Psa結合適體和前列腺癌的診斷方法

2023-11-02 18:51:07

專利名稱：Psa結合適體和前列腺癌的診斷方法
技術領域：
本發明涉及可結合前列腺特異性抗原(PSA)的適體，和利用所述適體診斷前列腺癌的方法。
背景技術：
前列腺特異性抗原(PSA)是主要由前列腺上皮細胞產生的33kDa至34kDa的糖蛋白，已知其為用於診斷前列腺癌的最常見血清標誌物。前列腺癌通常導致高濃度的PSA釋放到循環系統中，並導致血清PSA水平升高多達IO5倍。因此，對血清PSA的測量廣泛用於前列腺癌患者的早期檢測和監測。高於限定值(cut-off value) (4. Ong/mL)的血清PSA測量結果通常被認為是陽性，可能提示需要進行活檢。 適體是能夠以可與單克隆抗體相當的高親和力和特異性識別諸如蛋白和小分子等各種靶標分子的核酸配體。適體，特別是DNA適體易於廉價合成並進行化學修飾。此外，可以將它們設計為在結合靶標時發生結構變化。這些特徵使得DNA適體成為生物傳感器中理想的分子識別元件。利用適體的優點，已經構建了基於適體的高靈敏性檢測體系。在適體對生物傳感器的應用中，靶標結合能力是最重要的特徵。在體外通常利用基於靶標結合能力的稱為SELEX(指數富集的配體系統性進化)的方法來從隨機序列庫中選擇適體。由於可利用聚合酶鏈式反應(PCR)進行迭代的選擇循環，SELEX是高效的篩選方法。在這些情況下，已知各種適體可作為檢測工具，例如用於朊病毒特異性蛋白(JPNo. 2006-42645 Al)、血管內皮生長因子(JP 2008-237042)和胰島素(JPNo. 2009-183192A1)的檢測工具。特別是，W02006/096754描述了能夠結合前列腺特異性膜抗原(PSMA)的穩定化的適體及其作為前列腺癌治療劑的應用，並且公開了通過最小化和優化獲得的適體所具有的Kd (解離常數)=2 10 (nM)。另一方面，已知SELEX有時不能篩選出對靶標分子具有高親和力的適體，並且其中通過SELEX篩選適體的序列空間的實際尺寸和複雜度小於預期。為了獲得具有更高親和力的適體，已知有各種通過SELEX進行篩選的變化方法，例如利用遺傳算法(GA)的 DNA 適體的選擇方法(例如，見 Nucleic Acids Res. , 2005,第 33 卷(12)，el08，JPNo. 2007-14292A)。為了利用GA基於靶標結合能力來選擇適體，對候選寡核苷酸首先通過SELEX進行預選。隨後利用GA對他們的寡核苷酸序列在計算機上進行擴增、交叉和突變。在進行GA運算後，在體外合成並測試新的序列組。隨後，選取具有高結合親和力的序列用於下一輪GA循環。通過重複GA運算的過程，可以覆蓋僅通過SELEX不能被完全篩選的序列空間。然而，由於適體的結合能力通常低於抗體，適體通常不作為實用的診斷工具，並且，例如，上述PSMA結合適體由於同樣的理由不足以用於診斷前列腺癌。

發明內容
本發明鑑於以上情況而完成，並提供了適體、前列腺癌的診斷方法和適體的製備方法。本發明的第一方面提供了結合前列腺特異性抗原(PSA)的適體，所述適體包含具有由I至10個核苷酸組成的隨機多核苷酸序列的前區；位於所述前區的3』端的由nnnnCT組成的第一區，其中各n獨立選自A、T、G和C ;由nnCTTT組成的第二區，其中各n獨立選自A、T、G和C，並且所述第二區的至少一部分與所述第一區互補；和位於所述第一區和所述第二區之間並且由具有3至30個核苷酸的隨機多核苷酸序列組成的第三區。本發明的第二方面提供了前列腺癌的診斷方法，所述方法包括使上述適體接觸受試者的體液樣品。在一些實施方式中，上述適體是以下(I)至(3)中的一種 (I)SEQ ID No. I 至 7 的多核苷酸；(2)除了分別在第三區和前區中的每個區中有I至5個核苷酸不同之外，序列分別與SEQ ID No. I至7相同的多核苷酸；或(3)除了分別在第一區和第二區中總共有I至5個核苷酸不同並且第三區和前區中的每個區中有I至5個核苷酸不同之外，序列與SEQ ID No. I至7相同的多核苷酸。


圖I是顯示本發明的適體的預測二級結構的圖。圖2顯示了通過適體印跡進行的在硝酸纖維素膜上對PSA的各輪SELEX的DNA文庫的結合測試結果。圖3A是顯示GA進化的親代中的寡核苷酸的PSA結合能力的圖。圖3B是顯示GA進化的第一代中的寡核苷酸的PSA結合能力的圖。圖3C是顯示GA進化的第二代中的寡核苷酸的PSA結合能力的圖。圖3D是顯示GA進化的第三代中的寡核苷酸的PSA結合能力的圖。圖3E是顯示GA進化的第四代中的寡核苷酸的PSA結合能力的圖。圖3F是顯示GA進化的第五代中的寡核苷酸的PSA結合能力的圖。圖4是顯示利用經過GA運算選擇的A PSap4#5通過平板測試得到的對PSA傳感的結果。
