3)得到的螢光信號強度代入所述標準曲線，得到待測溶液中鉛離子的含量。
所述汞離子屏蔽劑可為Hg2+屏蔽序列。所述Hg2+屏蔽序列具體可由10個T組成；T為胸腺嘧啶脫氧核糖核苷酸。
上述任一所述的方法中，所述待測溶液可為待測液相樣本。
為解決上述技術問題，本發明還提供了一種檢測待測溶液中汞離子或鉛離子含量的試劑盒。
本發明所提供的試劑盒，包括上述任一所述底物鏈Hg-Pb TD-Sub和上述任一所述酶鏈Hg-Pb TD-En。
上述試劑盒中，還可包括上述任一所述Hg-Pb TD-PS探針。
上述任一所述試劑盒中，還可包括光纖探頭。
上述任一所述試劑盒中，還可包括表面具有上述任一所述Hg-Pb TD-PS探針的光纖探頭。
上述任一所述試劑盒中，還可包括全光纖倏逝波生物傳感器。
上述任一所述試劑盒中，還可包括汞離子屏蔽劑。所述汞離子屏蔽劑可為Hg2+屏蔽序列。所述Hg2+屏蔽序列具體可由10個T組成；T為胸腺嘧啶脫氧核糖核苷酸。
上述任一所述試劑盒中，還可包括鉛離子屏蔽劑。所述鉛離子屏蔽劑具體可為PDCA。所述PDCA具體可為Sigma-Aldrich公司的產品。
上述任一所述試劑盒的製備方法也屬於本發明的保護範圍。
上述任一所述試劑盒在檢測待測溶液中汞離子或鉛離子含量中的應用也屬於本發明的保護範圍。
為解決上述技術問題，本發明還提供了一種檢測待測溶液中汞離子的含量的方法。
本發明所提供的檢測待測溶液中汞離子的含量的方法，可包括步驟(1)、步驟(2)和步驟(3)：
所述步驟(1)可包括如下步驟：
(1-1)上述任一所述雜交液和待測溶液混勻，孵育；
(1-2)完成步驟(1-1)後，採用上述任一所述Hg-Pb TD-PS探針檢測螢光信號強度；
所述步驟(2)包括如下步驟：
(2-1)上述任一所述雜交液和汞離子標準溶液混勻，孵育；
(2-2)完成步驟(2-1)後，採用所述Hg-Pb TD-PS探針檢測螢光信號強度；
所述步驟(3)：根據所述汞離子標準溶液中汞離子的濃度和相應螢光信號強度繪製標準曲線，將所述步驟(1-2)得到的螢光信號強度代入所述標準曲線，得到待測溶液中汞離子的含量。
上述方法中，所述待測溶液為不含有鉛離子的待測液相樣本。
為解決上述技術問題，本發明還提供了一種檢測待測溶液中鉛離子的含量的方法。
本發明所提供的檢測待測溶液中鉛離子的含量的方法，可包括步驟(d)、步驟(e)和步驟(f)：
所述步驟(d)可包括如下步驟：
(d-1)上述任一所述雜交液和待測溶液混勻，孵育；
(d-2)完成步驟(d-1)後，採用上述任一所述Hg-Pb TD-PS探針檢測螢光信號強度；
所述步驟(e)包括如下步驟：
(e-1)上述任一所述雜交液和鉛離子標準溶液混勻，孵育；
(e-2)完成步驟(e-1)後，採用所述Hg-Pb TD-PS探針檢測螢光信號強度；
所述步驟(f)：根據所述鉛離子標準溶液中鉛離子的濃度和相應螢光信號強度繪製標準曲線，將所述步驟(e-2)得到的螢光信號強度代入所述標準曲線，得到待測溶液中鉛離子的含量。
上述方法中，所述待測溶液為不含有汞離子的待測液相樣本。
上文中，所述汞離子具體可為Hg2+。所述鉛離子具體可為Pb2+。
上述任一所述鉛離子標準溶液可為溶液1、溶液2、溶液3、溶液4或溶液5。具體製備方法如下：取Pb2+標準溶液(GSB O4-1742-2004)，然後用0.1M硝酸水溶液稀釋，依次獲得Pb2+濃度為0nM的溶液1、Pb2+濃度為16.7nM的溶液2、Pb2+濃度為167nM的溶液3、Pb2+濃度為833nM的溶液4和Pb2+濃度為1670nM的溶液5。所述Pb2+標準溶液(GSB O4-1742-2004)可為國家有色金屬及電子材料分析測試中心的產品。
