無創微量採樣dna抽提試劑盒及dna抽提方法
2023-12-07 21:19:11
專利名稱：無創微量採樣dna抽提試劑盒及dna抽提方法
技術領域：
本發明屬於生物DNA檢測技術領域，具體涉及一種可快捷、廉價、無汙染、無創傷地進行人體DNA抽提的試劑盒及DNA抽提方法。
背景技術：
目前，對人體進行的採樣多為血液和組織等，使用的方法普遍為酚氯仿抽提法以及市面上現有的試劑盒。這樣的採樣方式不僅有損於人體，還會涉及到民族、宗教等敏感問題，而抽提效果也不盡理想。
傳統的酚氯仿抽提法，雖然能較高效地抽提血液DNA，但由於使用到大量的有機試劑，不僅會使抽提產物帶有化學抑制劑，影響到後續的一系列操作(PCR、酶反應和測序等)，且反覆的抽提、離心過程十分繁瑣耗時，同時抽提過程中多處使用到的有機試劑對實驗操作者本人的傷害較大。同時由於存在酚-氯仿汙染，獲取的DNA收穫率低，純度不高。
而市場上現有的DNA抽提試劑盒，雖然提取過程相對酚氯仿法操作簡單，步驟少，耗時較短，同時有效地降低了抽提產物汙染的風險。其DNA獲得效果與矽膠吸附法相仿。但由於成本高，一次提取DNA量小，無法在大規模生產應用中使用。
傳統的矽膠法著重於古DNA的提取分析。由於其對象特殊，試劑用量和具體操作條件不能直接應用於無創的微量或痕量樣本DNA提取。且其傳統矽膠法的參數設置較為模糊，實驗移植性、可重複性不強。
發明內容
本發明的目的在於提出一種能夠無創微量或痕量採樣，且能適應規模化生產使用的DNA抽提試劑盒及DNA抽提方法，以便克服現有的DNA抽提方法的不足，改變人體有損傷採樣的局面，提高抽提產物的質與量，且在一定程度上解決人體採樣難而敏感的問題。
本發明提出的無創微量採樣DNA抽提試劑盒，包含裂解液、矽膠吸附劑、洗滌液和洗脫液；其中，所述裂解液中含異硫氰酸胍溶液，裂解無創採樣或微量樣品中的細胞；所述矽膠吸附劑中包含粒徑為200nm-1μm的矽膠顆粒作為吸附載體，特異性吸附DNA；所述洗滌液包括含異硫氰酸胍溶液的洗滌液A、含乙醇溶液的洗滌液B和含丙酮溶液的洗滌液C三種洗滌液；所述洗脫液為1×TE溶液。
上述試劑盒中，所用溶液的組成如下(1).裂解液GuSCN(異硫氰酸胍)，EDTA，Tris-HCl，Triton X-100。
50-60gGuSCN
50-60ml 0.1M Tris-HCl pH 6.44.4-5ml 0.5MEDTA pH 8.01.3-1.5gTriton X-100(2).洗滌液AGUSCN(異硫氰酸胍)，Tris-HCl。
100-120gGuSCN90-100ml0.1M Tris-HCl pH 6.4(3).洗滌液B70-75％乙醇(4).洗滌液C丙酮(5).洗脫液Tris-Hcl，EDTA(滅菌)。
本發明的試劑盒中，操作採用單管式方式進行，過程中無須更換eppendorf管，這不僅最大程度地防止了有效DNA成分的流失，以及提取過程的轉移帶來的汙染，還能節省資源，降低成本。且該試劑盒應用另外單管式操作是「原孔原位」抽提的基礎，這將成為產業化的理想模式，可結合96孔板進行大通量規模化成批抽提。
使用本發明的試劑盒進行DNA(人體)抽提的步驟如下(1)提取樣品放入樣品管內。