具體實施例方式本發明的適體是結合前列腺特異性抗原(PSA)的適體，具有由I至10個核苷酸組成的隨機多核苷酸序列的前區；位於所述前區的3』端的由nnnnCT組成的第一區，其中各n獨立選自A、T、G和C ;由nnCTTT組成的第二區，其中各n獨立選自A、T、G和C，並且所述第二區的至少一部分與所述第一區互補；和位於所述第一區和所述第二區之間並且由具有3至30個核苷酸的隨機多核苷酸序列組成的第三區。根據本發明，由於本發明的適體具有通過位於所述前區的3』端的由特殊序列組成的第一區和由特殊序列組成的第二區，且第一區和第二區由隨機多核苷酸序列組成的第三區而連接，因此所述適體具有特殊的二級結構，以及比其他與PSA結合的適體更高的對PSA的親和力，並且本發明的適體的結合能力幾乎等於抗體的結合能力。在本發明中，與方法相關的術語「步驟」不僅可表示獨立步驟，也可表示不能與其它步驟清楚區分的步驟，只要可以獲得該步驟的預計效果即可。另外，本發明中任何表示數值範圍的表現形式均表示由最小值和最大值限定的範圍，並且包括該最小值和最大值。除非另外指出，本發明的組合物中各成分的含量，在組合物中包含與本發明所定義的各成分對應的成分中的一種時，是指一種成分的量，並且在包含兩種以上成分時是指
其總量。下面將描述本發明。如上所述，本發明的適體由前區、第一區、第二區和第三區組成，並且具有由第一區和第二區形成的莖部分(雙鏈區域)和分別由前區和第三區形成的環部分(單鏈區域)，·從而使本發明的適體的二級結構為發卡結構。本說明書中術語「莖部分」是指兩條多核苷酸可根據其互補性而形成整體雙鏈區域。因此，該術語不僅可以包括該區域由完全互補的兩條多核苷酸序列構成的情況，還可以包括該區域由不完全互補(只要所述多核苷酸的至少一部分互補即可)的兩條多核苷酸序列構成並且可形成整體雙鏈區域的情況。可以選擇第二區的序列，從而使得能夠形成雙鏈區域(即，莖部分)並且第二區的至少一部分由與第一區互補的核苷酸構成。第三區由具有3至30個核苷酸的隨機多核苷酸序列構成，並且形成單鏈環。雖然其具體理由仍然不明，不過據認為本發明適體對PSA的高親和力是由於這種結構所至(見圖I)。第一區位於前區的3』端，並與第二區一起形成雙鏈區域。考慮到對PSA的結合親和力，第一區優選為(A或C)A(A或G)GCT，更優選第一區為AAAGCT、AAGGCT或CAGGCT。考慮到對PSA的結合親和力，第二區優選為(A或C) (A或G)CTTT，進而更優選第二區為A (A或G) CTTT，甚至更優選為AGCTTT或AACTTT。適體的前區具有由I至10個核苷酸構成的隨機多核苷酸序列，用於穩定適體的二級結構。考慮到對PSA的結合親和力，前區優選由Tm (A或T) (A或C)T(T或G)構成，並且m是I至10的整數，優選是I至5的整數。更優選前區可以具有TTTTTAATT或TTTTTAATG，或與其有I或2個鹼基不同的多核苷酸序列，例如TTTTTTATT或TTTTTACTG等。第三區具有3至30個隨機多核苷酸序列並且形成環結構。考慮到環的穩定性，所述隨機多核苷酸序列優選包括3至20個核苷酸，更優選5至15個核苷酸，進而更優選7至13個核苷酸。構成該隨機多核苷酸序列的核苷酸的種類沒有限制，本領域技術人員可以製備用於第三區的隨機多核苷酸序列。考慮到對PSA的結合親和力，第三區最優選可以為CGCCATCAAAT(SEQ ID No. 12)或與其有I至5個鹼基不同的多核苷酸序列，例如CGCCATCAGAT (SEQ ID No. 13)或 CGCCATCAAAG (SEQ IDNo. 14)等。特別是，本發明的結合PSA的適體優選為以下多核苷酸之一(I)SEQ ID No. I 至 7 的多核苷酸，(2)除了分別在第三區和前區中的每個區中有I至5個核苷酸不同之外序列與SEQID No. I至7相同的多核苷酸；或(3)除了分別在第一區和第二區中總共有I至5個核苷酸不同並且第三區和前區中的每個區中有I至5個核苷酸不同之外，序列與SEQ ID No. I至7相同的多核苷酸。以上(3)中所述多核苷酸與SEQ ID No. I至7有I至15個核苷酸不同，這是因為具有在該範圍內的差異的多核苷酸可以具有相似的對PSA的結合能力。優選的以上(3)或
(2)中所述的多核苷酸選自對於第一區、第二區、第三區和前區的上述優選多核苷酸的組
八
口 o由於本發明的適體可以利用自動化學合成儀來製備，因此其製備比特異性抗體容易和廉價得多。表I
名稱_^_SEQ.ID NO.