上述任一所述汞離子標準溶液可為溶液a、溶液b、溶液c、溶液d或溶液e。具體製備方法如下：取Hg2+標準溶液(GSB O4-1729-2004)，然後用0.1M硝酸水溶液稀釋，依次獲得Hg2+濃度為0nM的溶液a、Hg2+濃度為16.7nM的溶液b、Hg2+濃度為167nM的溶液c、Hg2+濃度為833nM的溶液d或Hg2+濃度為1670nM的溶液e。所述Hg2+標準溶液(GSB O4-1729-2004)可為國家有色金屬及電子材料分析測試中心的產品。
如果欲檢測待測溶液汞離子和鉛離子的總含量，可按照所述方法檢測待測溶液中的汞離子的含量和鉛離子的含量，然後將二者相加，即得到待測溶液汞離子和鉛離子的總含量。
實驗證明，本發明所提供的方法，既可檢測汞離子的含量，又可檢測鉛離子的含量，且檢測準確率高、靈敏度高、選擇性好和重複性好。因此，本發明所提供的方法在檢測汞離子的含量和檢測鉛離子的含量中的具有重要的應用價值。
附圖說明
圖1為不同濃度Pb2+溶液的檢測結果圖。
A為不同濃度Pb2+溶液的實際檢測圖；B為Pb2+檢測的標準曲線圖。
圖2為不同濃度Hg2+溶液的檢測結果圖。
A為不同濃度Hg2+溶液的實際檢測圖；B為Hg2+檢測的標準曲線圖。
圖3為對不同金屬離子的選擇性檢測結果圖。
A為Pb2+溶液檢測時對不同離子的選擇性；B為Hg2+溶液檢測時對不同離子的選擇性。
圖4為對濃度為167nM的Hg2+溶液的重複性檢測結果圖。
具體實施方式
下面結合具體實施方式對本發明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡明本發明，而不是為了限制本發明的範圍。
下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。
下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
以下實施例中的定量試驗，均設置三次重複實驗，結果取平均值。
下述實施例中的全光纖倏逝波生物傳感器按照中國專利號為200610089497.4、授權公告號為CN 1873450B的發明專利的實施例製備。
2，6-pyridinedicarboxylic acid(PDCA)為Sigma-Aldrich公司的產品；在作為鉛離子屏蔽劑。3-氨丙基三乙氧基矽烷(APTES)為sigma-aldrich公司的產品，CAS號為919-30-2。傳感光纖為南京春輝科技實業有限公司的產品，產品型號為HCS。
硫酸-過氧化氫溶液由98.3％(質量百分含量)的濃硫酸水溶液和30％(質量百分含量)的過氧化氫水溶液按體積比3:1混合而成。
矽烷化劑溶液：將2mL 3-氨丙基三乙氧基矽烷(APTES)溶於100mL脫水甲苯，得到矽烷化劑溶液。
戊二醛偶聯劑溶液：將戊二醛溶於pH7.4、50mM的Tris-HAc緩衝液得到戊二醛偶聯劑溶液；戊二醛偶聯劑溶液中，戊二醛的體積百分含量為2％。
Hg-Pb TD-PS探針、酶鏈Hg-Pb TD-En和底物鏈Hg-Pb TD-Sub均為單鏈核酸分子，由寶生物工程(大連)有限公司合成。Hg-Pb TD-PS探針、酶鏈Hg-Pb TD-En和底物鏈Hg-Pb TD-Sub的核苷酸序列見表1。
