一種在絲狀噬菌體上高密度表達目的多肽的方法和應用的製作方法

2023-11-30 12:33:06

專利名稱：一種在絲狀噬菌體上高密度表達目的多肽的方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，涉及多肽表達，具體涉及一種將多肽表達在絲狀噬菌體的方法及其應用。
背景技術：
噬菌體展示技術(phage display)是一種基因表達篩選技術，通過將目的基因插入噬菌體衣殼蛋白的基因中，使外源基因產物與衣殼蛋白融合，伸展在噬菌體表面， 並從表達的外源蛋白的噬菌體群體(庫)中篩選出帶有特異外源蛋白的重組噬菌體，以直接檢測表達產物的某些活性。絲狀噬菌體是一種絲狀病毒顆粒，長880nm，直徑6 7 nm，其基因組為6. 4 kb單鏈環狀DNA，編碼10種不同蛋白質。其主要衣殼蛋白(gp8)有 2700個左右拷貝，圍繞DNA呈螺旋對稱管狀排列，覆蓋於噬菌體的體部。gp8蛋白的N 端游離在外，外源肽通過柔性接頭與其N端連接，這一結構對於在主要外殼蛋白表面展示外源多肽具有特殊意義。通過分子生物學方法，將目的多肽的基因導入至噬菌體的主要衣殼蛋白gp8基因上，可以獲得融合表達有目的多肽的噬菌體。由於主要衣殼蛋白gp8的拷貝數量有2700-3000個，因此可得到高密度的表達的多肽，目前，在絲狀噬菌體病毒表達的高密度多肽可主要用於以下三個方面
1、有毒有害化學物質模擬表位肽的表達及其在免疫學檢測方法中的應用研究當前，大量有毒有害化學物質如黃麴黴毒素仏、赭麴黴毒素A、玉米赤黴烯酮等對人體健康和環境造成了嚴重危害，以酶聯免疫吸附分析方法為代表的免疫學檢測方法具有較高的靈敏度和特異性，對樣品的純度要求不高，且操作簡單，特別適合於大批量樣本的檢測， 已被廣泛應用黃麴黴毒素B1、赭麴黴毒素A、玉米赤黴烯酮等有毒有害物質的快速檢測。大多數有毒有害物質屬小分子物質，沒有供二株不同抗體結合的表位，必須採用競爭免疫分析方法進行檢測。因此，需要製備用於競爭免疫分析的競爭抗原。常規製備競爭抗原用化學方法將這些有毒有害物質與載體偶聯，該方法存在以下弊病①試劑本身含有毒有害物質，若操作不慎，會對生產和操作人員的健康造成極大的危害，並可導致二次汙染等環保隱患。②大多數標準品依賴進口，部份標準品難以獲得且價格昂貴，使檢測試劑的成本居高不下。③偶聯反應的重複性差，部份標準品不穩定，致使檢測產品的質量難以控制。由此，科學家們設想用有毒有害物質的替代品參與免疫競爭反應，建立無毒的免疫學檢測方法。新興的噬菌體隨機肽庫展示技術可高效挑選出能與靶分子相結合的噬菌體，並利用這些噬菌體再感染大腸桿菌進行擴增，即可獲得能模擬該靶分子表位的肽(模擬表位肽)。將這些有毒有害物質的模擬表位肽的基因導入至噬菌體的主要衣殼蛋白gP8基因上，可得到表達在絲狀噬菌體表面的高密度模擬表位；噬菌體在保存條件下相當穩定，易於擴增，吸附力強，可做成固相競爭抗原，從而達到替代有毒有害物質競爭抗原，建立無毒免疫檢測方法及產品的目的。2、難以獲得或傳染性強的病毒的抗原表位肽的表達及其在免疫學檢測方法中的應用在臨床上，通常對B肝病毒、C肝病毒和愛滋病病毒等的診斷需要檢測患者血液中相應抗體，就必須使用這些病毒的相關抗原，而這些病毒一般是具有較強傳染性或難以在體外培養的病毒，因此這些病毒的抗原難以通過常規手段獲得。有不少通過基因工程的方法， 將這些病毒的抗原進行大規模製備。噬菌體隨機肽庫展示技術也為這些抗原的製備提供了新的切入點。將這些病毒的抗原表位肽的基因導入至噬菌體的主要衣殼蛋白gp8基因上， 可得到表達在絲狀噬菌體表面的高密度抗原表位；噬菌體在保存條件下相當穩定，易於擴增，吸附力強，可做成檢測抗原，用於這些病毒的抗體檢測，從而達到替代病毒抗原，建立無病毒免疫檢測方法及產品的目的。3、高密度抗原表位肽在製作亞單位疫苗的應用
用抗原表位胺基酸序列製備的疫苗稱為抗原表位疫苗，包括合成肽疫苗和重組抗原表位亞單位疫苗。本發明涉及的是重組亞單位疫苗。合成肽與載體分子連接後可誘導很好的免疫應答，但很少能在接種動物中產生長期保護性免疫反應。而重組抗原表位亞單位疫苗採用DNA重組的方式，外源抗原表位可插入載體分子上，並可在真核或原核系統中進行複製和表達。迄今人們已經發展了許多這樣的具有顆粒樣結構的外源抗原表位表達載體系統，如HBV核心抗原(HBcAg)和HBsAg載體系統，在重組杆狀病毒中表達的HIV- 1 gag蛋白載體系統、輪狀病毒(RV)Vp6蛋白載體系統、藍舌病毒核心顆粒載體系統，以及絲狀的和二十面體的噬菌體載體系統等。利用絲狀噬菌體系統表達的亞單位苗具有培養條件簡單， 成本低、噬菌體易於提純和保存等優點，是一種很有應用潛力的亞單位疫苗表達系統。絲狀噬菌體載體pC89是一個常用的噬菌體主要衣殼蛋白表達載體，曾應用於製備B型肝炎病毒亞單位疫苗和人心肌肌鈣蛋白I抗原及抗原表位的免疫原性等研究，在國內外眾多實驗室都有保存。如國內第三軍醫大學免疫研究所吳玉章萬瑛、南京藥科大學沈子龍和山西農業大學劉志宗等，以下是羅列的部分相關論文
0豬肺炎支原體P46基因特異性噬菌體隨機肽庫的構建《畜牧與獸醫》2009年10 期-劉志宗，葛亞明，寧紅梅，張映，聶向庭
0用PlII及PVIII噬菌體展示系統展示抗原和抗原表位的免疫原性的研究《中國藥科大學學報》2004年6期-吳國球，勞心珍，孫宏偉，黃立新，張粉梅，錢娟英，盧惠霞，沈子龍 0絲狀噬菌體呈現顆粒的免疫特性和抗原遞呈途徑研究[學位論文]萬瑛，2002 -第三軍醫大學免疫學
0人心肌肌鈣蛋白I及其抗原表位的噬菌體展示及化學發光免疫分析檢測方法的建立 [學位論文]吳國球，2003 -中國藥科大學微生物與生化藥學
0乳腺癌原位和骨轉移靶向載體研究[學位論文]董堅，2008 -昆明醫學院外
科學
0乳腺癌基因治療特異性多肽載體的研究[學位論文]劉為青，2008 -昆明醫學院腫瘤學
研究證明絲狀噬菌體展示疫苗能有效激發細胞免疫和體液免疫，它不僅能用來表達有毒有害物質模擬表位肽，表達難以獲得或傳染性強的病毒的抗原表位肽，還能用於發展多肽疫苗。該載體巧妙地在絲狀噬菌體主要衣殼蛋白gp8的信號肽(或稱前導肽)與成熟肽核苷酸序列之間構建了兩個酶切位點(且唯一)-.EcoR I. B_H I (見圖1)，目的多肽對應的核酸序列可通過基因工程手段插入，構建重組的噬菌體載體(見圖2)，將其轉化到宿主菌後，再加入輔助噬菌體進行超感染擴增，就可獲得重組噬菌體，目的多肽會隨gp8蛋白的表達、成熟而暴露於重組噬菌體主要衣殼蛋白的氨基端。利用噬菌體gp8展示系統具有三大獨特優勢1)多肽密度高。由於外源多肽拷貝數量大，可獲得高密度多肽分子，產生足夠的免疫效力。2)易於純化。重組噬菌體為溫和噬菌體，成熟的噬菌體可分泌到培養基中，純化步驟簡單、不要求昂貴的試劑與設備，在一般的實驗室條件下就可以完成。3)成本低廉。噬菌體載體的宿主為大腸桿菌，培養簡單，成本低，為疫苗的普及提供可能。但是，PC89載體也存在一些不足之處，本發明人通過多年的研究驗證表明當將赭麴黴毒素A等有毒有害物質的模擬表位肽導入到主要衣殼蛋白gp8後，雖然可以實現高密度表達，表達的模擬表位肽也可以與抗體結合，但結合效率較低。同樣，如果將一些病毒的保護性抗原表位肽採用PC89載體表達亞單位疫苗，有時會改變原有保護性抗原表位肽的抗原性，使該疫苗的特異性受到幹擾，直接影響疫苗的保護效果。因此，迄今為止，採用 PC89載體所表達的模擬表位或亞單位疫苗都沒有真正形成有效的產品。那麼提供一種方法，對PC89載體以上缺點進行彌補改善，提高其表達出來的模擬表位肽與抗體的結合效率及其製備疫苗時的特異性等，顯得非常有必要。