APSap4#5TTTTTAATTAMGCTCGCCATCMATAGCTTT1
APSap3』#04TTTTTMTTMGGCTCGCCATCMATAGCTTT2
APSap4#10TTTTTTATTMGGCTCGCCATCMATAGCTTT3
APSap4#7TTTTTMTTMGGCTCGCCATCAGATAGCTTT4APSap4#14TTTTTMTTMGGCTCGCCATCMAGAGCTTT5 APSap4#11TTTTTMTTMGGCTCGCCATCAMTMCTTT B
APSap4#1TTTTTMTTCAGGCTCGCCATCMATAGCTTT_7
厶 PSap2#02TTTTTMTTMGGATTTCCCGGTTGTATCTTT8
APSap2#18TTTTTMTGTCAACGTTGTTTACTGTCCCTTT9
APSap2#16TTTTTACTGTGMCTCGCCATCAMTATCTTT_10雖然可以通過已知的SELEX法獲得包括上述適體在內的與PSA結合的適體，但優選可以使用改變的SELEX法。製備與PSA結合的適體的優選方法可以是包括以下步驟的方法利用固定在固相上的PSA進行SELEX選擇處理，以獲得由單鏈多核苷酸構成的備選序列；進行不同備選序列之間的交叉和各備選序列的隨機點突變來修飾所述備選序列，從而獲得經修飾的備選序列；和基於PSA結合能力來分選經修飾的備選序列，從而獲得適體。適體製備方法中的SELEX選擇是本領域技術人員已知的，並可通過已知方法進行SELEX選擇。該方法中，靶標分子(PSA)固定在固相上，向其上添加包含具有很多種隨機鹼基序列的多核苷酸的多核苷酸文庫，並收集與靶標分子結合的多核苷酸，隨後對所述多核苷酸通過PCR擴增，之後再次將所擴增的多核苷酸添加到其上固定有靶標分子的載體中。通過重複該過程約10次，富集了對靶標分子具有高結合能力的適體，並確定其序列從而獲得識別靶標分子的適體。在SELEX選擇中，可以簡單通過物理吸附(如空氣乾燥)或通過利用PSA的羧基或氨基使PSA與固相共價鍵合(採用公知的氨基偶聯劑等)，從而進行PSA的固定。用於固定PSA的固相可以為(但不限於)可吸附PSA的硝酸纖維素膜、尼龍膜、濾紙或聚苯乙烯微量滴定板的孔等。由於適體的大小通常為約30聚體至100聚體，用於SELEX選擇的多核苷酸文庫中的多核苷酸具有約30聚體至100聚體的隨機鹼基序列，並通過自動核酸合成儀合成。在該情況下，雖然多核苷酸的全長可以為隨機鹼基序列，但多核苷酸兩端區域還可以是已知的鹼基序列，以便在進行SELEX時簡化PCR。在該情況下，PCR引物可以分別與這些已知序列的區域雜交。位於多核苷酸兩端區域的區域的大小沒有限制，但通常為約10聚體至25聚體。接下來，將以上述方式產生的多核苷酸文庫與固定的測試物質反應。文庫和PSA之間的反應優選可在室溫進行。反應時間通常可以為但不限於約I分鐘至30分鐘，優選約
10分鐘至20分鐘。在與PSA反應時，可結合PSA的適體與PSA結合併固定在固相上。另一方面，不與測試物質結合的多核苷酸不能結合在固相上，因此通過洗滌而被去除。在將未結合在固相上的多核苷酸通過洗滌去除之後，將結合在PSA上的適體洗脫。例如可通過以約6M至SM的高濃度尿素處理所述固相，從而進行洗脫。可通過常規方法例如酚抽提和/或酚-氯仿抽提和乙醇沉澱來收集洗脫的多核苷酸。所收集的所有適體是那些與固定的測試物質結合的適體。接下來，用所收集的適體作為模板進行PCR，從而擴增適體。在自動合成的多核苷 酸在兩端區域具有上述引物結合區域的情況下，利用那些引物進行PCR。在未提供所述引物結合區域的情況下，確定所收集的適體的多核苷酸序列，併合成與各末端區域互補的PCR弓I物對，所述引物用於進行PCR。通過進行非對稱PCR (PCR所用的弓I物對中的一個弓I物以過量使用)，可以擴增主要的單鏈多核苷酸。