(2)加1-1.5mL裂解液，放入50-56℃溫浴中充分反應；(3)加50-100μl(可根據實際情況調整)矽膠吸附劑，混勻，充分顛換；(4)充分離心，棄上清；(5)用1-1.5mL洗滌液A重懸，充分離心，棄上清；重複本步驟1次；(6)用1-1.5mL洗滌液B重懸兩次，充分離心；(7)用1-1.5mL洗滌液C重懸一次，充分離心；(8)室溫烘2-5min；(9)加50-100μl洗脫液，56-65℃溶解；(10)離心，取上清。
本發明的有益效果是，可以在人體無創傷採樣的基礎上有效地進行DNA抽提，提高了抽提產物的質與量，且抽提產物能滿足後續一系列操作。
經實驗對比表明，本發明試劑盒抽提口腔細胞DNA在方法上可行，效率明顯高於普通的酚氯仿法，同目前的試劑盒(博光)抽提結果類似。見圖1-圖3所示。
本發明試劑盒抽提整個抽提過程約為1-1.5小時，明顯比酚氯仿法快捷，如果加上RNaseA的DNA純化步驟，略慢於一般的試劑盒抽提法。
本發明試劑盒單個成本約為1.5～2RMB，遠低於一般的試劑盒成本。
本發明試劑盒由於採用矽膠吸附DNA的方法進行提取，棄用雜質時操作較酚氯仿法更為簡便。
本發明是基本按照裂解、吸附、清洗、洗脫的過程將DNA提取出來。由於讓DNA吸附在矽膠上，從而進行不斷地清洗提取，最後從矽膠上洗脫出純化後的DNA，故亦稱為矽膠吸附法。矽膠吸附法通過吸附住DNA，並對吸附了DNA的矽膠在溶液中沉澱或不沉澱的狀態控制，從而能更方便的處理上清，簡化了操作和避免了汙染。能夠在相對較短時間內對大批人體無創微量樣品中進行快速高效的DNA提取。
圖1-圖3為分別用本發明試劑盒、酚氯仿法和通常的DNA試劑盒，從相同等量口腔細胞樣品中提取DNA的效果比較。其中，1、2為用本發明的試劑盒抽提結果，3、4為用酚氯仿法抽提結果，5、6用通常的試劑盒法抽提結果。
圖1、抽提電泳未做RNaseA消化前，3、4、5、6都參雜很多RNA，效果很差。
圖2、經RNaseA 55℃30min處理。可見，用本發明試劑抽提結果優於一般試劑盒方法更優於酚氯仿方法。
圖3、PCR產物電泳檢測(Taq I，zdd)。各DNA均有明顯PCR產物條帶。
圖4人體頭髮及唾液DNA提取產物凝膠電泳圖譜。圖中，1-3分別為1、3、5根頭髮的DNA抽提物，4、5均為唾液樣DNA抽提產物。
圖5人體頭髮及唾液DNA提取產物PCR產物檢測。圖中，1-3分別為1、3、5根頭髮DNA的PCR產物，4空白對照組，5、6唾液DNA的PCR產物，具體實施方式
實施例1，試劑盒各組分的配置溶液成份(1)裂解液GuSCN(異硫氰酸胍)，EDTA，Tris-HCl，Triton X-100；(2)洗滌液AGUSCN(異硫氰酸胍)，Tris-HCl；(3)洗滌液B70％乙醇；(4)洗滌液C丙酮；(5)洗脫液Tris-Hcl，EDTA(滅菌)。
實施例2，人體頭髮及唾液DNA提取首先進行無創微量採樣(1)頭髮拔取實驗對象的頭髮，分別取1根、3根、5根，用潔淨乾燥的剪刀剪取髮根基部約0.5-1cm置於1.5mL的eppendorf管中；(2)唾液用1.5mL的eppendorf管直接裝取實驗對象的唾液約0.3mL。
具體抽提步驟如下(1)分別加入裂解液1mL，56℃水浴1h；(2).加20μl矽膠吸附劑混勻，充分顛換；(3)充分離心後，棄上清；(4)1mL洗滌液A重懸，充分離心，棄上清。重複該步驟一次；(5)1mL洗滌液B重懸兩次，充分離心；(6)1mL洗滌液C重懸一次，充分離心；(7)室溫烘乾2-5min；(8)加50μl洗脫液，65℃溶解；(9)離心，取上清。