表1
註：Cy3為花青素螢光染料，rA為腺嘌呤RNA，BHQ2為螢光淬滅基團。
Hg-Pb TD-PS探針溶液：將Hg-Pb TD-PS探針和NaNO3溶於pH7.4、50mM的Tris-HAc緩衝液，得到Hg-Pb TD-PS探針溶液；Hg-Pb TD-PS探針溶液中，Hg-Pb TD-PS探針的濃度為150nM，NaNO3的濃度為100mM。
Hg-Pb TD-En－Hg-Pb TD-Sub雜交液：將酶鏈Hg-Pb TD-En、底物鏈Hg-Pb TD-Sub和NaNO3溶於pH7.4、10mM的Tris-HAc緩衝液，得到Hg-Pb TD-En－Hg-Pb TD-Sub雜交液；Hg-Pb TD-En－Hg-Pb TD-Sub雜交液中，酶鏈Hg-Pb TD-En和底物鏈Hg-Pb TD-Sub的濃度均為30nM，NaNO3的濃度為50mM。
Pb2+標準溶液(GSB O4-1742-2004)為國家有色金屬及電子材料分析測試中心的產品，Pb2+標準溶液(GSB O4-1742-2004)中Pb2+濃度為1000μg/mL。
Hg2+標準溶液(GSB O4-1729-2004)為國家有色金屬及電子材料分析測試中心的產品，Hg2+標準溶液(GSB O4-1729-2004)中Hg2+濃度為1000μg/mL。
實施例1、Pb2+和/或Hg2+的檢測方法
GR-5DNAzyme是新近發現的僅對Pb2+有特異響應的DNAzyme，性能優於傳統8-17DNAzyme，其中GR-5DNAzyme由酶鏈GR-5En和底物鏈GR-5Sub組成。為可以檢測Pb2+和/或Hg2+，需對GR-5DNAzyme的結構進行重新設計。經過大量設計和實驗操作驗證，本發明的發明人發現需保留其關鍵位置脫氧核酸的組成和結構，即保留其對Pb2+有響應的結構；還需通過在底物鏈GR-5Sub上「AAGGrA」的兩端分別加上若干個T鹼基(一般為12-18個)，使Hg2+加入後，底物鏈可以從酶鏈上離去，從而建立Hg2+濃度和螢光強度的關係，鑑於此重新設計和優化出對Hg2+和Pb2+均能響應的DNA序列：Hg-Pb TD，Hg-Pb TD由酶鏈Hg-Pb TD-En和底物鏈Hg-Pb TD-Sub組成。該方法的原理：當加入Hg2+和Pb2+後，原雜交結合的酶鏈Hg-Pb TD-En與底物鏈Hg-Pb TD-Sub發生去雜交，根據去雜交的程度可檢測相應的離子濃度。
建立的Pb2+含量和/或Hg2+含量的檢測方法，具體步驟如下：
一、製備Hg-Pb TD-PS探針光纖
1、表面羥基活化的傳感光纖的製備
(1)將傳感光纖浸泡於硫酸-過氧化氫溶液，80℃靜置1h。
(2)完成步驟(1)後，取所述傳感光纖，用超純水衝洗3次(每次衝洗時間為1min)，然後用氮氣吹乾，120℃靜置3h，即獲得表面羥基活化的傳感光纖。
2、表面矽烷化的傳感光纖的製備
(1)將表面羥基活化的傳感光纖浸泡於矽烷化劑溶液中，室溫(如25℃)靜置120min。
(2)完成步驟(1)後，取所述表面羥基活化的傳感光纖，先用脫水甲苯衝洗3次(每次衝洗時間為1min)，再用無水乙醇衝洗3次(每次衝洗時間為1min)，然後用氮氣吹乾，180℃烘烤1h，即獲得表面矽烷化的傳感光纖。
3、表面偶聯化的傳感光纖的製備
(1)將表面矽烷化的傳感光纖浸泡於戊二醛偶聯劑溶液中，室溫(如25℃)靜置60min。