作為另一種選擇，利用生物素標記的引物作為PCR所用的引物對中的一個引物進行PCR ;使所擴增的雙鏈多核苷酸與抗生物素珠結合；利用NaOH等將該狀態的多核苷酸變性；並收集從所述珠分離的多核苷酸，從而可以從所擴增的雙鏈多核苷酸中收集單鏈多核苷酸(該鏈沒有被生物素標記)。通過這種方式，由於只有與固定的PSA結合的適體被擴增，並且與固定的PSA結合良好並作為PCR中的模板的適體的分子的數量很大，其在擴增的多核苷酸文庫中的百分比變得較高。接下來，利用所擴增的適體的文庫作為上述多核苷酸文庫，將上述一組步驟的循環重複約數次至十餘次，所述步驟即與固定的測試物質的反應；洗滌；洗脫和收集適體；和通過PCR擴增。由此，富集了與測試物質結合良好的適體，並可獲得與測試物質結合能力高的適體。在SELEX選擇後，利用遺傳算法(GA)進行備選序列的修飾，從而獲得經修飾的備選序列。在修飾過程中，使備選序列在計算機上進化。通過採用計算機上的進化，可以增加所需適體產生的效率。例如，Nucleic Acids Research, 2005，33 (12)，el08 和 Angew. Chem.Int.，Ed. 2005, 33，1061-1065等中描述了利用GA的修飾。在這些方法中，在完成第一輪的上述SELEX之後，確定了所獲得的適體的多核苷酸序列(備選序列或SELEX前序列)，測定了其與PSA的結合能力，並按照結合能力的次序對所測定的能力進行分選。迄今為止對適體的研究已表明，適體的基本結構可分為4種類型一即，發卡型、凸出型、假結型和鳥嘌呤四方型——並且何種結構由具有何種鹼基序列的適體獲得、何種核苷酸是保持基本結構所必需的核苷酸可容易地通過計算機分析確定。在利用計算機進化的方法中，應用了交叉、點突變或其組合。在交叉中，隨機選擇備選序列對，並且在各所得適體的各相應區域中的至少一個區域(例如，約三聚體至五聚體的區域)相互交換。之後，對於交換之後的上述各區域，引入隨機單鹼基替換。這些交換和單鹼基替換的引入在計算機上進行。具有由計算機生成的新多核苷酸序列的適體通過化學合成，從而獲得第二多核苷酸文庫，隨後將第二多核苷酸文庫用於上述循環。當製備了第二多核苷酸文庫時，具有就結合能力而言分級最高的適體所來源的區域的適體的含量最大，隨著分級變低其比例降低。因此，通過在計算機上由交叉和隨機單鹼基替換而人工引入各種改變，可以增加SELEX的進化效率。在修飾中交叉和隨機單突變優選可以組合，從而獲得第二多核苷酸文庫，該第二多核苷酸文庫包括與PSA的結合能力更高的經修飾的備選序列。在該情況中，經修飾的備選序列可以是通過下述方法而獲得的經多次修飾的備選序列進行交叉修飾或隨機點突變修飾，基於PSA結合能力從經修飾的序列中選擇首次經修飾的備選序列，通過進行在最初獲得經修飾的序列時沒有進行的交叉修飾或隨機點突變修飾中那一種來修飾首次經修飾的備選序列，和基於PSA結合能力從經多次修飾的備選序列(是已經通過進行在最初獲得經修飾的序列時沒有進行的交叉修飾或隨機點突變修飾中那一種而得到修飾的首次經修飾的備選序列)中進行選擇。為了高效地獲得以高結合能力與PSA結合的適體，製備適體的方法優選可利用一些多核苷酸序列(這些多核苷酸序列在實際用作SELEX前備選序列時，具有經證實的可導致產生具有高結合能力的適體的歷史)，並且可以是包括以下步驟的方法對於四種初始序列(該四種初始序列包括具有SEQ ID No. 8至11的多核苷酸序列)進行選自由序列之·間的交叉和各序列的隨機點突變組成的組的至少一種修飾；和從通過至少一種修飾而獲得的經修飾的序列中選擇靶標序列，所述靶標序列的PSA結合能力高於初始序列的PSA結合能力。SEQ ID. No. 8至11的多核苷酸序列的結合能力如本說明書所述得到了證實，並且結合能力高於只通過SELEX選擇而獲得的多核苷酸。因此，由於隨後對利用SEQ ID. No. 8至11的多核苷酸序列由修飾而獲得的序列根據這些多核苷酸序列對PSA的結合能力進行了分選，從而能夠確保獲得與PSA結合的適體。表 2
名稱序列 _______ __________SEQ.1D NO.