發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種方法，既能保留絲狀噬菌體PC89表達密度高等優點，又能解決目前用PC89載體表達出來的模擬表位肽與抗體結合率較低、製備出的亞單位疫苗的特異性受到幹擾等問題。經過本發明人的多年研究發現，以上缺點是由於PC89載體的先天缺陷造成的 EcoR I酶切位點GAATTC及其上遊的9個核苷酸序列所編碼的5個胺基酸殘基AEGEF在 gp8蛋白的表達，在前導肽切除後，仍然保留在目的多肽的N端，使目的多肽不能完全暴露， 根據以往的免疫學理論，抗體與線性抗原表位的結合只與抗原表位的胺基酸序列有關，而與抗原表位以外的其它胺基酸序列無關.因此，一般認為這幾個多餘的胺基酸酶切位點GAATTC上遊的9個核苷酸序列所編碼的5個胺基酸殘基AEGEF)不會對抗原抗體的結合產生影響。因此，國內外學者在使用該載體表達目的多肽時，都沒有考慮到這幾個多餘胺基酸的影響。事實上，本發明人實驗表明正是這幾個多餘胺基酸/酶切位點GAATTC上遊的9個核苷酸序列所編碼的5個胺基酸殘基AEGEF)的存在，使得當將赭麴黴毒素A等有毒有害物質的模擬表位肽導入到主要衣殼蛋白gp8後，雖然可以實現高密度表達，表達的模擬表位肽也可以與抗體結合，但由於多餘胺基酸表達產生空間位阻的影響，使目的多肽在絲狀噬菌體gp8蛋白上不能完全暴露，抗體與模擬表位的結合的效率受到影響，結合效率較低。另外，由於前面這幾個多餘的胺基酸的存在，在一些病毒的保護性抗原表位肽採用 PC89載體表達亞單位疫苗時，會引入新的抗原表位，甚至改變原有保護性抗原表位肽的抗原性，導致該疫苗的特異性受到幹擾，直接影響疫苗的保護效果。為了解決以上問題，本發明提出了以下的解決方案將多肽表達在絲狀噬菌體主要衣殼蛋白gp8氨基端的方法，暨為絲狀噬菌體pC89的先天缺陷提供後天補救措施。該補救措施的思想為「先加後減」，通過構建含腸激酶酶切位點天冬氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸-賴氨酸(DDDDK)序列與目的多肽核酸序列的重組噬菌體(見圖3)，使目的多肽N端連接腸激酶酶切位點，表達產物經腸激酶作用，將氨基端的腸激酶酶切位點DDDDK切除，使目的多肽直接位於絲狀噬菌體主要衣殼蛋白氨基端。具體來說，為解決上述技術問題本發明提供如下技術方案，它包括如下步驟
(1)人工序列的設計與合成用化學方法合成二條5'端分別有feoTP/和ife ///核酸內切酶位點的互補核苷酸序列，其含有能表達成腸激酶酶切位點天冬氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸-賴氨酸(DDDDK)的核苷酸序列、以及目的多肽的核苷酸序列；
(2)序列導入噬菌體載體pC89將二條互補序列退火後形成的DNA片段與經^和 BamHI酶切的噬菌體載體pC89在DNA連接酶作用下連接，連接產物轉化感受態的大腸桿菌 (fedaricAacWi)細胞，選擇性培養基培養，挑單菌落進行陽性克隆鑑定；
(3)重組噬菌體的表達與純化陽性克隆加入誘導物和輔助噬菌體進行擴增培養，收穫並純化表達有腸激酶酶切位點DDDDK和目的多肽的重組噬菌體。(4)將獲得的重組噬菌體經腸激酶酶切，得到高密度表達在絲狀噬菌體主要衣殼蛋白氨基端的目的多肽。作為本發明的變化，在人工序列的設計與合成中，還可以在表達成腸激酶酶切位點DDDDK的核苷酸序列前端接上能表達成任意短肽的核苷酸序列。由於腸激酶可以將表達產物的腸激酶位點連帶腸激酶前端連接的任意胺基酸片段酶切去除，所以在表達成腸激酶酶切位點DDDDK的核苷酸序列前端接或不接能表達成任意短肽(0-100個胺基酸長度)的核苷酸序列，其酶切後得到的高密度模擬表位肽相同。那麼，在人工序列的設計與合成中，用化學方法合成二條5 『端分別有核酸內切酶紅飫EcoRI琳BamHI的互補核苷酸序列，其含有能表達成腸激酶酶切位點DDDDK的核苷酸序列、目的模擬表位。即使在能表達成腸激酶酶切位點DDDDK的核苷酸序列前端接上能表達成任意短肽(0-100個胺基酸長度)的核苷酸序列，也落入本發明的保護範圍之內。結合附圖4來說明DDDDK為腸激酶酶切位點，GAATTC為/酶切位點，在腸激酶酶切位點前還可以接上能表達成任意短肽(0-100個胺基酸長度)的核苷酸序列，圖中以 (NNN) m，m=0-100來表示，接不接上(NNN) m，m=0_100，表達產物經腸激酶酶切後得到的高密度模擬表位肽相同。本發明還涉及到上述方法得到的高密度目的多肽作為競爭抗原或檢測抗原在免疫學檢測方法中的應用。該方法在免疫學檢測方法中的應用，特別涉及到以所得的高密度模擬表位肽作為競爭抗原替代人工化學合成赭麴黴毒素A、黃麴黴毒素&、玉米赤黴烯酮和桔黴素等抗原用於免疫檢測。該方法的應用，還涉及到方法得到的高密度目的多肽作為難以獲得或傳染性強的病毒抗原的替代品，應用於檢測這些病毒的相應抗體。特別涉及到將依方法所得的愛滋病高密度抗原表位肽、甲型Hmi流感病毒高密度抗原表位肽、流感病毒H3N2高密度抗原表位肽或C肝高密度抗原表位肽作為檢測抗原替代純化的病毒抗原用於檢測抗病毒抗體的方法和產品。本發明還涉及到該方法得到的高密度抗原表位肽在製作亞單位疫苗的應用。
還特別涉及到豬圓環病毒II型的高密度抗原表位肽、甲型Hmi流感病毒高密度抗原表位肽、流感病毒H3N2高密度抗原表位肽、C肝病毒高密度抗原表位肽在製作其亞單位疫苗中的應用。本發明具有如下優點本發明製備出的多肽，不僅延承了絲狀噬菌體主要衣殼蛋白表達載體所具有的密度高等優點，而且彌補了 PC89質粒表達的多肽氨基端必定攜帶五個胺基酸殘基的「先天缺陷」，保證了多肽直接暴露於主要衣殼蛋白氨基端，進一步增強了多肽的特異性，使得表達出來的模擬表位肽與抗體的結合效率提高了 10倍以上。重組表達並經腸激酶處理的噬菌體顆粒直接展現外源蛋白、易於製備純化且較為穩定。表達產物同樣無需偶聯載體蛋白，可直接提純後作為檢測抗原廣泛應用於赭麴黴毒素A、黃麴黴毒素 B1、玉米赤黴烯酮、愛滋病病毒、C型肝炎病毒等的免疫學檢測中，並且可以擴增，使成本大為降低，且安全無毒保護了操作人員的身體健康，具有良好的經濟效益和市場前景；同時， 用於製備亞單位疫苗時，減少了 PC89攜帶的五個胺基酸殘基表達產物可能干擾疫苗特異性的問題。


