基於組織工程方法構建新型高效生物催化劑的製作方法

2023-12-10 03:55:51 1

專利名稱：基於組織工程方法構建新型高效生物催化劑的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種「基於組織工程方法構建新型高效生物催化劑」的新技術。
背景技術：
組織工程的概念早在1933年由Biscgelie首次提出，但在60年後的1993年才 由Langer andVacanti在《science》雜誌上發表論文給予明確定義組織工程是多學科交 叉的研究領域，它應用生命科學和工程學原理開發恢復，保持或改善組織功能的生物替代 品。自此，組織工程才成功地擴展開來，並激勵著科學家和臨床醫師。它是以解決哺乳動物 組織資源短缺、成本高，以及移植手術可能出現併發症而提出的一項新技術。15年來，組織 工程已發展成一門新興學科，其研究涵蓋人體各個組織和器官。它的核心就是體外構建細 胞-支架3D (three-dimensional)空間複合體結構的組織工程細胞。如組織工程軟骨、組 織工程皮膚、組織工程幹細胞等各種生物替代品用於臨床前植入或修復研究，並最終用於 臨床修復，更換或再生細胞，組織或器官，恢復受損功能。組織工程必需具備三個主要條件支架材料；種子細胞；細胞增殖的體外培養條 件。天然材料如絲素蛋白、膠原、海藻酸、殼聚糖，有機聚合物或共聚物以及無機材料 等已廣泛用於支架材料，並與各種組織或細胞，如骨或骨髓基質幹細胞，內皮細胞，共培養 的成熟內皮細胞和初級成骨細胞等，經3D培養後分別形成相應的組織工程細胞用於臨床 前實驗研究。PVA能形成良好的凝膠，常用於細胞包埋固定化。其應用中常用的有PVA冷凍法， PVA化學交聯法，PVA輻射交聯法，國內外在這些方面有大量報導。PVA化學交聯法和PVA輻 射交聯法或是容易開聯，或是對細胞有毒性而在實際應用時受到一定限制。本發明是PVA 應用的物理方法，即PVA冷凍法，凝膠成型利用PVA在0°C -40°C冷凍適當的時間PVA鏈 間的氫鍵和微晶區形成三維網絡，從而形成物理交聯的PVA水凝膠，且該凝膠具有一定的 力學強度，常溫下在水中只會溶脹而不會溶解。海藻酸鈉固定化細胞因其操作簡便、細胞毒性較小等優點而廣泛應用。但其缺點 是海藻酸鈣在磷酸緩衝液及中不穩定，脫鈣使得結構鬆散而坍塌。本發明正是利用海藻酸 鈣凝膠對磷酸鹽溶液或其它鈣離子絡合劑化學侵蝕的敏感性，通過化學侵蝕將已固定化後 含海藻酸鈣凝膠中的海藻酸鹽部分溶解，從而在原來的凝膠中形成空穴，達到致孔的目的， 以提高催化劑進行生物催化反應時原料和產物的傳輸效率。目前，國內外仍用傳統包埋法固定化細胞。其形狀常為透鏡狀(傳質較好，但細胞 載量低)及球狀(粒徑較大，傳質較差，細胞載量較低)。本發明最後成型的細胞組織工程 凝膠包衣片為藥片狀。包衣前的組織工程細胞採用組織工程方法製備，其技術成熟，操作簡 便，易得，細胞載量高達80%以上，且內部有大量通道供底物和產物進出，從而保證了優異 的傳質性能，解決了傳統固定化細胞中存在的細胞載量小或傳質障礙等技術難題。用CTAB等透性化劑對微生物細胞進行透性化處理是提高細胞用於生物催化反應時細胞催化能力的有效方法。本發明先用PVA複合凝膠包衣細胞組織工程片，隨即用磷酸 鹽溶液等進行化學侵蝕使凝膠包衣層中部分海藻酸鈣膠溶解，從而形成微通道以促進小分 子原料和產物在凝膠外衣層中的傳輸；再對其進行透性化處理提高胞內酶活性；而常見的 固定化細胞是沒有進行過透性化處理的。

發明內容