(2)完成步驟(1)後，取所述表面矽烷化的傳感光纖，先用超純水衝洗3次(每次衝洗時間為1min)，再用pH7.4、50mM的Tris-HAc緩衝液衝洗3次(每次衝洗時間為1min)，然後用氮氣吹乾，得到表面偶聯化的傳感光纖。
4、Hg-Pb TD-PS探針光纖的製備
(1)取表面偶聯化的傳感光纖，在其表面均勻覆蓋Hg-Pb TD-PS探針溶液，然後放入溼度為65％(實際應用中溼度為55％-75％之間均可)的密閉環境中室溫(如25℃)靜置18h。
(2)完成步驟(1)後，取所述表面偶聯化的傳感光纖，先用0.2％(質量百分含量)的SDS水溶液衝洗3次(每次衝洗時間為1min)，再用超純水衝洗3次(每次衝洗時間為1min)，然後用20μM的甘氨酸水溶液浸泡處理1h。
(3)完成步驟(2)後，取所述表面偶聯化的傳感光纖，先用0.2％(質量百分含量)的SDS水溶液衝洗3次(每次衝洗時間為1min)，再用超純水衝洗3次(每次衝洗時間為1min)，然後用氮氣吹乾，得到固定Hg-Pb TD-PS探針的傳感光纖，命名為Hg-Pb TD-PS探針光纖。
二、不含Hg2+的待測樣品中的Pb2+含量的檢測
不含Hg2+的待測樣品中的Pb2+含量的檢測的步驟如下：
1、將Hg-Pb TD-PS探針光纖裝入全光纖倏逝波生物傳感器。
2、取Pb2+標準溶液(GSB O4-1742-2004)，然後用0.1M硝酸水溶液稀釋，依次獲得Pb2+濃度為16.7nM的溶液2、Pb2+濃度為167nM的溶液3、Pb2+濃度為833nM的溶液4和Pb2+濃度為1670nM的溶液5。將0.1M硝酸水溶液做為溶液1(Pb2+濃度為0nM)。
3、完成步驟2後，向試管中先加入300μL Hg-Pb TD-En－Hg-Pb TD-Sub雜交液，然後加入3μL溶液(溶液1、溶液2、溶液3、溶液4或溶液5)，室溫(如30℃)靜置8min，得到雜交後的溶液。
4、完成步驟3後，取雜交後的溶液，通入完成步驟1的全光纖倏逝波生物傳感器，進行Pb2+檢測，將不同時間產生的螢光信號進行收集，然後利用最強螢光信號值計算螢光強度百分比。考慮到Pb2+與Hg-Pb TD-En－Hg-Pb TD-Sub雜交液的反應時間，完成單次檢測的全過程需少於15min。
完成上述步驟後的Hg-Pb TD-PS探針光纖可以再生，再生方法為：將完成上述步驟後的Hg-Pb TD-PS探針光纖先用飽和尿素水溶液洗滌2次(每次洗滌時間為48s)，然後用0.2％(質量百分含量)的SDS水溶液衝洗2次(每次洗滌時間為48s，最後使用超純水和pH7.4、10mM的Tris-HAc緩衝液各清洗一遍，洗滌時間均為24s。
實驗結果見圖1中A。結果表明，隨著Pb2+濃度的增加，螢光信號值逐漸增大。
5、以Pb2+濃度為橫坐標，螢光強度百分比為縱坐標，繪製檢測Pb2+的標準曲線。
檢測Pb2+的標準曲線如圖1中B所示，線性關係為：Y＝0.031X+46.08，R2＝0.9916。
根據最低檢測限為儀器信噪比3倍的原則，Pb2+的最低檢測限為10nM。
6、不含Hg2+的待測樣品中的Pb2+含量的檢測
按照上述步驟1至4，將步驟3中的溶液替換為不含Hg2+的待測樣品，其它步驟均不變，得到不含Hg2+的待測樣品的螢光強度百分比；然後根據檢測Pb2+的標準曲線即可計算得出不含Hg2+的待測樣品中的Pb2+含量。
三、不含Pb2+的待測樣品中的Hg2+含量的檢測
