一種高效抗膠質瘤新生血管生成的小分子幹擾rna、其製備方法及其應用的製作方法
2023-12-10 07:26:02 2
專利名稱：一種高效抗膠質瘤新生血管生成的小分子幹擾rna、其製備方法及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種高效抗膠質瘤新生血管生成的小分子幹擾RNA、其製備方法及其應用。
背景技術：
上世紀七十年代，Folkman在《新英格蘭醫學雜誌》中首次提出了腫瘤生長依賴於新血管生成的理論假說，隨著8年後毛細血管內皮細胞培養技術的建立，11年後第一個血管生成抑制劑的發現，13年後第一個血管生成活性蛋白的純化等，這一觀點為越來越多的證據所支持，並逐漸使這一領域成為腫瘤研究的熱點。腫瘤血管生成在腫瘤的形成和轉移過程中發揮了非常重要的作用，抑制腫瘤血管的生成是現代治療腫瘤的一個重要策略。RNA幹擾(RNA interference, RNAi),是指當細胞中導入與內源性mRNA編碼區同源的雙鏈RNA時，生物體抑制特異的內源性mRNA表達的一種現象，而且mRNA發生降解，從而導致特定基因表達沉默。RNA幹涉機制在細胞中以RNA分子雙鏈形式出現，當雙鏈RNA激活時，可以降低內源性mRNA分子水平的表達。當靶標mRNA分子消失時，相應的基因表達沉默。通過RNAi手段靶向下調膠質瘤新生血管生成關鍵關聯基因STAT3的表達，為腦膠質瘤的治療開闢一條新途徑。在此處鍵入技術領域描述段落。
發明內容
本發明的目的之一在於提供一種高效抗膠質瘤新生血管生成的小分子幹擾RNA。本發明的目的之二在於提供該小分子幹擾RNA的製備方法。本發明的目的之三在於提供小分子幹擾RNA的應用。為達到上述目的，本發明採用如下技術方案
一種高效抗膠質瘤新生血管生成的小分子幹擾RNA，其特徵在於該基因為SEQ NO. 1所示的鹼基序列。一種製備上述的高效抗膠質瘤新生血管生成的小分子幹擾RNA，其特徵在於該方法的具體步驟為根據SilenCircle TM RNAi Transcription Kit中載體設計的具體要求， 設計對應於 STAT3 基因 2214-2232 位，S卩GAT CAT GGA TGC TAC CAA T 的 shRNA 的寡核苷酸序列，各為53bp，送生工生物工程(上海)有限公司進行合成；所述的shRNA的寡核苷酸序列為
SEQ NO. 1
Sense 5'-aca ccG ATC ATG GAT GCT ACC AAT ttg ctt gaa ATT GGT AGC ATC CAT GAT Ct-3'
Anti-sense: :5，_aaa aaG ATC ATG GAT GCT ACC AAT ttc aag caa ATT GGT AGC ATC CAT GAT Cg-3'；根據SilenCircle TM RNAi Transcription Kit基因質粒構建試劑盒中載體設計的具體要求，將設計的shRNA的寡核苷酸序列和PSil—質粒進行連接，得到高效抗膠質瘤新生血管生成的小分子幹擾RNA。一種上述的高效抗膠質瘤新生血管生成的小分子幹擾RNA在製備抗膠質瘤侵襲與抗新生血管生成藥物中的應用。本發明設計對抑制膠質瘤新生血管生成有關聯的基因的RNAi，並應用膠質瘤細胞模型研究其抗膠質瘤新生血管生成的促進作用。為RNAi在膠質瘤的治療應用提供了一種新方法。
具體實施例方式
一、膠質瘤細胞的培養膠質瘤細胞U251細胞系培養於37°C，5%C02恆溫培養箱。對數生長期的細胞用胰酶消化脫壁，再加入適量培養液以易於混勻細胞；用移液器將其移入 15ml離心管中，1500rpm離心!Bmin ；去上清；用5ml無菌IXPBS將細胞懸起，並吹打混勻； 加約Iml細胞懸液於裝有5ml新鮮培養基的新培養瓶中，放入37°C，5%0)2培養箱中培養， 約2天左右傳代1次(主要查看細胞有無鋪滿培養瓶)。二、人腦膠質瘤細胞的分離取人腦膠質瘤手術標本，浸入4°C的KRBB溶液中. 清洗二次，然後將標本剪成小塊，轉移至盛有5mL消化酶液的三角瓶中，於恆溫搖床中 37 °C保溫，搖床轉速100 r/min,每IOmin玻璃管反覆吹打一次，放置30min，之後將該懸液離心IOOOrpm，離心5min，最後剩下的為膠質瘤細胞.在倒置顯微鏡下，膠質瘤細胞
呈圓形.