本發明的目的在於提供一種把組織工程和化學技術相結合，對體外構建的細 胞-支架3D空間複合體結構的組織工程細胞進行包衣、打孔和透性化，製備透性化細胞組 織工程包衣片這種新型高效生物催化劑的方法。為了實現上述目的，本發明以蠶絲絲素蛋白或以有機聚合物、無機物等製成3D多 孔支架，以酵母細胞或其他細菌、真菌為種子細胞，經培養後種植於此支架中進行組織培 養，培養過程因3D多孔支架有大量的空間，利於營養物質進入，種植的細胞順利地在3D空 間立體生長、增殖與分化而形成細胞_支架3D空間複合體結構的組織工程細胞片。此片支 架中所有孔道的大部分空間都生長增殖著細胞，但每個孔都留有少部分空間供原料或底物 順利與細胞接觸，產物也可順利輸出。其外部用適當比例的海藻酸鈉和PVA混合液包衣，在 適當濃度的氯化鈣溶液中形成凝膠外衣層，並經凍融增加外衣層的機械性能，用適當濃度 的磷酸鹽溶液或其它鈣離子絡合劑進行化學侵蝕使部分海藻酸鈣凝膠溶解，從而形成微通 道以促進小分子原料和產物在凝膠外衣層中的傳輸。再對其進行透性化處理提高胞內酶活 性，以製備細胞載容量高，酶活力強，擴散限制小或無限制，機械強度好而可循環使用的新 一代細胞組織工程凝膠包衣片這種高效生物催化劑，並以它替代傳統的固定化細胞用於合 成手性醇等重要手性藥物與醫藥化工中間體。
經掃描電鏡拍照，倒置顯微鏡觀察，血細胞計數法計數，亞甲藍染色、孔隙率等檢 查，這種新一代高效生物催化劑中的3D支架孔隙率達90%，細胞載量達81%，支架中生長 的細胞邊緣光滑，形狀整齊，體型強壯，成活率100 %，凝膠包衣層具有緻密均勻的微孔分布。利用本發明可獲得透性化組織工程細胞凝膠包衣片，細胞載容量高，通透性好、機 械強度高。在低溫下能長期保存，在生物催化反應中能長期反覆使用。這將有利於這種新 型高效生物催化劑在生物催化及生物轉化工業領域中的廣泛應用。具體實施事例實例一取家蠶蠶繭250g去蛹後，在IOOOmL 0. 02M Na2CO3溶液中煮沸20分鐘，絲膠蛋白 充分溶解，用蒸餾水徹底衝洗提取不溶性膠狀絲素蛋白。把提取的絲素蛋白加入到500mL 9. 3MLiBr溶液中，並在攪拌下於60°C保持4小時讓絲素蛋白溶解，形成濃度約20%的絲素 蛋白與鹽的混合液。室溫下，該溶液在IOOOmL蒸餾水中透析3天以除去鹽。在，溫度_5°C 條件下，將透析液離心(轉速5000rpm) 2次，每次20分鐘，除去雜質和絮狀物，得到 8w/
的絲素蛋白水溶液。儲藏在4°C備用。按每2ml溶液加入4克致孔劑(氯化鈉微晶)的量，在 8wt%的絲素蛋白溶液中 加入粒經為106 212 μ m的氯化鈉微晶，混勻後分裝在直徑約IOmm的96孔板中，置於室 溫風乾成膠。24小時後，將96孔板浸入蒸餾水中2天，洗淨氯化鈉即成。備用。
種子酵母細胞的培養放大培養基:MY培養基(葡萄糖1%，蛋白腖0.5%，酵母膏0.3%，麥芽汁0.3%。pH 6. 8)。擴大培養斜面培養一富氏培養一巴氏培養細胞接種並培養將支架浸泡在麥芽汁中並過夜，第二天取出支架後，再將巴氏瓶 中的酵母細胞接種到支架上，接種細胞量為2X IO6Cells/支架。在20°C水浴搖床上，輕微 振蕩Ih後，將其移入96孔培養板中，再置於培養箱中在20°C靜置培養4天，每日早晚翻動