不含Pb2+的待測樣品中的Hg2+含量的檢測的步驟如下：
1、將Hg-Pb TD-PS探針光纖裝入全光纖倏逝波生物傳感器。
2、取Hg2+標準溶液(GSB O4-1729-2004)，然後用0.1M硝酸水溶液稀釋，依次獲得Hg2+濃度為16.7nM的溶液b、Hg2+濃度為167nM的溶液c、Hg2+濃度為833nM的溶液d和Hg2+濃度為1670nM的溶液e。將0.1M硝酸水溶液做為溶液a(Hg2+濃度為0nM)。
3、完成步驟2後，取試管，首先加入300μL Hg-Pb TD-En－Hg-Pb TD-Sub雜交液，然後加入3μL溶液(溶液a、溶液b、溶液c、溶液d或溶液e)，室溫(如30℃)靜置8min，得到雜交後的溶液。
4、完成步驟2後，取雜交後的溶液，通入完成步驟1的全光纖倏逝波生物傳感器，進行Hg2+檢測，將不同時間產生的螢光信號進行收集，然後利用最強螢光信號值計算螢光強度百分比。考慮到Hg2+與Hg-Pb TD-En－Hg-Pb TD-Sub雜交液的反應時間，完成單次檢測的全過程需少於15min。
完成上述步驟後的Hg-Pb TD-PS探針光纖可以再生，具體方法同步驟二中Hg-Pb TD-PS探針光纖的再生方法。
實驗結果見圖2中A。結果表明，隨著Hg2+濃度的增加，螢光信號值逐漸增大。
5、以Hg2+濃度為橫坐標，螢光強度百分比為縱坐標，繪製檢測Hg2+的標準曲線。
檢測Hg2+的標準曲線如圖2中B所示，線性關係為：Y＝0.029X+50.67，R2＝0.9942。
根據最低檢測限為儀器信噪比3倍的原則，Hg2+的最低檢測限為7nM。
6、不含Pb2+的待測樣品中的Hg2+含量的檢測
按照上述步驟1至4，將步驟3中的溶液替換為不含Pb2+的待測樣品，其它步驟均不變，得到不含Pb2+的待測樣品的螢光強度百分比；然後根據檢測Hg2+的標準曲線即可計算得出不含Pb2+的待測樣品中的Hg2+含量。
四、含Pb2+和Hg2+的待測樣品中Pb2+含量的檢測
A、含Pb2+和Hg2+的待測樣品中Pb2+含量的檢測的原理為：使用Hg2+屏蔽序列掩蔽含Pb2+和Hg2+的待測樣品中的Hg2+，然後再檢測Pb2+含量。含Pb2+和Hg2+的待測樣品中Hg2+的濃度不超過1670nM。
含Pb2+和Hg2+的待測樣品中Pb2+含量的檢測的步驟如下：
1、按照步驟二中1－5的方法，製備檢測Pb2+的標準曲線。
2、將Hg-Pb TD-PS探針光纖裝入全光纖倏逝波生物傳感器。
3、取試管，加入300μL Hg-Pb TD-En－Hg-Pb TD-Sub雜交液，然後加入Hg2+屏蔽序列，得到混合液；混合液中，Hg2+屏蔽序列的濃度為30nM。
4、完成步驟3後，取混合液，靜置5min，然後加入含Pb2+和Hg2+的待測樣品，室溫(如30℃)靜置8min，得到雜交後的溶液。
5、完成步驟4後，取雜交後的溶液，通入完成步驟2的全光纖倏逝波生物傳感器，進行Pb2+檢測，得到螢光強度百分比；然後根據檢測Pb2+的標準曲線即可計算得出含Pb2+和Hg2+的待測樣品中Pb2+含量。
B、檢測待測溶液
1、用丹江口水庫的水樣配製0.1M硝酸水溶液。
2、完成步驟1後，取Pb2+標準溶液(GSB O4-1742-2004)，然後用步驟1配製的0.1M硝酸水溶液稀釋，獲得Pb2+濃度為1000nM的待測溶液。
3、完成步驟2後，按照步驟A中的方法檢測待測溶液中Pb2+的含量。