APSap2#02TTTTTMTTMGGATTTCCCGGTTGTATCTTTIAPSap2#18TTTTTMTGTCMCGTTGTTTACTGTCCCTTT 9APSap2#16TTTTTACTGTGMCTCGCCATCAMTATCTTT 10APSap2#01TTTTTGCCTACTGATTTCCTTTTTGAGCCTTT_11作為另一種選擇，為了有效地獲得以高結合能力與PSA結合的適體，製備適體的方法優選可利用其它多核苷酸序列(這些多核苷酸序列具有經證實的可導致產生具有高結合能力的適體的歷史)，並且是包括以下步驟的方法對於包括具有SEQ ID No. 10的多核苷酸序列的基礎序列No. 2進行選自由序列之間的交叉和各序列的隨機點突變組成的組的至少一種修飾；和從通過至少一種修飾而獲得的經修飾的序列中分選靶標序列，所述靶標序列的PSA結合能力聞於具有SEQ ID No. 10的標準序列的PSA結合能力。由於本說明書中證實SEQ ID No. 10的多核苷酸序列的結合PSA的能力與PSA的抗體一樣高，因此通過利用SEQ ID:No. 10的多核苷酸序列而獲得的適體可有利地用作前列腺癌的診斷工具。優選可重複上述方法中包括交叉或點突變的利用GA的修飾，從而有效地獲得靶標序列。修飾的重複可以簡單涉及上述步驟的實施。本發明的前列腺癌的診斷方法是包括將上述適體與受試者的體液樣品接觸的方法。根據所述前列腺癌的診斷方法，由於使用以高結合能力與PSA結合的至少一種適體作為檢測工具，該診斷與利用抗PSA的抗體的診斷一樣可靠。此外，由於本發明的適體可通過自動化學合成儀來製備，其製備比抗體更容易並更廉價。因此，進行本發明的對前列腺癌的診斷可以比傳統方法更廉價。可通過檢測或確定樣品中作為靶標物質的PSA，來進行前列腺癌的診斷方法。因此，所述方法優選包括使上述適體接觸受試者的體液樣品和檢測適體與PSA的複合物，或確定適體與PSA的複合物的量。體液樣品可包括但不限於血清、血漿或其稀釋液等。使受試者的體液樣品與上述適體接觸。這可以通過將樣品與適體溶液混合、並溫育所得的混合物來進行。樣品中PSA的檢測或確定可通過已知的普通方法進行。例如，可以利用適體替代抗體進行免疫測試，如免疫色譜或ELISA。另外，可以將利用SPR (表面等離子體共振)的檢測方法或適體印跡方法等改造以用於本發明的診斷。作為另一種選擇，在利用本發明的適體時，可使用W02005/049826和W02007/086403中所述的檢測或測試方法。
可以採用自動檢測裝置以機械方式進行利用上述適體的前列腺癌診斷。在該實施方式中，可以提供具有下述各部的檢測裝置樣品保持部，其保持有包含受試者的體液樣品和適體的檢測樣品；檢測部，其能夠檢測所述檢測樣品中的PSA和適體的複合物；和顯示部，其顯示來自檢測部的檢測結果。通過所述檢測裝置，可以更容易地進行前列腺癌的診斷。樣品保持部可以具有任何可保持檢測樣品的形式。由於檢測樣品在供應到檢測部時可包含受試者的體液和與PSA結合的適體，可以將檢測樣品作為受試者的體液與適體的混合物提供至檢測部；或可以將檢測樣品作為包含體液或適體的分開的液體提供，並在由樣品保持部供應後在檢測裝置中相互混合。檢測部具有能夠檢測PSA與適體之間的結合的構造，並且可以根據對PSA和適體的具體檢測方法來進行選擇。檢測方法的實例可以包括但不限於免疫測試，例如免疫色譜、ELISA或上述SPR等，並且檢測部的實例可以包括但不限於螢光計或SPR裝置等。此外，檢測部具有將檢測結果裝換為檢測數據的計算部。因此，檢測結果可以轉換為數據。顯示部將通過檢測部獲得的結果所產生的檢測數據輸出到顯示器上。顯示器可以是任何已知可用於所述目的的顯示器。通過使用檢測裝置，受試者體液中的PSA的檢測可通過自動檢測來進行。在該實施方式中，檢測方法包括收集受試者的體液的步驟；利用上述適體產生檢測結果數據從而計算體液樣品中PSA的量的步驟；和將檢測結果數據輸出至顯示部的步驟。因此，可以容易地檢測PSA，並且可根據所述結果進行前列腺癌的診斷。由於本發明的適體可以可靠地檢測受試者的體液樣品中的PSA，因此該適體可用作PSA檢測試劑盒的一個組分。在該實施方式中，可提供PSA檢測試劑盒，該試劑盒包括第一容器，其包含含有上述適體的適體溶液；可選的第二容器，其包含可用於稀釋適體溶液或受試者的體液樣品的稀釋劑；和說明利用適體檢測PSA的程序的文件。因此，PSA的檢測可以容易地進行。保持部件的構造沒有特別限制，只要其能夠保持適體即可，並且可以根據試劑盒中所含適體的形式適當選擇。例如，當試劑盒含有溶液形式的適體時，保持部件可以為能夠保持液體的容器。另外，當試劑盒含有作為固定的固相的適體時，保持部件可以為能夠保持固定的固相的板或容器。