圖1為pC89原載體。圖2為一般方法構建的pC89重組載體。圖3為本專利方法構建的pC89重組載體[含能表達成腸激酶酶切位點天冬氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸-賴氨酸(DDDDK)的核苷酸序列]。圖4為本專利方法構建的pC89重組載體局部序列。圖5無毒ELISA分析方法中赭麴黴毒素A標準品以及合成多肽的競爭抑制曲線。圖6赭麴黴毒素A標準品與合成多肽的劑量關係回歸直線圖。圖7合成多肽的競爭抑制曲線。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明作進一步說明，但所述實施例不以任何形式限制本發明。實施例1。赭麴黴毒素A的高密度分子模擬表位肽的製備方法 (1)模擬表位表達載體的構建及鑑定
根據赭麴黴毒素A的模擬表位序列，用化學方法合成二條5'端分別有核酸內切酶位紅EcoRI琳BernHI的互補核苷酸序列，其含有能表達成腸激酶酶切位點DDDDK的核苷酸序列、以及赭麴黴毒素A模擬表位核苷酸序列。合成T1 :5 『 - MTTCgACgACgACgACAAgATTCg TCCTATggTg -3 『 ( EcoRI )和 T2 5 『 - GATCCACCATAGGACGAATCTTGTCGTCGTCGTCG -3 『(BamHI)，加dd H2O分別配成20pmol/ μ L的寡聚核苷酸單鏈溶液，各取10 μ L混合後， 置於PCR儀，65°C保溫10 min，然後緩慢降溫至室溫。下劃線部分為核酸內切酶位點，邊框部分為DDDDK的核苷酸序列，加粗部分為模擬表位的核苷酸序列，以下同此。(2)序列導入噬菌體載體擴增、鑑定；
取 pC89 質粒 DNA 32 μ L (30 μ g)，力口 10 X 酶切 buffer 4μ L, EcoRI (10 U/μ L)2 μ UBamHI (10 U/μ L) 2μ L,37°C 酶切 2 h，65°C 20 min 滅活，2. 5 % 瓊脂糖電泳觀察結果。在紫外燈下迅速切下目的條帶，用UNIQltl膠回收試劑盒回收。將回收後的pC89 DNA 片段與雙鏈寡聚核苷酸連接。連接反應體系雙鏈寡聚核苷酸4yL，pC89載體DNA 4yL, T4 DNA Iigase (10 U/μ L) 1 μ L, 10ΧΤ4 DNA ligation buffer lyL，總體積 10 μ L， 16°C連接過夜。連接液全量轉化大腸桿菌感受態細胞，熱激後塗布已加入40 μ L X-gal (4 mg/ mL)及4yL ITPG (40 mg/mL)的含Amp的LB平板，37°C培養過夜，挑單菌落擴增細胞進行陽性克隆鑑定。(3)重組噬菌體的表達
經鑑定後的陽性克隆挑單菌落接種於2mL Amp + Tet雙抗SOC培養液中，37°C振蕩培養2h，轉移至400mL Amp + Tet雙抗SOC培養液中，37°C振蕩培養至A_約0.4時，加入 IXlO12 PFU的輔助噬菌體VCSM13，37°C振蕩培養1 h，再加入終濃度為70mg/ L的卡那黴素以及終濃度為lmmol/ L的ITPG，37°C振蕩培養過夜。(4)高密度模擬表位蛋白的純化
將培養液4 0C IOOOOrpm離心lOmin，上清液加入PEG/ NaCl，4 °C沉澱過夜；4 °C IOOOOrpm離心15min，去上清，再用1 mL TBST懸浮噬菌體，加入PEG /NaCl冰上孵育60 min ；4°C離心15min，去上清，沉澱用200 μ L TBST懸浮並測滴度，4° C保存。(5)腸激酶酶切取純化好的模擬表位蛋白50 μ L，加入1 μ L腸激酶，22°C過夜，純化，4° C或-20° C保存。(6)抗體結合性能測定
A、用磷酸緩衝溶液(PBS，pH7. 2)將高密度表位蛋白配製成40、20、10、5、2. 5,1. 25和 0. 625 μ g/mL的濃度，按每條酶標板一個濃度(每條8個孔)，每孔100 μ L加入酶標板中，4°C 過夜。B、傾去包被液，PBST (PBS加0.洲的吐溫20)洗滌三次，每次在厚疊吸水紙上扣幹， 每孔加入300 μ L 3%的脫脂牛奶(溶於PBST)作為封阻液，37°C保溫保溼1小時；傾去封阻液，PBST洗滌三次，每次在厚疊吸水紙上扣幹。C、將抗體用 PBS 倍比稀釋成 1 :1000,1 :2000,1 :4000,1 :8000,1 :16000,1 -.32000 和1 :64000的濃度，依次加入各條處理好的酶標板板孔中，最後一孔加入PBS作空白對照， 37 °C保溫保溼1小時。D、PBST洗板三次，每次在厚疊吸水紙上扣幹。每孔加100 μ L辣根過氧化物酶標記的抗抗體(酶標二抗)，37°C，保溫保溼1小時。E、PBST洗板三次，每次在厚疊吸水紙上扣幹。每孔加OPD或TMB底物液100 μ L， 37°C保溫保溼避光反應10分鐘後，每孔加入50 μ L 2Μ H2SO4終止反應，以空白對照孔調零，在酶標儀上測定酶標板492nm (OPD)或450nm (TMB)的吸光值，
F、根據吸光值在1. 5-2. 0左右的最低表位蛋白包被濃度和最大抗體稀釋倍數比較抗體的結合性能。包被濃度越低，抗體稀釋倍數越大則抗體結合性能越好。結果(按此實施例，表位蛋白包最低被濃度為2. 5 μ g/mL，最大抗體稀釋倍數為 1 :20000。包被濃度越低，抗體稀釋倍數越大則抗體結合性能越好。)
實施例2
作為實施例1的變化，在人工合成序列合成中，在能表達成腸激酶酶切位點DDDDK的核苷酸序列前端接上能表達成任意短肽(0-100個胺基酸長度)的核苷酸序列，本發明以兩條序列分別接上GGGGGG和CCCCCC為例說明
化學合成1\:5' -AATTCGGGGGGgACgACgACgACAAgATTCgTCCTATggTg -3 『 ( EcoRI ) 和 T2 5 『 - GATCCACCATAGGACGAATCTTGTCGTCGTCGTCCCCCCCG -3 『 (BamHI)，加 dd H2O 分別配成20pmol/yL的寡聚核苷酸單鏈溶液，各取10 μ L混合後，置於PCR儀，65°C保溫10 min，然後緩慢降溫至室溫。其它步驟同實施例1。結果(按此實施例，表位蛋白包最低被濃度為2. 5 μ g/mL，最大抗體稀釋倍數為 1 :20000。包被濃度越低，抗體稀釋倍數越大則抗體結合性能越好。)
實施例3
作為實施例1的變化，在人工合成序列合成中，在能表達成腸激酶酶切位點DDDDK的核苷酸序列前端接上能表達成任意短肽(0-100個胺基酸長度)的核苷酸序列，本發明以兩條序列分別接上TGTAAC和GTTACA為例說明
化學合成1\:5' -AATTCTGTAACgACgACgACgACAAgATTCgTCCTATggTg -3 『 ( EcoRI ) 和 T2 5 『 - GATCCACCATAGGACGAATCTTGTCGTCGTCGTCGTTACAG -3 『 (BamHI)，加 dd H2O 分別配成20pmol/yL的寡聚核苷酸單鏈溶液，各取10 μ L混合後，置於PCR儀，65°C保溫10 min，然後緩慢降溫至室溫。其它步驟同實施例1。結果(按此實施例，表位蛋白包最低被濃度為2. 5 μ g/mL，最大抗體稀釋倍數為 1 :20000。包被濃度越低，抗體稀釋倍數越大則抗體結合性能越好。)