三、STAT3-RNAi 質粒的設計和轉染根據 SilenCircle TM RNAi Transcription Kit 中載體設計的具體要求，設計對應於STAT3基因2214-2232位，S卩GAT CAT GGA TGC TAC CAA T的shRNA的寡核苷酸序列，各為5!3bp，並進行合成。STAT3-RNAi對應的序列為 SEQ NO. 1
Sense 5'-aca ccG ATC ATG GAT GCT ACC AAT ttg ctt gaa ATT GGT AGC ATC CAT GAT Ct-3'
Anti-sense: :5，_aaa aaG ATC ATG GAT GCT ACC AAT ttc aag caa ATT GGT AGC ATC CAT GAT Cg-3'；
根據SilenCircle TM RNAi Transcription Kit中載體設計的具體要求，將設計的 STAT3-RNAi的幹擾片段和Psilma"^質粒連接，參見
圖1，然後轉染進膠質瘤細胞。STAT3-RNAi質粒的轉染轉染前一天，在含有5ml無抗生素的DMEM培養基的60-mm培養皿裡種上2 X IO6個膠質瘤細胞。然後用500 μ 1無血清的培養基(DMEM)溶解8. 0μ g的STAT3-RNAi表達載體，用500 μ 1培養基(DMEM)溶解Lipof ectamine^OOO (20 μ 1)，輕輕地混勻，再室溫孵育5分鐘。孵育5分鐘後， 將shRNA表達載體與LipOfectamineTM2000充分混勻，室溫孵育20分鐘，以形成 DNA-Lipof ectamine 2000 的複合物。將 DNA-Lipof ectamine 2000 複合物加入到 60mm 培養皿裡，之後細胞在37°C，5% CO2培養箱內培養6小時，換上正常細胞培養液。四、實驗分組與檢測指標正常對照組膠質瘤細胞，培養液為膠質瘤細胞培養液；RNAi組轉染過RNAi的膠質瘤細胞，培養液為膠質瘤細胞培養液。膠質瘤細胞血管生成的檢測將轉染後的各組細胞懸液置於37 5% CO2的培養箱中培養Mh，取各組細胞培養上清液加入血管內皮細胞中，通過免疫細胞化學的方法和 HE染色，檢測新生血管生成的情況，如圖2。
圖1為ShRNA的寡核苷酸序列引物和Psilma"^質粒的連接圖。圖2 Mat3_RNAi對腦膠質瘤細胞增殖的影響，圖為統計學分析圖。由圖可知，轉染乂站3 RNA幹擾質粒組的細胞新生血管數與血管分支數顯著低於未轉染組和轉染空載體組的新生血管數與血管分支數。圖中Mock-未轉染質粒組；Empty vector-轉染空載體組； Stat3 RNAi-轉染Mat3 RNA幹擾質粒組。五、結果說明轉染Mat3 RNA幹擾質粒組中的腫瘤新生血管生成受到抑制，新生血管數和分支數明顯地減少。該實驗結果表明，通過RNAi技術下調膠質瘤中的Mat3表達， 能有效地抑制腫瘤新生血管的生成。
權利要求
1.一種高效抗膠質瘤新生血管生成的小分子幹擾RNA，其特徵在於該RNA序列為SEQ NO. 1所示的鹼基序列。
2.一種製備根據權利要求1所述的抑制膠質瘤新生血管生成的小分子幹擾RNA的方法，其特徵在於該方法的具體步驟為根據SilenCircle TM RNAi Transcription Kit中載體設計的具體要求，設計對應於STAT3基因2214-2232位，S卩GAT CAT GGA TGC TAC CAA T的shRNA的寡核苷酸序列，各為5!3bp，送上海生工生物工程技術服務有限公司進行合成；所述的shRNA的寡核苷酸序列序列為SEQ NO. 1 Sense 5'-aca ccG ATC ATG GAT GCT ACC AAT ttg ctt gaa ATT GGT AGC ATC CAT GAT Ct-3，Anti-sense: :5，_aaa aaG ATC ATG GAT GCT ACC AAT ttc aag caa ATT GGT AGC ATC CAT GAT Cg-3'；依據SilenCircle TM RNAi Transcription Kit中載體設計的要求，將設計的shRNA序列和SilenCircle質粒進行連接，得到用於高效抗膠質瘤新生血管生成的小分子幹擾RNA。
3.根據權利要求1所述的高效抗膠質瘤新生血管生成的小分子幹擾RNA在製取抑制膠質瘤侵襲與抗膠質瘤新生血管生成藥物中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種用於抑制膠質瘤新生血管生成的小分子幹擾RNA、其製備方法及其應用。該基因為SEQNO.1所示的鹼基序列。本發明設計對與抑制膠質瘤新生血管生成有關聯的基因的小分子幹擾RNA，並應用膠質瘤細胞模型研究其對抑制膠質瘤新生血管生成的促進作用。為小分子幹擾RNA在膠質瘤的治療應用提供了一種新方法。
文檔編號C07H21/02GK102453715SQ201010514600
公開日2012年5月16日 申請日期2010年10月21日 優先權日2010年10月21日
發明者葉思靈, 夏清梅, 武佳, 潘謳東, 車麗花, 鄭大 申請人:上海生博生物醫藥科技有限公司