另外，試劑盒可以包含不具有與PSA的結合能力的其他適體，作為PSA檢測方法的陰性對照。實施例下面將描述本發明的實施例，但本發明不限於這些實施例。除非另外指出，否則實施例中「％」表示重量(質量)百分比。材料純化自人精液的PSA購自Sigma-Aldrich和Scipac。合成的寡核苷酸購自 Invitrogen、Greiner Bio-One 和 Operon Biotechnologies。硝酸纖維素膜購自GEHealthcare0 人血清購自 Nissui。KAPA2G 快速 PCR 試劑盒購自 KAPA Biosystems。AmpliTaq Gold 購自 Applied Biosystems。pGEM 載體購自 Promega0 抗生物素蛋白-固定化凝膠珠購自Pierce。HRP偶聯的抗FITC抗體購自Dako。止動劑蛋白質印跡化學發光HRP 底物購自Millipore。PolySorp 96孔聚苯乙烯板購自Nunc。封閉試劑N102購自Nof。BM化學發光ELISA底物購自Roche。SA傳感器晶片購自Biacore。其他試劑為分析純級別。通過SELEX進行的對PSA結合適體的選擇使用FITC標記的單鏈DNA文庫，該文庫包含與20聚體引物結合序列在兩端通過三聚體胸腺嘧啶-(T3-)接頭連接的24聚體隨機區域(5，-CATGCTTACCTATAGTGAACTTT (N24) TTTCTTTGAGAACTGACTCATAC-3』 : SEQ ID: No. 15)。該文庫利用正向引物(5，-CATGCTTACCTATAGTGAAC-3』 : SEQ ID: No. 16)和反向引物(5』-GTATGAGTCAGITCTCAAAG-3』 :SEQ ID:No. 17)擴增。DNA 文庫在 95°C加熱 10 分鐘，然後在 TBS 緩衝液(IOmM Tris/HCl, 150mM NaCl, 5mMKCl, 5mM MgCl2, pH 7. 4)中在 30 分鐘時間內逐漸冷卻至25°C，形成摺疊結構。將PSA(Iyg)點印在硝酸纖維素膜上，並空氣乾燥。將PSA點印的膜與含0. 5% Tween 20 (TBST)的TBS緩衝液中的10% (體積/體積)人血清溫育I小時，以減少DNA與硝酸纖維素膜的非特異性結合。以TBST緩衝液洗滌後，將膜與TBST緩衝液中的DNA文庫於室溫溫育I小時。洗滌後，將膜上點印PSA的區域切下，通過苯酚-氯仿抽提和乙醇沉澱來純化結合PSA的寡核苷酸。利用FITC標記的正向引物、生物素標記的反向引物和KAPA2G快速PCR試劑盒，將所收集的寡核苷酸通過PCR擴增。利用固定抗生物素蛋白的凝膠珠製備了用於下一輪篩選的單鏈DNA文庫。第3輪後，將所選擇的DNA文庫利用AmpliTaq Gold通過PCR擴增，並亞克隆到pGEM載體中，然後分析各克隆物的序列。通過此前描述的適體印跡方法(Hasegawa等2008; Yoshida等2009),評價各輪篩選的DNA文庫的PSA結合能力。對此將在以下部分中簡述。適體與PSA的結合測試(I)適體印跡測試FITC標記的適體如上所述進行摺疊。將PSA點印的膜以TBST緩衝液中4%(體積/體積)脫脂乳封閉，並與FITC標記的適體於室溫溫育I小時。洗滌後，將膜與HRP偶聯的抗FITC抗體於室溫溫育I小時，然後通過止動劑蛋白質印跡化學發光HRP底物使其中PSA與DNA文庫結合的點可視化,並通過Typhoon 8600 (GE lifesciences)檢測。(2)平板測試為了使用平板測試，將24聚體DNA寡核苷酸在其5』端通過T5-接頭進行FITC標記，並在其3』端添加T3,從而得到32聚體的總長度。將100 u L量的處於PBS緩衝液(pH7.4)中的PSA(最終濃度為5i!g/mL)添加到96孔聚苯乙烯板中。於37°C通過溫和振蕩溫育2小時後，去除上清液，並以TBST緩衝液洗滌各孔。向各孔中添加100 ii L的5倍稀釋的封閉劑N102，並在室溫溫和振蕩I小時，然後洗滌3次。將FITC標記的適體在上述TBS緩衝液中加熱處理，以進行摺疊。