實施例4
作為實施例1的變化，在人工合成序列合成中，在能表達成腸激酶酶切位點DDDDK的核苷酸序列前端接上能表達成任意短肽(0-100個胺基酸長度)的核苷酸序列，本發明以兩條序列分別接上 GATGGGGGGGGGGGCCCCCTTTTTTTTTTAAAAACTGTC 和 GACAGTTTTTAAAAAAAAAACCC CCCCCCCCCCCCCATC 為例說明
化學合成 T1 5 『 -AATTCGATGGGGGGGGGGGCCCCCTTTTTTTTTTAAAAACTGTCgACgACgACgAC AAgATTCgTCCTATggTg -3 『 ( EcoRI )禾口 T2 5 『 - GATCCACCATAGGACGAATCTTGTCGTCG TCGTCGACAGTTTTTAAAAAAAAAACCCCCCCCCCCCCCCCATCG -3 『 (feffl/Υ/)，加 dd H2O 分別配成 20pmol/yL的寡聚核苷酸單鏈溶液，各取10 μ L混合後，置於PCR儀，65°C保溫10 min, 然後緩慢降溫至室溫。結果(按此實施例，表位蛋白包最低被濃度為2. 5 μ g/mL，最大抗體稀釋倍數為 1 :20000。包被濃度越低，抗體稀釋倍數越大則抗體結合性能越好。)
其它步驟同實施例1。實施例5切除多餘胺基酸帶來的效果比較試驗
為了對比採用此發明帶來的實質性改變，本實施例用化學方法合成二條5'端分別有核酸內切酶位點EcoRI和BeimHI的互補核苷酸序列，其含有赭麴黴毒素A模擬表位核苷酸序列(以不含腸激酶酶切位點DDDDK的核苷酸序列)做為對照。現以一赭麴黴毒素A模擬表位肽為例。(1)模擬表位表達載體的構建及鑑定根據赭麴黴毒素A的模擬表位序列，用化學方法合成二條5'端分別有核酸內切酶位點EcoRI和BamHI的互補核苷酸序列，其含有能表達成赭麴黴毒素A模擬表位的核苷酸序列。同樣 T3 5 『 - MTTCATTCgTCCTATggTg _3 『 (EcoRT)禾口 T4 5 『-GATCCACCATAGGACGMTG -3 『 (fea/Y/)，各取 10 μ L· 混合後，置於 PCR 儀，65°C 保溫 10 min,
然後緩慢降溫至室溫。其它步驟同實施例1 (無需腸激酶酶切步驟)。結果分析(按此實施例，在抗體結合性能測定中，模擬表位蛋白包最低被濃度為 50 μ g/mL，最大抗體稀釋倍數為1 :4000。那麼，對比實施例1、2、3、4，切除多餘胺基酸後，表達產物與抗體的結合性能均為切除前表達產物的20倍。可見，切除多餘胺基酸後，表達產物與抗體的結合性能大為提高。同時，實施例1-4相互比較，可發現在能表達成腸激酶酶切位點DDDDK的核苷酸序列前端接上0-100長度的短肽，不影響腸激酶酶切後產物與抗體的結合性能。)
實施例6黃麴黴毒素B1的高密度分子模擬表位肽的製備方法 (1)模擬表位表達載體的構建及鑑定
根據黃麴黴毒素B1的模擬表位序列，用化學方法合成二條5'端分別有核酸內切酶位紅EcoRI琳BernHI的互補核苷酸序列，其含有能表達成腸激酶酶切位點DDDDK的核苷酸序列、以及黃麴黴毒素B1模擬表位。現以一黃麴黴毒素Bl模擬表位肽為例，
合成 T1 :5 『 - MTTCgACgACgACgACAAgCATCCTAgTgATCCgCgTCATGGG -3 『 ( EcoRI ) 和 T2 5 『 - rATCCCCATrACrCrrATCACTArrATrCTTrTCrTCrTCrTCr -3 『 (BamHI)，加 dd H2O分別配成20pmol/yL的寡聚核苷酸單鏈溶液，各取10 μ L混合後，置於PCR儀，65°C 保溫10 min，然後緩慢降溫至室溫。η及核酸內切酶位點的核苷酸序列，以其中一模擬表位肽為例其它步驟同實施例 1。同時以未切除多餘胺基酸的序列導入作為對照組。結果(按此實施例，在抗體結合性能測定中，切除多餘胺基酸前的對照組，模擬表位蛋白包最低被濃度為30 μ g/mL，最大抗體稀釋倍數為1 :2000。切除多餘胺基酸後表位蛋白包最低被濃度為3. 0μ g/mL，最大抗體稀釋倍數為1 :20000。包被濃度越低，抗體稀釋倍數越大則抗體結合性能越好。)
實施例7玉米赤黴烯酮的高密度分子模擬表位肽的製備方法 (1)模擬表位表達載體的構建及鑑定
根據玉米赤黴烯酮的模擬表位序列，用化學方法合成二條5'端分別有核酸內切酶位點EcoRI和BamHI的互補核苷酸序列，其含有能表達成腸激酶酶切位點DDDDK的核苷酸序列、以及玉米赤黴烯酮模擬表位。現以一玉米赤黴烯酮模擬表位肽為例，
合成 T1 :5 『 - MTTCgACgACgACgACAAgGATGCTGTCATCCTGTTGATG -3 『 ( EcoRI )和 T2 5 『 - rATCCATCAACAGGATGACAGCATCCTTGTCGTCGTCGTCr -3 『 (BamHI)，加 dd H2O 分別配成20pmol/yL的寡聚核苷酸單鏈溶液，各取10 μ L混合後，置於PCR儀，65°C保溫 10 min，然後緩慢降溫至室溫。其它步驟同實施例1。同時以未切除多餘胺基酸的序列導入作為對照組。結果(按此實施例，在抗體結合性能測定中，切除多餘胺基酸前的對照組，模擬表位蛋白包最低被濃度為30 μ g/mL，最大抗體稀釋倍數為1 :2000。切除多餘胺基酸後表位蛋白包最低被濃度為1.0yg/mL，最大抗體稀釋倍數為1 :60000。包被濃度越低，抗體稀釋倍數越大則抗體結合性能越好。)
實施例8桔黴素高密度分子模擬表位肽的製備方法
根據桔黴素的模擬表位序列，用化學方法合成二條5'端分別有核酸內切酶位點 EcoRl私BernHI的互補核苷酸序列，其含有能表達成腸激酶酶切位點DDDDK的核苷酸序列、 以及桔黴素模擬表位。現以一桔黴素模擬表位肽為例，
合成 T1:5 『 -MTTCgACgACgACgACAAgACGCATAAGGCGGGGCCTCCG -3 『(萬coTP/)禾口 T2 5 『 -GATCCGGAGGCCCCGCCTTATGCGTCTTGTCGTCGTCGTCg -3 『 {BamHI)，加 dd H2O 分別配成20pmol/yL的寡聚核苷酸單鏈溶液，各取10 μ L混合後，置於PCR儀，65°C 保溫10 min，然後緩慢降溫至室溫。其它步驟同實施例1。同時以未切除多餘胺基酸的序列導入作為對照組。結果(按此實施例，在抗體結合性能測定中，切除多餘胺基酸前的對照組，模擬表位蛋白包最低被濃度為20 μ g/mL，最大抗體稀釋倍數為1 :2000。切除多餘胺基酸後表位蛋白包最低被濃度為1.0yg/mL，最大抗體稀釋倍數為1 :40000。包被濃度越低，抗體稀釋倍數越大則抗體結合性能越好。)