4、完成步驟2後，採用電感耦合等離子質譜檢測待測溶液中Pb2+的含量。
實驗結果表明，按照步驟A中的方法檢測待測溶液中Pb2+的含量為967±45nM，採用電感耦合等離子質譜檢測待測溶液中Pb2+的含量為1027±0.085nM，兩種方法檢測結果基本一致，因此，本發明所提供的方法可準確的檢測待測樣品中Pb2+的含量。
五、含Pb2+和Hg2+的待測樣品中Hg2+含量的檢測
A、含Pb2+和Hg2+的待測樣品中Hg2+含量的檢測的原理為：使用PDCA掩蔽含Pb2+和Hg2+的待測樣品中的Pb2+，然後再檢測Hg2+含量。含Pb2+和Hg2+的待測樣品中Pb2+的濃度不超過1670nM。
含Pb2+和Hg2+的待測樣品中Hg2+含量的檢測的步驟如下：
1、按照步驟三中1－5的方法，製備檢測Hg2+的標準曲線。
2、將Hg-Pb TD-PS探針光纖裝入全光纖倏逝波生物傳感器。
3、取試管，加入300μL Hg-Pb TD-En－Hg-Pb TD-Sub雜交液，然後加入PDCA，得到混合液；混合液中，PDCA的濃度為10mM。
4、完成步驟3後，取混合液，靜置5min，然後加入含Pb2+和Hg2+的待測樣品，室溫(如30℃)靜置8min，得到雜交後的溶液。
5、完成步驟4後，取雜交後的溶液，通入完成步驟2的全光纖倏逝波生物傳感器，進行Hg2+檢測，得到螢光強度百分比；然後根據檢測Hg2+的標準曲線即可計算得出含Pb2+和Hg2+的待測樣品中Hg2+含量。
B、檢測待測溶液
1、用丹江口水庫的水樣配製0.1M硝酸水溶液。
2、完成步驟1後，取Hg2+標準溶液(GSB O4-1729-2004)，然後用步驟1配製的0.1M硝酸水溶液稀釋，獲得獲得Hg2+濃度為100nM的待測溶液。
3、完成步驟2後，按照步驟A中的方法檢測待測溶液中Hg2+的含量。
4、完成步驟2後，採用電感耦合等離子質譜檢測待測溶液中Hg2+的含量。
實驗結果表明，按照步驟A中的方法檢測待測溶液中Hg2+的含量為94±22nM，採用電感耦合等離子質譜檢測待測溶液中Hg2+的含量為104±0.018nM，兩種方法檢測結果基本一致，因此，本發明所提供的方法可準確的檢測待測樣品中Hg2+含量。
六、含Pb2+和Hg2+的待測樣品中Pb2+含量和Hg2+含量的檢測
A、含Pb2+和Hg2+的待測樣品中Pb2+含量和Hg2+含量的檢測的步驟如下：
1、按照步驟四的方法，得出含Pb2+和Hg2+的待測樣品中Pb2+含量。
2、按照步驟五的方法，得出含Pb2+和Hg2+的待測樣品中Hg2+含量。
B、檢測待測溶液
1、用丹江口水庫的水樣配製0.1M硝酸水溶液。
2、完成步驟1後，取Pb2+標準溶液(GSB O4-1742-2004)，然後用步驟1配製的0.1M硝酸水溶液稀釋，獲得Pb2+濃度為1000nM的待測溶液1。取Hg2+標準溶液(GSB O4-1729-2004)，然後用步驟1配製的0.1M硝酸水溶液稀釋，獲得獲得Hg2+濃度為100nM的待測溶液2。
3、完成步驟2後，按照步驟A中1的方法檢測待測溶液1中Pb2+的含量，按照步驟A中2的方法檢測待測溶液2中Hg2+的含量。
4、完成步驟2後，採用電感耦合等離子質譜檢測待測溶液1中Pb2+的含量，採用電感耦合等離子質譜檢測待測溶液2中Hg2+的含量。