一次。組織工程細胞凝膠包衣片的製備取PVA、海藻酸鈉加熱配置成濃度分別為10. 0%和1. 5%的混合液200ml。初步膠化定型將製得的混合液滴於96孔板中的細胞片表面，隨後此板放入包衣 機中開冷風吹30分鐘至表面膠化；翻轉96孔板中的細胞片，在其表面再滴上上述混合液後 放入包衣機中開冷風吹30分鐘至表面膠化。二次膠化將初步凝膠包衣片從96孔板中取出，於0. 2mol/L CaCl2溶液中攪拌20 分鐘。然後用蒸餾水洗淨片表面的CaCl2。凍融二次膠化的凝膠包衣片經(-20°C ) 1個循環(12小時)凍融5次，增加PVA 外衣層的機械強度。凝膠層打孔把凍融後的凝膠包衣片放入IOOml 0. IM磷酸鹽溶液中振蕩40分鐘 進行化學侵蝕，使部分海藻酸鈣凝膠溶解，從而形成微通道以促進小分子原料和產物在凝 膠外衣層中的傳輸。透性化組織工程細胞凝膠包衣片的製備將組織工程細胞凝膠包衣片轉入0. IM磷酸鈉(NaPi) pH7. 0的緩衝液中，膨化後， 溶液換成0.05M磷酸鈉緩衝液。取出膨化後的組織工程細胞凝膠包衣片，再浸入IOOml 0. 1 % CTAB, 0. IM NaPi (pH7. 0)緩衝溶液於24°C保持30分鐘，過濾並用重蒸水洗淨，收集得 透性化細胞組織工程凝膠包衣片這種新型高效生物催化劑。用於催化合成手性醇。實例二將聚乳酸IOOg溶解於200ml氯仿溶液中，加入粒徑為206 310 μ m氯化鈉微晶 160g並混合均勻，按照每孔Iml裝於直徑約IOmm的96孔板中，風乾揮去氯仿成膠。24小 時後，將96孔板浸入蒸餾水中2天，洗淨氯化鈉即成。備用。以短小芽孢桿菌為種子細胞。菌株在含有LB瓊脂培養基的平板上生長5天。之 後接種到已在M9培養基中浸泡過夜的支架上，接種細胞量為IX IO6Cells/支架/孔。置 於培養箱中培養3天。取一定量的PVA和海藻酸鈉加熱至完全溶解，製成含15. 0% PVA和2. 0%海藻酸 鈉的混合液200ml。冷至室溫。將製得的混合液滴於96孔板中的細胞片表面，隨後此板放 入包衣機中開冷風吹20分鐘至表面膠化；翻轉96孔板中的細胞片，在其表面再滴上上述混 合液後放入包衣機中開冷風吹20分鐘至表面膠化。將初步凝膠包衣片從96孔板中取出，於0. 5mol/L CaCl2溶液中攪拌20分鐘。然 後用蒸餾水洗淨片表面的CaCl2。在_30°C凍融5次，每次12小時，增加PVA外衣層的機械強度。
把凍融後的凝膠包衣片放入100ml pH7. 0磷酸鹽溶液中振蕩40分鐘進行化學侵 蝕，使部分海藻酸鈣凝膠溶解，從而形成微通道。將已形成微通道的組織工程細胞凝膠包衣片浸入IOOml 0. 2 % CTAB, 0. IM磷酸鈉 (NaPi) pH7. 0緩衝溶液於24°C保持30分鐘，過濾並用重蒸水洗淨，收集得透性化細胞組織 工程凝膠包衣片這種新型高效生物催化劑。 用於催化合成手性醇。
權利要求
基於組織工程方法構建新型高效生物催化劑，其主要步驟為a)三維多孔支架的製備用適當溶劑將組織工程支架材料和適量致孔劑微晶(水溶性無機鹽)製成均勻的混合物，加入到多孔培養板中，風乾成膠後，用去離子水浸出微晶製成直徑5～10mm、厚度3～6mm的三維多孔支架。b)細胞接種於三維多孔支架培養先將上述支架浸泡於一定濃度培養基或麥芽汁中並過夜。將種子細胞經擴大培養後按一定量接種到支架上，置於1～50℃水浴搖床輕微振蕩1～200分鐘後，將其移入多孔培養板中，再置於培養箱中在4℃～40℃培養1～10天，製得組織工程細胞片。c)對組織工程細胞片進行凝膠包衣取一定量的聚乙烯醇(PVA)和海藻酸鈉加熱至完全溶解，製成PVA和海藻酸鈉的混合液。冷至室溫。將製得的混合液滴於多孔板中的組織工程細胞片表面，放入包衣機中冷風吹5～120分鐘至表面膠化；翻轉組織工程細胞片後，再在其表面再滴上上述混合液，放入包衣機中開冷風吹5～120分鐘至表面膠化。