實施例9桔黴素高密度分子模擬表位肽的製備方法
作為實施例8的變化，在人工合成序列合成中，在能表達成腸激酶酶切位點DDDDK的核苷酸序列前端接上能表達成任意短肽(0-100個胺基酸長度)的核苷酸序列，本發明以兩條序列分別接上CAGCAT和ATGCTG為例說明
合成 T1 :5 , -MTTCCAGCATgACgACgACgACMgACGCATMGGCGGGGCCTCCG -3 『 ( EcoRI ) 禾口 T2 5 『 -GATCCGGAGGCCCCGCCTTATGCGTCTTGTCGTCGTCGTCATGCTGr -3 『 (BamHI)， 加dd H2O分別配成20pmol/yL的寡聚核苷酸單鏈溶液，各取10 μ L混合後，置於PCR儀， 650C保溫10 min，然後緩慢降溫至室溫。其它步驟同實施例1。實施例10愛滋病病毒抗原表位肽的製備方法 (1)抗原表位表達載體的構建及鑑定
根據愛滋病病毒HIV-I gp41蛋白抗原表位序列，用化學方法合成二條5'端分別有核酸內切酶位點EcoRI和BamHI的互補核苷酸序列，其含有能表達成腸激酶酶切位點DDDDK 的核苷酸序列、以及愛滋病病毒HIV-I gp41蛋白表位。現以一愛滋病病毒HIV-I gp41蛋白表位肽為例,合成 T1 :5 『 - AATTCGGGCCTrACRACRACRACAARCCACTGCACGCTCGGCTGCC G -3 『 ( EcoRI )
和 T2 5 『 - GATCCGGCAGCCGAGCGTGCAGTGGCTTGTCGTCGTCGTCAGGCCCr -3 『 {BamHI)， 加dd H2O分別配成20pmol/yL的寡聚核苷酸單鏈溶液，各取10 μ L混合後，置於PCR儀， 650C保溫10 min，然後緩慢降溫至室溫。其它步驟同實施例1。同時以未切除多餘胺基酸的序列導入作為對照組。結果(按此實施例，在抗體結合性能測定中，切除多餘胺基酸前的對照組，模擬表位蛋白包最低被濃度為60μ g/mL，最大抗體稀釋倍數為1 :2000。切除多餘胺基酸後表位蛋白包最低被濃度為1. 0μ g/mL，最大抗體稀釋倍數為1 :120000。包被濃度越低，抗體稀釋倍數越大則抗體結合性能越好)。
實施例11甲型Hmi流感病毒抗原表位肽的製備方法 (1)抗原表位表達載體的構建及鑑定
根據甲型Hmi流感病毒抗原表位序列，用化學方法合成二條5'端分別有核酸內切酶紅飫EcoRI琳BamHI的互補核苷酸序列，其含有能表達成腸激酶酶切位點DDDDK的核苷酸序列、以及甲型Hmi流感病毒抗原表位。現以一甲型Hmi流感病毒抗原表位肽為例，
合成 T1 :5 『 - MTTCgACgACgACgACAAgCATCCTAgTgATCCgCgTCATGGG -3 『 ( EcoRI ) 和 T2 5 『 - gATCCCCATgACgCggATCACTAggATgCTTgTCgTCgTCgTCg -3 『 (BamHI)，加 dd H2O分別配成20pmol/yL的寡聚核苷酸單鏈溶液，各取10 μ L混合後，置於PCR儀，65°C 保溫10 min，然後緩慢降溫至室溫。其它步驟同實施例1。同時以未切除多餘胺基酸的序列導入作為對照組。結果(按此實施例，在抗體結合性能測定中，切除多餘胺基酸前的對照組，模擬表位蛋白包最低被濃度為20 μ g/mL，最大抗體稀釋倍數為1 :2000。切除多餘胺基酸後表位蛋白包最低被濃度為1.0yg/mL，最大抗體稀釋倍數為1 :40000。包被濃度越低，抗體稀釋倍數越大則抗體結合性能越好)。實施例12流感病毒H3N2高密度抗原表位的製備方法 (1)抗原表位表達載體的構建及鑑定
根據流感病毒H3N2抗原表位序列，用化學方法合成二條5'端分別有核酸內切酶位點 EcoRI和BamHI的互補核苷酸序列，其含有能表達成腸激酶酶切位點DDDDK的核苷酸序列、 以及流感病毒H3N2抗原表位核苷酸序列。現以一流感病毒H3N2抗擬表位肽為例 合成 T1 :5 『 - MTTCgACgACgACgACAAgGGGACTCCTCCTTATCCTCCG -3 『 ( EcoRI ) 和 T2 5 『 -GATCCGGAGGATAAGGAGGAGTCCCCTTGTCGTCGTCGTCr (BamHI)，加 dd H2O 分別配成20pmol/yL的寡聚核苷酸單鏈溶液，各取10 μ L混合後，置於PCR儀，65°C保溫10 min，然後緩慢降溫至室溫。其它步驟同實施例1。同時以未切除多餘胺基酸的序列導入作為對照組。結果(按此實施例，在抗體結合性能測定中，切除多餘胺基酸前的對照組，模擬表位蛋白包最低被濃度為20 μ g/mL，最大抗體稀釋倍數為1 :2000。切除多餘胺基酸後表位蛋白包最低被濃度為1.0 μ g/mL，最大抗體稀釋倍數為1 :40000。包被濃度越低，抗體稀釋倍數越大則抗體結合性能越好)。
實施例13
豬圓環病毒II型噬菌體表達載體亞單位疫苗的製備方法 (1)豬圓環病毒II型P VDI噬菌體表達載體的構建
豬圓環病毒衣殼蛋白基因位於0RF2上，其編碼的衣殼蛋白是PCV2的主要衣殼蛋白和免疫原性蛋白。其中第117 131位胺基酸殘基構成的多肽對PCV2抗血清有特異性，它們對應的核苷酸序列是構建PCV2基因重組疫苗的首選序列。用化學方法合成二條5'端分別有核酸內切酶位點^和及 /7/的互補核苷酸序列，包含豬圓環病毒衣殼蛋白0RF2 第117 131位胺基酸對應的核苷酸序列和能表達成腸激酶酶切位點DDDDK的核苷酸序列。Tl 5 『 MTTCGACGACGACGACAAGGgagtgggctccagtgctgttattctagatgataactttgtaacg 3『( EcoRI ) 禾口 T2
5 『 gatcCGTTACAAAGTTATCATCTAGAATAACAGCACTGGAGCCCACTCCCTTGTCGTCGTCGTCG -3 『 (BamHI)，加dd H2O分別配成20pmol/ μ L的寡聚核苷酸單鏈溶液，各取10 μ L混合後，置於PCR儀，65°C保溫10 min，然後緩慢降溫至室溫。(2)序列導入、鑑定
取 pC89 質粒 DNA 32 μ L (30 μ g)，力口 10 X 酶切 buffer 4μ L, EcoRI (10 U/μ L) 2 μ L,BamHI (10 U/μ L) 2μ L,37°C 酶切 2 h，65°C 20 min 滅活，2. 5 % 瓊脂糖電泳觀察結果。在紫外燈下迅速切下目的條帶，用UNIQltl膠回收試劑盒回收。將回收後的pC89 DNA 片段與雙鏈寡聚核苷酸連接。連接反應體系雙鏈寡聚核苷酸4yL，pC89載體DNA 4yL, T4 DNA Iigase (10 U/μ L) 1 μ L, 10ΧΤ4 DNA ligation buffer lyL，總體積 10 μ L， 16°C連接過夜。連接液全量轉化大腸桿菌感受態細胞，熱激後塗布已加入40 μ L X-gal (4 mg/ mL)及4yL ITPG (40 mg/mL)的含Amp的LB平板，37°C培養過夜，挑單菌落擴增細胞進行陽性克隆鑑定。(3)融合蛋白的表達與純化