實驗結果表明，按照步驟A中1的方法檢測待測溶液1中Pb2+的含量為986±47nM，採用電感耦合等離子質譜檢測待測溶液1中Pb2+的含量為1031±0.076nM，兩種方法的檢測結果基本一致；按照步驟A中2的方法檢測待測溶液2中Hg2+的含量為102±23nM，採用電感耦合等離子質譜檢測待測溶液2中Hg2+的含量為105±0.016nM，兩種方法的檢測結果基本一致。因此，本發明所提供的方法可準確的檢測待測樣品中Pb2+含量和Hg2+含量。
實施例2、選擇性檢測
一、製備Hg-Pb TD-PS探針光纖
同實施例1步驟一。
二、不同金屬離子的選擇性檢測
1、將Hg-Pb TD-PS探針光纖裝入全光纖倏逝波生物傳感器。
2、取試管，首先加入300μL Hg-Pb TD-En－Hg-Pb TD-Sub雜交液，然後加入3μL溶液(1mM硝酸亞鐵水溶液、1mM硝酸錳水溶液、1mM硝酸鋁水溶液，1mM硝酸鐵水溶液，1mM硝酸銀水溶液，1mM氯化鎘水溶液，1mM硝酸銅水溶液，1mM硝酸鈷水溶液，1mM硝酸鉛水溶液，1mM硝酸鎂水溶液和1mM硝酸鈣水溶液、100μM草酸鉛水溶液或100μM草酸汞水溶液)，室溫(如30℃)靜置8min，得到雜交後的溶液。
3、完成步驟2後，取雜交後的溶液，通入完成步驟1的全光纖倏逝波生物傳感器，檢測對不同金屬離子的選擇性實驗結果，具體方法為：收集螢光信號，利用最強螢光信號值計算百分比信號值，百分比信號值的計算公式如下：
百分比信號值(％)＝(待測金屬離子的螢光信號值/1.67μM Pb2+或1.67μM Hg2+)的最強螢光信號值)×100％。
實驗結果見圖3。結果表明，Fe2+離子、Mn2+離子、Al3+離子、Fe3+離子、Ag+離子、Cd2+離子、Cu2+離子、Co2+離子、Zn2+離子、Mg2+離子和Ca2+離子相對於Pb2+離子或Hg2+離子的百分比信號值均小於5％，幹擾性可以忽略。因此，本發明所提供的方法對於Pb2+或Hg2+的檢測均具有良好的選擇性。
實施例3、重複性檢測
一、製備Hg-Pb TD-PS探針光纖
同實施例1步驟一。
二、Hg-Pb TD-PS探針光纖的重複性檢測
1、將Hg-Pb TD-PS探針光纖裝入全光纖倏逝波生物傳感器。
2、取試管，首先加入300μL Hg-Pb TD-En－Hg-Pb TD-Sub雜交液，然後加入3μL Hg2+濃度為167nM的溶液c(用0.1M硝酸水溶液稀釋Hg2+標準溶液(GSB O4-1729-2004)得到)，室溫(如30℃)靜置8min，得到雜交後的溶液。
3、完成步驟2後，取雜交後的溶液，通入完成步驟1的全光纖倏逝波生物傳感器，進行Hg-Pb TD-PS探針光纖對Hg2+的重複性檢測，共進行5次檢測。將不同時間產生的螢光信號進行收集，利用最強螢光信號值計算百分比信號值，百分比信號值的計算公式如下：
百分比信號值(％)＝(待測金屬離子的螢光信號值/1.67μM Pb2+或1.67μM Hg2+)的最強螢光信號值)×100％。
實驗見圖4。結果表明，Hg-Pb TD-PS探針光纖對Hg2+檢測的重複性好。
按照上述步驟，將步驟2中Hg2+濃度為167nM的溶液c替換為Pb2+濃度為167nM的溶液3(用0.1M硝酸水溶液稀釋Pb2+標準溶液(GSB O4-1742-2004)得到)，其它步驟均不變，得到Hg-Pb TD-PS探針光纖對Pb2+的重複性檢測。結果表明，Hg-Pb TD-PS探針光纖對Pb2+檢測的重複性好。
上述實驗結果表明，本發明所提供的方法對於Pb2+或Hg2+的檢測的重複性較好。