向各孔中添加100 u L量的處於TBST緩衝液中的FITC標記的適體(5 ii M)，並在室溫溫育I小時。洗滌3次後，向各孔中添加HRP偶聯的抗FITC抗體，並通過室溫溫和振蕩I小時從而進行溫育。將各孔洗滌5次，加入BM化學發光HRP底物，然後通過多標記平板計數器Wallacl420 ARVO MX (Perkin Elmer)測定HRP活性。利用GA對PSA結合能力的改善在通過GA的第一輪序列控制中，通過SELEX獲得的5種適體的寡核苷酸序列在計算機中以相同的表觀速率複製，並與不同序列隨機配對從而形成10對。每對的序列在一個隨機點交叉，並且每個序列隨機引入2個鹼基突變以產生20條新序列的組。通過上述平板測試評價了這20條新序列的PSA結合能力，並將序列根據其PSA結合能力進行分級。為了產生下一代，選擇顯示出較高PSA結合能力的序列，並且它們根據分級以不同的表觀速率複製。三輪GA運算後，發現了顯示最高PSA結合能力的寡核苷酸。然後，在用於產生下一 代的寡核苷酸序列中弓I入隨機的單鹼基突變。通過平板測試來傳感PSA以下述變化形式來進行如上所述的用於PSA檢測的平板測試。將具有IOnM至500nM的各種終濃度的在處於PBS緩衝液(pH 7. 4)中的100 u L量的PSA加入到96孔聚苯乙烯平板中，並在37°C通過溫和振蕩溫育2小時。在用封閉試劑N102封閉後，在各孔中加入預先通過熱處理而摺疊的IOOii L量的處於TBST緩衝液中的4 ii MFITC標記的APSap4#5，並在室溫通過溫和振蕩溫育I小時。在與HRP偶聯抗FITC抗體溫育後，測定HRP的化學發光。結果I.通過SELEX選擇PSA結合適體進行SELEX，以便發現作為利用GA的後選擇的備選物的PSA結合適體。PSA固定在硝酸纖維素膜上，並純化與PSA結合的DNA文庫以及利用FITC標記的正向引物和生物素標記的反向引物通過PCR進行擴增。DNA文庫與膜在第一輪以I PM的濃度溫育，在第二輪以400nM的濃度溫育，在第三輪以390nM的濃度溫育。在第三輪SELEX中，確認出表明DNA文庫與PSA結合的硝酸纖維素膜上的小點(圖I)。由此，分析了 DNA文庫中的寡核苷酸序列。對第三個文庫的12個不同克隆物進行了測序，獲得了 11種不同序列(表3)。通過適體印跡方法研究了所獲得的寡核苷酸序列的PSA結合能力。結果，名為PSap#4-3(SEQ. ID:No. 20)、PSap#4-4(SEQ. ID:No. 21)、PSap#4-6(SEQ. ID:No. 23)、PSap#4-9 (SEQ. ID:No. 25)和PSap#4-ll(SEQ. ID:No. 27)的五個克隆物顯示出與膜上的PSA結合。在表3中，引物結合位點以下劃線字母顯示。表3名稱頻率》 序列sIcl111
PSap#4-1I5』-CATGCTTACCTATAGTGMCnGTTATG6MTCACTGCCCAfiC(nTTCATGCnACCTATA6T6MC-3』18
PSap#4-2I5『-CATCCTTACCTATAGTGAACTTTCCCTCCTTGCCGATCTAGCGTCnTTTCATGCTTACCTATAGTGAAC-3』11
PSapW-3I5'-CATGCTTACCTATAGTGAACTTTACTTAATaATTTCCCGGTTGTCTCTTTCATQCTTACCTATAGTflAAC^3'20
PSap#4-425'-CATCCTTACCTATAGTCMCTTTCTGGTOnTATTGnTACTgTCCCnTCATGCTTACCTATAGTflMCd'21
PSap#4-515'-CATfiCTTACCTATAGTCAACTTTAnASCCTCCCGSAAGAGCACCTCTTTCATWTTACCTATAGTlMAC-3』22
PSapM-6I5'-CATGCTTACCTATAGTGAACTTTCCGCACCaGGTACGTTTTTTOGCCTTTCATQCTTACCTATAGTflAAC-3'23
PSap#4-715'^CATQCTTACCTATAGTeAACTTTCTGC6TTCTTTCTTCCTACTTCACGTTCAT6CTTACCTATABT6AAC^3'24·PSap#4-9I5.-G膽CT駡而鋪TCMCmMT腿ACnSCC腿MTATCTTTC綱CTTAGCT_TaMM』25