經鑑定後的陽性克隆挑單菌落接種於2mL Amp + Tet雙抗SOC培養液中，37°C振蕩培養濁，轉移至400mL Amp + Tet雙抗SOC培養液中，37°C振蕩培養至A600約0.4時，加入 IXlO12 PFU的VCSM13，37°C振蕩培養1 h，再加入終濃度為70mg/ L的卡那黴素以及終濃度為lmmol/ L的ITPG，37°C振蕩培養過夜。將培養液4°C IOOOOrpm離心lOmin，上清液加入PEG/ NaCl，4°C沉澱過夜；4°C IOOOOrpm離心15min，去上清，再用1 mL TBST懸浮噬菌體，加入PEG /NaCl冰上孵育60 min ；4°C離心15min，去上清，沉澱用200 μ L TBST懸浮並測滴度，4° C保存。(4)腸激酶酶切取純化好的模擬表位蛋白50 μ L，加入1 μ L腸激酶，22°C過夜，純化，4° C或-20° C保存。(5)特異性抗體的鑑定
將經酶切後的純化重組噬菌體按常規程序免疫動物，採血後分離抗血清。首先通過化學方法合成目的多肽，再通過以下ELISA方法檢測抗體效價
A、用磷酸緩衝溶液(PBS，pH7. 2)將化學方法合成目的多肽配製成5 — 200 μ g/mL的濃度，每孔100 μ L加入酶標板中，4°C過夜。B、傾去包被液，PBST (PBS加0. 2%的吐溫20)洗滌三次，每次在厚疊吸水紙上扣幹， 每孔加入300 μ L 3%的脫脂牛奶(溶於PBST)作為封阻液，37°C保溫保溼1小時；傾去封阻液，PBST洗滌三次，每次在厚疊吸水紙上扣幹。C、將免疫後的抗血清用PBS倍比稀釋成1 :1000,1 :2000,1 :4000,1 =IOOOOU 20000、1 :40000,1 :80000,1 160000、1 :320000 和 1 :640000 的濃度，依次加入各條處理好
的酶標板板孔中，最後一孔加入PBS作空白對照，37°C保溫保溼1小時。未經免疫的血清同樣處理做陰性對照。D、PBST洗板三次，每次在厚疊吸水紙上扣幹。每孔加100 μ L辣根過氧化物酶標記的抗抗體(酶標二抗)，37°C，保溫保溼1小時。
E、PBST洗板三次，每次在厚疊吸水紙上扣幹。每孔加OPD或TMB底物液100 μ L， 37°C保溫保溼避光反應10分鐘後，每孔加入50 μ L 2Μ H2SO4終止反應，以空白對照孔調零，在酶標儀上測定酶標板492nm (OPD)或450nm (TMB)的吸光值，選取抗血清與陰性血清吸光值比大於2. 1時最大的抗體稀釋度為特異性抗體的效價。結果按此實施例，特異性抗體的測定效價為1 :40000。實施例14
切除多餘胺基酸在亞單位疫苗中帶來的效果比較試驗
為了對比採用此發明帶來的實質性改變，豬圓環病毒II型噬菌體表達載體亞單位疫苗的製備方法
(1)豬圓環病毒II型P VDI噬菌體表達載體的構建
用化學方法合成二條5'端分別有核酸內切酶位點和ife ///的互補核苷酸序列， 包含豬圓環病毒衣殼蛋白0RF2第117 131位胺基酸對應的核苷酸序列，不包含能表達成腸激酶酶切位點DDDDK的核苷酸序列。Tl
5' MTTCGgagtgggctccagtgctgttattctagatgataactttgtaacg 3' ( EcoRI ) 禾口 T2 :5 『 gatcCGTTACAAAGTTATCATCTAGAATAACAGCACTGGAGCCCACTCCG -3 『 (BamHI)，加dd H2O分別配成20pmol/ μ L的寡聚核苷酸單鏈溶液，各取10 μ L混合後，置於PCR儀，65°C保溫10 min，然後緩慢降溫至室溫。(2)序列導入、鑑定
取 pC89 質粒 DNA 32 μ L (30 μ g)，力口 10 X 酶切 buffer 4μ L, EcoRI (10 U/μ L) 2 μ L,BamHI (10 U/μ L) 2μ L,37°C 酶切 2 h，65°C 20 min 滅活，2. 5 % 瓊脂糖電泳觀察結果。在紫外燈下迅速切下目的條帶，用UNIQltl膠回收試劑盒回收。將回收後的pC89 DNA 片段與雙鏈寡聚核苷酸連接。連接反應體系雙鏈寡聚核苷酸4yL，pC89載體DNA 4yL, T4 DNA Iigase (10 U/μ L) 1 μ L, 10ΧΤ4 DNA ligation buffer lyL，總體積 10 μ L， 16°C連接過夜。連接液全量轉化大腸桿菌感受態細胞，熱激後塗布已加入40 μ L X-gal (4 mg/ mL)及4yL ITPG (40 mg/mL)的含Amp的LB平板，37°C培養過夜，挑單菌落擴增細胞進行陽性克隆鑑定。(3)融合蛋白的表達與純化
經鑑定後的陽性克隆挑單菌落接種於2mL Amp + Tet雙抗SOC培養液中，37°C振蕩培養濁，轉移至400mL Amp + Tet雙抗SOC培養液中，37°C振蕩培養至A600約0.4時，加入 IXlO12 PFU的VCSM13，37°C振蕩培養1 h，再加入終濃度為70mg/ L的卡那黴素以及終濃度為lmmol/ L的ITPG，37°C振蕩培養過夜。將培養液4°C IOOOOrpm離心lOmin，上清液加入PEG/ NaCl，4°C沉澱過夜；4°C IOOOOrpm離心15min，去上清，再用1 mL TBST懸浮噬菌體，加入PEG /NaCl冰上孵育60 min ；4°C離心15min，去上清，沉澱用200 μ L TBST懸浮並測滴度，4° C保存或-20° C保存。(4)特異性抗體的鑑定
將未經酶切後的純化重組噬菌體按常規程序免疫動物，採血後分離抗血清。首先通過化學方法合成目的多肽，再通過ELISA方法檢測抗體效價
Α、用磷酸緩衝溶液(PBS，ρΗ7. 2)將化學方法合成目的多肽配製成5 — 200 μ g/mL的濃度，每孔100 μ L加入酶標板中，4°C過夜。B、傾去包被液，PBST (PBS加0. 2%的吐溫20)洗滌三次，每次在厚疊吸水紙上扣幹， 每孔加入300 μ L 3%的脫脂牛奶(溶於PBST)作為封阻液，37°C保溫保溼1小時；傾去封阻液，PBST洗滌三次，每次在厚疊吸水紙上扣幹。C、將免疫後的抗血清用PBS倍比稀釋成1 :1000,1 :2000,1 :4000,1 =IOOOOU 20000、1 :40000,1 :80000,1 160000、1 :320000 和 1 :640000 的濃度，依次加入各條處理好