實施例3，DNA提取產物的檢驗對實施例2中得到的抽提產物經紫外分光光度計於260nm處測定，計算可得，1、3、5根頭髮DNA提取量分別約為100ng、300ng、500ng，0.3mL唾液DNA提取量約為2.0ug，換算成實驗次數分別為10、30、50、200次。抽提物的凝膠電泳圖譜見圖4所示。
實施例4，DNA提取產物的PCR鑑定對實施例2中得到抽提產物用PCR鑑定，1.PCR擴增反應所用引物為L159745』TCCACCATTAGCACCCAAAG 3』H164885』AGGAACCAGATGTCGGATACAG 3』引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。
2.反應循環條件為 3.反應體系10μlPCR結果見圖5所示。
權利要求
1.一種無創微量採樣DNA抽提試劑盒，其特徵在於包含裂解液、矽膠吸附劑、洗滌液和洗脫液；其中，所述裂解液中含異硫氰酸胍溶液；所述矽膠吸附劑中包含粒徑為200nm-1μm的矽膠顆粒作為吸附載體，特異性吸附DNA；所述洗滌液包括含異硫氰酸胍溶液的洗滌液A、含乙醇溶液的洗滌液B和含丙酮溶液的洗滌液C三種洗滌液；所述洗脫液為1×TE溶液。
2.根據權利要求1所述的無創微量採樣DNA抽提試劑盒，其特徵在於所述的各溶液組分如下(1).裂解液50-60g 異硫氰酸胍50-60ml0.1M Tris-HCl pH 6.44.4-5ml0.5MEDTA pH 8.01.3-1.5g Triton X-100(2).洗滌液A100-120g 異硫氰酸胍90-100ml 0.1M Tris-HCl pH 6.4(3).洗滌液B70-75％乙醇(4).洗滌液C丙酮(5).洗脫液Tris-Hcl，EDTA。
3.一種如使用如權利要求1所述的無創微量採樣DNA抽提試劑盒抽提DNA的方法，其特徵在於具體步驟如下(1).提取適量樣品放入樣品管內；(2).加1-1.5mL裂解液，放入50-56℃溫浴中充分反應；(3).加50-100μl矽膠吸附劑，混勻，充分顛換；(4).充分離心，棄上清；(5)用1-1.5mL洗滌液A重懸，充分離心，棄上清；重複本步驟一次；(6).用1-1.5mL洗滌液B重懸兩次，充分離心；(7).用1-1.5mL洗滌液C重懸一次，充分離心；(8).室溫烘2-5min；(9).加50-100μl洗脫液，56-65℃溶解；(10).離心，取上清。
全文摘要
本發明屬於生物DNA檢測技術領域，具體為一種無創微量採樣DNA抽提試劑盒及DNA抽提方法本發明的試劑盒中包含裂解液、矽膠吸附劑、洗滌液和洗脫液。使用該試劑盒法抽提的DNA產物含量及質量能很好滿足後續PCR、測序等等的一系列操作。使用本發明的試劑盒，操作採用單管式方式進行，可有效防止了DNA成分的流失，避免了提取過程的轉移帶來的汙染，且「原孔原位」的抽提模式，可結合96孔板進行大通量規模化成批抽提，有利於產業化發展。本發明，克服了現有的DNA抽提方法繁瑣耗時、效率不高的局限性，不僅能有效地提高抽提產物的質與量，且在一定程度上解決了人體採樣難而敏感的問題。
文檔編號C07H21/00GK101050414SQ20071004055
公開日2007年10月10日 申請日期2007年5月11日 優先權日2007年5月11日
發明者朱曄一, 劉啟昆, 閆鵬榮, 邵敏華 申請人:復旦大學