PSapMHOI5』-CAT6CTTACCIATAGTGAACTTTTG6C6CA6TACTS6TCTflCCTGGCTTTCAT0CTTACCTATAGT6AAC-3-26
psapM-ii15』-SMmm瞧麗靈ttt畫wccmAAcsm糊cccmm祖mmmms-3'n
PSbp#4-I215』-CATGCTTACCTAT TGAACTTTCC6TTGTAGCCTGGCTTCTACCTATTTCilTGCTT4CCTWMTGMC-3,28利用GA改善PSA結合能力雖然需要具有高PSA結合能力的適體以便將其用作PSA傳感中的識別元件，但由於文庫中序列多樣性的限制和上述PCR偏差，SELEX可能不能篩選出高親和力適體。為了對備選物利用GA進行適體的SELEX後篩選，利用GA將通過SELEX預先選擇出的5個序列作為用於產生20個寡核苷酸序列的組的「親代」。將這些寡核苷酸合成，並通過平板測試評價PSA結合能力。通過檢測HRP偶聯的抗FITC抗體的化學發光(表示針對固定在聚苯乙烯板的孔上的PSA的寡核苷酸(n=2)的結合)，從而測定PSA結合能力。通過第一代中最高(top)的寡核苷酸的信號強度，將信號強度標準化。然後，根據PSA結合能力將寡核苷酸進行分級，並選擇分級前4位的序列來產生下一組寡核苷酸序列。將寡核苷酸合成、平板測試和寡核苷酸序列評價的利用GA的循環重複3次，當設定該過程為計算機中的PSA結合適體的進化時，每一循環對應於一代。在一輪GA運算後，獲得了 4條第二代序列SEQ ID:No.8至11。在總共3輪GA運算後，在第三代的顯示出最高PSA結合能力的序列中引入隨機單鹼基突變，從而產生第四代。用於產生下一代的分級靠前的序列的數量、以及用於複製以配對的寡核苷酸序列的表觀速率在各代中不同(表4)。表 4.
權利要求
1.一種結合前列腺特異性抗原(PSA)的適體，所述適體包含 具有由I至10個核苷酸組成的隨機多核苷酸序列的前區； 位於所述前區的3』端的由nnnnCT組成的第一區，其中各n獨立選自A、T、G和C ; 由nnCTTT組成的第二區，其中各n獨立選自A、T、G和C，並且所述第二區的至少一部分與所述第一區互補；和 位於所述第一區和所述第二區之間並且由具有3至30個核苷酸的隨機多核苷酸序列組成的第三區。
2.如權利要求I所述的適體，其中所述第一區是(A或C)A(A或G)GCT。
3.如權利要求I或2所述的適體，其中所述第二區是(A或C)(A或G)CTTT。
4.如權利要求I至3中任一項所述的適體，其中所述第三區由CGCCATCAGAT或與其有I至5個鹼基不同的多核苷酸序列組成。
5.如權利要求I或4所述的適體，其中所述前區由Tm(A或T)(A或C)T(T或G)組成，並且m是I至10的整數。
6.如權利要求I至5中任一項所述的適體，其中所述前區由TTTTTAATT或TTTTTAATG，或與這些序列中的任一個有I或2個鹼基不同的多核苷酸序列組成。
7.如權利要求I中任一項所述的適體，其中所述適體是以下(I)至(3)中的一種 (1)SEQID No. I至7的多核苷酸； (2)除了分別在第三區和前區中的每個區中有I至5個核苷酸不同之外，序列與SEQIDNo. I至7相同的多核苷酸；或 (3)除了分別在第一區和第二區中總共有I至5個核苷酸不同並且第三區和前區中的每個區中有I至5個核苷酸不同之外,序列與SEQ ID No. I至7相同的多核苷酸。
8.一種前列腺癌的診斷方法，所述方法包括使權利要求I至7中任一項所述的適體接觸受試者的體液樣品。
9.如權利要求8所述的方法，所述方法還包括檢測所述適體與PSA的複合物。
10.如權利要求8所述的方法，所述方法還包括確定所述適體與PSA的複合物的量。
全文摘要
本發明提供了一種結合前列腺特異性抗原(PSA)的適體，所述適體包含具有由1至10個核苷酸組成的隨機多核苷酸序列的前區；位於所述前區的3'端的由nnnnCT組成的第一區，其中各n獨立選自A、T、G和C；由nnCTTT組成的第二區，其中各n獨立選自A、T、G和C，並且所述第二區的至少一部分與所述第一區互補；和位於所述第一區和所述第二區之間並且由具有3至30個核苷酸的隨機多核苷酸序列組成的第三區。
文檔編號C12Q1/68GK102971422SQ20108006771
公開日2013年3月13日 申請日期2010年7月2日 優先權日2010年7月2日
發明者池袋一典 申請人:國立大學法人東京農工大學