的酶標板板孔中，最後一孔加入PBS作空白對照，37°C保溫保溼1小時。未經免疫的血清同樣處理做陰性對照。D、PBST洗板三次，每次在厚疊吸水紙上扣幹。每孔加100 μ L辣根過氧化物酶標記的抗抗體(酶標二抗)，37°C，保溫保溼1小時。E、PBST洗板三次，每次在厚疊吸水紙上扣幹。每孔加OPD或TMB底物液100 μ L， 37°C保溫保溼避光反應10分鐘後，每孔加入50 μ L 2Μ H2SO4終止反應，以空白對照孔調零，在酶標儀上測定酶標板492nm (OPD)或450nm (TMB)的吸光值，選取抗血清與陰性血清吸光值比大於2. 1時最大的抗體稀釋度為特異性抗體的效價。結果按此實施例，特異性抗體的測定效價為1 :2000。對比實施例13，切除多餘胺基酸後，免疫產生的特異性抗體效價提高了 20倍。可見，本發明可有效提高目的多肽的免疫特異性。實施例15
甲型Hmi流感病毒噬菌體表達亞單位疫苗的製備方法 (ι)噬菌體表達載體的構建化學合成序列
Tl 5' - AATTCGGGCCTrACrACrACrACAArCCACTGCACGCTCGGCTGCCG- 3' ( EcoRI ) 禾口 T2:5' - GATCCGGCAGCCGAGCGTGCAGTGGCTTGTCGTCGTCGTCAGGCCCr -3' 、BamHi)，t\ dd H2O分別配成20pmol/yL的寡聚核苷酸單鏈溶液，各取10 μ L混合後，置於PCR儀， 650C保溫10 min，然後緩慢降溫至室溫，-20°C保存。其它步驟同實施例13
實施例16流感病毒H3N2噬菌體表達亞單位疫苗的製備方法 (1)噬菌體表達載體的構建用化學方法合成序列
Tl 5' - AATTCrACrACrACrACAArGGGACTCCTCCTTATCCTCCG- 3' ( EcoRI ) 禾口 T2
5 『 - GATCCGGAGGATAAGGAGGAGTCCCCTTGTCGTCGTCGTCr- 3 『 {BamHI)，加 dd H2O 分別配成20pmol/yL的寡聚核苷酸單鏈溶液，各取10 μ L混合後，置於PCR儀，65°C保溫10 min，然後緩慢降溫至室溫，_20°C保存。其它步驟同實施例13
實施例17赭麴黴毒素A的高密度分子模擬表位肽的在赭麴黴毒素A酶聯免疫吸附檢測方法中的應用
(1)取實施例1 一 4中酶切純化後的的高密度模擬表位蛋白，紫外分光光度計測定其在280nm的吸光值(A^Onm)，根據Warburg-christian公式蛋白質濃度(mg/mL)=1. 55A280nm-0. 76A^0nm，確定其蛋白濃度。(2)採用方陣滴定確定高密度模擬表位蛋白和抗赭麴黴毒素A抗體的最佳使用濃度。具體如下
A、用磷酸緩衝溶液(PBS，pH7. 2)將高密度模擬表位蛋白配製成40、20、10、5、2. 5、1. 25 和0. 625 μ g/mL的濃度，按每條酶標板一個濃度(每條8個孔)，每孔100 μ L加入酶標板中， 4°C過夜。B、傾去包被液，PBST (PBS加0. 2%的吐溫20)洗滌三次，每次在厚疊吸水紙上扣幹， 每孔加入300 μ L 3%的脫脂牛奶(溶於PBST)作為封阻液，37°C保溫保溼1小時；傾去封阻液，PBST洗滌三次，每次在厚疊吸水紙上扣幹。C、將抗赭麴黴毒素A抗體用PBS倍比稀釋成1 :1000,1 :2000,1 =4000,1 =8000,1 16000,1 32000和1 :64000的濃度，依次加入各條處理好的酶標板板孔中，最後一孔加入 PBS作空白對照，37 °C保溫保溼1小時。D、PBST洗板三次，每次在厚疊吸水紙上扣幹。每孔加100 μ L辣根過氧化物酶標記的抗抗體(酶標二抗)，37°C，保溫保溼1小時。E、PBST洗板三次，每次在厚疊吸水紙上扣幹。每孔加OPD或TMB底物液100 μ L， 37°C保溫保溼避光反應10分鐘後，每孔加入50 μ L 2Μ H2SO4終止反應，以空白對照孔調零，在酶標儀上測定酶標板492nm (OPD)或450nm (TMB)的吸光值，根據所有孔吸光值進行比較選擇吸光值在1. 5左右最低的高密度模擬表位蛋白包被濃度和最大的抗體稀釋度即為高密度模擬表位蛋白和抗赭麴黴毒素A抗體的最佳使用濃度。(3)通過化學合成模擬表位多肽，製作標準曲線確定合成模擬表位多肽與赭麴黴毒素A標準品的劑量關係，以之替代赭麴黴毒素A標準品。具體實施如下
A、根據方陣滴定確定的赭麴黴毒素A高密度模擬表位蛋白的濃度。高密度模擬表位蛋白溶於0. IM ρΗ8· 6的NaHCO3,100 μ L/孔，4° C包被過夜。B、PBST洗板四次，3%脫脂牛奶300 μ L /孔4° C封閉2h。C、PBST洗板四次，各孔分別加入不同濃度的赭麴黴毒素A標準品(40000，20000， 10000，5000，2500，1250，625，312. 5，156，100，50 和 0 pg/mL)、合成模擬表位多 Jft 50 μ L (40000，20000，10000，5000，2500，1250，625，312. 5，156，100，50 和 0 pg/mL)，再全部加入方陣滴定確定的抗赭麴黴毒素A抗體50 μ L，振蕩混勻，37 °C保溫保溼lh。D、PBST洗滌6次，加入辣根過氧化物酶標記的抗抗體(100 μ L/孔)，37° C作用lh。Ε、洗滌6次。聯苯二胺(OPD)顯色，2Μ H2SO4終止反應，測定492nm波長光密度(0D 值)，計算各濃度的結合率，結合率(％) = B/BOX 100%(B0為不加赭麴黴毒素A或不加合成多肽的OD值，B為加赭麴黴毒素A或加入合成多肽的OD值)。F、根據赭麴黴毒素A的濃度和結合率繪製赭麴黴毒素A競爭抑制曲線，根據合成模擬表位多肽的濃度和結合率繪製多肽競爭抑制曲線，通過參照標準曲線中相同結合率可得出標準品赭麴黴毒素A與合成模擬表位多肽的劑量關係。(4)高密度模擬表位蛋白作為競爭抗原替代赭麴黴毒素A人工抗原，合成模擬表位多肽替代赭麴黴毒素A標準品用於ELISA檢測樣品中赭麴黴毒素A的含量，具體步驟如下
A、根據方陣滴定確定的最佳高密度模擬表位蛋白濃度，用磷酸緩衝溶液(PBS，pH7. 2)稀釋，在酶標板中每孔加IOOyL高密度模擬表位蛋白，4°C過夜。B、傾去包被液，PBST (PBS加0.洲的吐溫20)洗滌三次，每次在厚疊吸水紙上扣幹， 每孔加入300 μ L 3%的脫脂牛奶(溶於PBST)作為封阻液，37°C保溫保溼1小時；傾去封阻液，PBST洗滌三次，每次在厚疊吸水紙上扣幹。C、在酶標板各孔中加入濃度為 40000，20000，10000，5000，2500，1250，625，312. 5， 156，100，50和0 pg/mL的合成模擬表位多肽(溶於35%甲醇PBS)或待測樣品(樣品粉碎後用 5倍體積的70%甲醇PBS提取樣品，渦旋振蕩lOmin，5000rpm離心IOmin後定性濾紙過濾， 加入同等體積的PBS稀釋)50 μ L，再全部加入以PBS稀釋的抗赭麴黴毒素A抗體50 μ L， 同時設置空白對照(以PBST代替抗體)，37°C，保溫保溼1小時；
D、PBST洗板三次，每次在厚疊吸水紙上扣幹。每孔加100μ L辣根過氧化物酶標記的抗抗體(酶標二抗)，37 °C，保溫保溼1小時