將凝膠包衣片從多孔板中取出，放入一定濃度CaCl2溶液中攪拌3～180分鐘。洗淨表面的CaCl2。反覆凍融，增加包衣層機械強度。製得組織工程細胞凝膠包衣片。d)凝膠包衣層脫鈣致孔把組織工程細胞凝膠包衣片放在一定濃度磷酸鹽或檸檬酸或EDTA溶液中振蕩一定時間，使凝膠層中的海藻酸鈣溶解形成微孔通道，便於物質傳輸。e)透性化將上述形成微孔通道後的組織工程細胞凝膠包衣片，放在十六烷基三甲基溴化銨溶液(CTAB)或甲苯或乙醇混合溶劑中，在4～40℃處理2～120分鐘，使細胞透性化，增加凝膠包衣片中細胞的酶活性。製得透性化組織工程細胞凝膠包衣片這種新型高效生物催化劑。液體環境所述PVA水溶液在0.01％～15％(W/V)；所述海藻酸鈉濃度在0.01％～6％(W/V)；所述CaCl2溶液濃度在0.1％～20％(W/V)；所述的磷酸鹽或檸檬酸或EDTA濃度為0.01～1mol/L；透性化處理所用CTAB或甲苯或乙醇混合溶劑溶液為0.01％到8％；透性化時間為1～60分鐘。
2.按照權利要求1所述的方法，其特徵在於步驟a)中所述的組織工程支架材料為天然 材料如絲素蛋白、膠原蛋白、明膠、海藻酸(鹽)、殼聚糖、瓊脂糖等，人工合成材料如脂肪族 聚酯、聚酸酐、聚乳酸等共聚物以及無機材料如羥基磷灰石等；所用溶劑為水、酸溶液、鹼溶 液、有機溶劑；致孔劑微晶採用粒徑50 1000微米氯化鈉等水溶性無機鹽，其用量為組 織工程支架材料無機鹽=1 1 1 10。
3.按照權利要求1所述的方法，其特徵在於步驟b)中所述細胞為酵母或其它真菌細 胞，或細菌和基因工程改造過的微生物細胞等，質量分數2% 80%。
4.按照權利要求1所述的方法，其特徵在於步驟c)中所述的凍融條件為-80°C 0°C， 1 10次，每次1 24小時。
5.按照權利要求1所述的方法，其特徵在於步驟d)中在磷酸鹽或檸檬酸或EDTA溶液 中振蕩，凝膠層打孔1 80分鐘。利用凝膠層海藻酸鈣對磷酸鹽溶液或其它鈣離子絡合劑 化學侵蝕的敏感性，通過化學侵蝕將細胞支架片上凝膠中的藻酸鹽部分溶解，從而形成空 穴，以提高在用生物催化劑催化劑進行生物催化反應時原料和產物的傳輸效率。
6.按照權利要求1所述的方法，其特徵在於步驟e)中，用CTAB、甲苯或乙醇混合溶劑 進行透性化處理，從而提高細胞內的酶活性。
7.按照權利要求1所述的方法，其特徵在於使用後的支架，經過去掉包衣層，洗淨細胞 後，可以再經過要求1中所述的步驟從b)、c)、d)到e)所述處理，重複應用。
全文摘要
通過結合組織工程與化學技術，製備新型高效生物催化劑的新方法。該法選用微生物為種子細胞擴大培養後接種於支架材料上再經組織培養，製成細胞-支架三維空間複合體結構的組織工程細胞片，其細胞載量達80％以上，且支架中仍有足夠通道供底物或產物進出；此片經聚乙烯醇/海藻酸鈉包衣、在氯化鈣溶液中成型、凍融成凝膠包衣片；包衣層中的海藻酸鈣膠在磷酸鹽中部分溶解形成微通道利於小分子傳遞；然後透性化處理提高凝膠包衣片中細胞胞內酶活性。從而構建細胞載量高、催化效力強、擴散限制小、機械強度好的透性化組織工程細胞凝膠包衣片這種新型高效生物催化劑，並以此替代傳統固定化細胞用於生物催化製備手性醇等重要手性藥物與醫藥化工中間體。
文檔編號C12N11/04GK101824407SQ20091010331
公開日2010年9月8日 申請日期2009年3月4日 優先權日2009年3月4日
發明者於明安, 侯毅, 黎剛 申請人:重慶醫科大學