E、PBST洗板三次，每次在厚疊吸水紙上扣幹。每孔加OPD或TMB底物液100μ L，37°C 保溫保溼避光反應10分鐘後，每孔加入50 μ L 2Μ H2SO4終止反應，以空白對照孔調零，在酶標儀上測定酶標板492nm (OPD)或450nm (TMB)的吸光值，計算各濃度的結合率，結合率(％) = B/B0X100%(B0為合成模擬表位多肽濃度為O時的吸光值，B為合成模擬表位多肽各濃度的吸光值)，同樣計算各待測樣品孔的結合率(B為待測樣品孔的吸光值)，以各合成模擬表位多肽濃度的常用對數值(IgC)為橫坐標，各濃度合成模擬表位多肽相應的結合率 (B/B0%)為縱坐標製作競爭抑制曲線。F、以各待測樣品孔的結合率對應的縱坐標，查標準曲線對應的橫坐標，再通過步驟(3)確定的合成模擬表位多肽與赭麴黴毒素A標準品的劑量關係的標準曲線，即可得出樣品中赭麴黴毒素A的含量，或可用酶聯免疫吸附檢測方法專用分析軟體對數據進行分析得出結果。結果
根據赭麴黴毒素A的濃度和結合率繪製赭麴黴毒素A競爭抑制曲線，根據合成模擬表位多肽的濃度和結合率繪製多肽競爭抑制曲線(圖5)，通過參照標準曲線中相同結合率可得出標準品赭麴黴毒素A與合成模擬表位多肽的劑量關係(圖6)。利用多肽做標準品得出的標準品競爭抑制曲線見圖7。通過圖6和圖7，根據不同樣品在ELISA實驗中測得的結合率，就可測定樣品中赭麴黴毒素A的含量。實施例18
將實施例17中的合成模擬表位多肽替換成高密度模擬表位肽，其餘同實施例17。實施例19
將實施例17中的赭麴黴毒素A、赭麴黴毒素A標準品、抗赭麴黴毒素A抗體、赭麴黴毒素A高密度模擬表位蛋白分別替換為黃麴黴毒素B1、黃麴黴毒素B1標準品、黃麴黴毒素B1 抗體、黃麴黴毒素B1高密度模擬表位蛋白，其餘同實施例17。實施例20
將實施例19中的合成模擬表位多肽替換成高密度模擬表位肽，其餘同實施例19。實施例21
將實施例17中的赭麴黴毒素A、赭麴黴毒素A標準品、抗赭麴黴毒素A抗體、赭麴黴毒素A高密度模擬表位蛋白分別替換為玉米赤黴烯酮、玉米赤黴烯酮標準品、玉米赤黴烯酮抗體、玉米赤黴烯酮高密度模擬表位蛋白，其餘同實施例17。實施例22
將實施例21中的合成模擬表位多肽替換成高密度模擬表位肽，其餘同實施例21. 實施例23
將實施例17中的赭麴黴毒素A、赭麴黴毒素A標準品、抗赭麴黴毒素A抗體、赭麴黴毒素A高密度模擬表位蛋白分別替換為桔黴素、桔黴素標準品、桔黴素抗體、桔黴素高密度模擬表位蛋白，其餘同實施例17。實施例M
將實施例23中的合成模擬表位多肽替換成高密度模擬表位肽，其餘同實施例23. 實施例25
將實施例17中的赭麴黴毒素A、赭麴黴毒素A標準品、抗赭麴黴毒素A抗體、赭麴黴毒素A高密度模擬表位蛋白分別替換為愛滋病抗原、愛滋病抗原標準品、愛滋病抗體、愛滋病抗原高密度模擬表位蛋白，其餘同實施例17。實施例沈
將實施例25中的合成模擬表位多肽替換成高密度模擬表位肽，其餘同實施例25. 實施例27
將實施例17中的赭麴黴毒素A、赭麴黴毒素A標準品、抗赭麴黴毒素A抗體、赭麴黴毒素A高密度模擬表位蛋白分別替換為甲型Hmi流感病毒抗原、甲型Hmi流感病毒抗原標準品、甲型Hmi流感病毒抗體、甲型Hmi流感病毒抗原高密度模擬表位蛋白，其餘同實施例17。實施例觀
將實施例27中的合成模擬表位多肽替換成高密度模擬表位肽，其餘同實施例27. 實施例四
將實施例17中的赭麴黴毒素A、赭麴黴毒素A標準品、抗赭麴黴毒素A抗體、赭麴黴毒素A高密度模擬表位蛋白分別替換為流感病毒H3N2抗原、流感病毒H3N2抗原標準品、流感病毒H3N2抗體、流感病毒H3N2高密度抗原表位蛋白，其餘同實施例17。實施例30
將實施例四中的合成模擬表位多肽替換成高密度抗原表位肽，其餘同實施例四. 實施例31
將實施例17中的赭麴黴毒素A、赭麴黴毒素A標準品、抗赭麴黴毒素A抗體、赭麴黴毒素A高密度模擬表位蛋白分別替換為C肝抗原、C肝抗原標準品、C肝抗體、C肝抗原高密度抗原表位蛋白，其餘同實施例17。實施例32
將實施例31中的合成模擬表位多肽替換成高密度抗原表位肽，其餘同實施例31。
權利要求
1.一種在絲狀噬菌體上高密度表達目的多肽的方法，其特徵在於包含下列步驟(1)人工序列的設計與合成用化學方法合成二條5'端分別有feoTP/和ife ///核酸內切酶位點的互補核苷酸序列，其含有能表達成腸激酶酶切位點天冬氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸-賴氨酸(DDDDK)的核苷酸序列以及目的多肽的核苷酸序列；(2)序列導入噬菌體載體pC89將二條互補序列退火後形成的DNA片段與經^和 BamHI酶切的噬菌體載體pC89在DNA連接酶作用下連接，連接產物轉化感受態的大腸桿菌 (fedaricAacWi)細胞，選擇性培養基培養，挑單菌落進行陽性克隆鑑定；(3)重組噬菌體的表達與純化陽性克隆加入誘導物和輔助噬菌體進行擴增培養，收穫並純化表達有腸激酶酶切位點DDDDK和目的多肽的重組噬菌體；(4)將獲得的重組噬菌體經腸激酶酶切，得到高密度表達在絲狀噬菌體主要衣殼蛋白氨基端的目的多肽。
2.權利要求1所述方法得到的高密度目的多肽作為競爭抗原在免疫學檢測方法中的應用。
3.權利要求2所述的應用，其特徵在於以所得的高密度目的多肽作為競爭抗原替代人工化學合成抗原用於免疫學檢測。
4.權利要求2或3所述的應用，其特徵為將所得的赭麴黴毒素A高密度模擬表位肽、 黃麴黴毒素B1高密度模擬表位肽、玉米赤黴烯酮高密度模擬表位肽、桔黴素高密度模擬表位肽用於免疫學檢測。
5.權利要求1所述方法得到的高密度目的多肽作為難以獲得或傳染性強的病毒抗原的替代品，應用於檢測這些病毒的相應抗體。
6.權利要求5所述的應用，其特徵為將所得愛滋病病毒高密度抗原表位肽、甲型Hmi 流感病毒高密度抗原表位肽、流感病毒H3N2高密度抗原表位肽或C肝病毒高密度抗原表位肽作為檢測抗原，用於免疫學檢測。
7.權利要求1所述方法得到的高密度抗原表位肽在製作亞單位疫苗的應用。
8.權利要求7所述應用，其特徵在於豬圓環病毒II型的高密度抗原表位肽、甲型Hmi 流感病毒高密度抗原表位肽、流感病毒H3N2高密度抗原表位肽、C肝病毒高密度抗原表位肽在製作其亞單位疫苗中的應用。
全文摘要
本發明屬於生物技術領域，通過構建能表達成含腸激酶酶切位點天冬氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸-賴氨酸(DDDDK)序列與目的多肽核酸序列的重組噬菌體，使目的多肽N端連接腸激酶酶切位點，表達產物經腸激酶作用，將氨基端的腸激酶酶切位點DDDDK切除，使目的多肽直接位於絲狀噬菌體主要衣殼蛋白氨基端。有效地保留了pC89原有的表達密度高等優點，又解決了pC89表達的多肽氨基端必定攜帶五個胺基酸殘基的缺陷，保證了多肽直接暴露於主要衣殼蛋白氨基端，進一步增強了多肽的特異性，使得表達出來的模擬表位肽與抗體的結合效率提高了10倍以上。
文檔編號G01N33/53GK102181461SQ20111000291
公開日2011年9月14日 申請日期2011年1月7日 優先權日2011年1月7日
發明者劉仁榮, 徐玲 申請人:江西科技師範學院