一種用於鑑定中藥人參的引物對及其應用的製作方法

2023-11-03 00:58:42 1

本發明屬於分子生物學領域，涉及一種採用分子生物學手段鑑定中藥的方法，具體為一種用於鑑定中藥人參的引物對及其應用。
背景技術：
：人參屬植物藥材的鑑定方法主要有形態鑑定、理化鑑定、細胞鑑定等，這些傳統的鑑定手段由於易受環境條件的影響或植物本身的限制，認為幹擾因素較多，無法直接體現種質的遺傳特徵，有時難以得到準確的結果。人參類中藥的鑑定是研究中藥品種、質量，制定中藥標準，尋找和擴大藥源的前提和基礎。中藥四大傳統鑑定方法為基源鑑定、性狀鑑定、顯微鑑定和理化鑑定。傳統鑑定方法的理論基礎建立於分類群的性狀特徵分析，這些性狀特徵是與環境緊密相關的表現型。從分子遺傳學角度來看，物種表現型的差異歸根結底應追溯到基因型的差異，即在dna序列上的差異。因此，對基因組序列差異的比較研究無疑為植物分類和鑑定提供了本質依據。隨著生命科學不斷取得重大突破，分子生物學鑑定方法應運而生，此類方法應用dna分子標記技術鑑定中藥源植物及其藥材和飲片，取得了快速發展。從1994年ap-pcr首次用於人參、西洋參的鑑別以來，dna分子標記鑑別應用於參類藥材鑑別已有不少的報導，rflp、ssr、rapd、ap-pcr、aflp、issr、snp等技術相繼應用於參類藥材的鑑別鑑定。然而，這些技術由於存在著操作步驟繁瑣、工作量大、試驗結果重複性差等弱點，難以在實際中得到應用而逐漸退出舞臺。隨著分子生物學的發展和後基因組時代的到來，一些新的技術為參類藥材的鑑定提供了新的方法。但是現有技術中人參鑑定的條形碼通用性差，區分不同變異品種的能力差，且在植物中dna條形碼的研究進展相對緩慢，目前尚處於對所提議的各片段比較和評價階段，還未獲得一致的標準片段。技術實現要素：本發明的目的是：為了克服現有技術中的缺陷，獲得一種通用性好，特異性好，靈敏度高的引物對，本發明提供了一種用於鑑定中藥人參的引物對及其應用。技術方案：一種用於鑑定中藥人參的引物對，所述引物對及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。優選的，所述引物對p1、p2和p3的上遊引物的5，端加上特異性的gc發卡結構，所述發卡結構的長度為40bp，序列為seqidno.7。表1引物對及發卡結構序列名稱序列(5，-3，)seqidno.p1-fgcgtttcttttcctccgct1p1-rggaggagaagtcgtaacaag2p2-fcggttatgcatgaacgtaatgctc3p2-rcgctggtggattcacaaatc4p3-fgcataacaataccggggtcatt5p3-rggccagtcatggcaggag6發卡結構cgcccgccgcgcgcggcgggcggggcgggggcacgggggg7所述引物對在製備鑑定中藥人參試劑盒中應用。優選的，所述試劑盒的組分包括：引物對、dntp、dna聚合酶、lcgreen、反應緩衝液。優選的，所述試劑盒鑑定中藥人參的步驟包括：(1)提取人參樣品的基因組dna；(2)以步驟(1)提取的基因組dna為模板，以p1為特異性引物，進行第一輪pcr擴增；(3)取步驟(2)的擴增產物，稀釋100～1000倍後作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進行第二輪pcr擴增；(4)取第二輪pcr擴增的產物，稀釋10～100倍後作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進行第三輪pcr擴增；(5)收集第三輪pcr擴增的產物，並採用瓊脂糖凝膠電泳檢測。進一步的，所述人參樣品的基因組dna的提取方法是試劑盒法或改良ctab法。進一步的，所述pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個循環；72℃，7min。有益效果：(1)本發明所述引物對具有通用性好，能夠區分變異品種的人參；(2)本發明所述引物對特異性好、靈敏度高。附圖說明圖1是實施例1～3pcr鑑定結果電泳圖；其中m為分子量為2000的maker；1為實施例1pcr產物鑑定結果；2為實施例2pcr產物鑑定結果；3為實施例3pcr產物鑑定結果。具體實施方式實施例1一種用於鑑定中藥人參的引物對，所述引物對及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。所述引物對p1、p2和p3的上遊引物的5，端加上特異性的gc發卡結構，所述發卡結構的長度為40bp，序列為seqidno.7。所述引物對在製備鑑定中藥人參試劑盒中應用。所述試劑盒的組分包括：引物對、dntp、dna聚合酶、lcgreen、反應緩衝液。優選的，所述試劑盒鑑定中藥人參的步驟包括：(1)提取人參樣品的基因組dna；(2)以步驟(1)提取的基因組dna為模板，以p1為特異性引物，進行第一輪pcr擴增；(3)取步驟(2)的擴增產物，稀釋100倍後作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進行第二輪pcr擴增；(4)取第二輪pcr擴增的產物，稀釋100倍後作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進行第三輪pcr擴增；(5)收集第三輪pcr擴增的產物，並採用瓊脂糖凝膠電泳檢測。所述人參樣品的基因組dna的提取方法是試劑盒法或改良ctab法。所述pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個循環；72℃，7min。實施例2一種用於鑑定中藥人參的引物對，所述引物對及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。所述引物對p1、p2和p3的上遊引物的5，端加上特異性的gc發卡結構，所述發卡結構的長度為40bp，序列為seqidno.7。所述引物對在製備鑑定中藥人參試劑盒中應用。所述試劑盒的組分包括：引物對、dntp、dna聚合酶、lcgreen、反應緩衝液。優選的，所述試劑盒鑑定中藥人參的步驟包括：(1)提取人參樣品的基因組dna；(2)以步驟(1)提取的基因組dna為模板，以p1為特異性引物，進行第一輪pcr擴增；(3)取步驟(2)的擴增產物，稀釋1000倍後作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進行第二輪pcr擴增；(4)取第二輪pcr擴增的產物，稀釋10倍後作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進行第三輪pcr擴增；(5)收集第三輪pcr擴增的產物，並採用瓊脂糖凝膠電泳檢測。所述人參樣品的基因組dna的提取方法是試劑盒法或改良ctab法。所述pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個循環；72℃，7min。實施例3一種用於鑑定中藥人參的引物對，所述引物對及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。所述引物對p1、p2和p3的上遊引物的5，端加上特異性的gc發卡結構，所述發卡結構的長度為40bp，序列為seqidno.7。所述引物對在製備鑑定中藥人參試劑盒中應用。所述試劑盒的組分包括：引物對、dntp、dna聚合酶、lcgreen、反應緩衝液。優選的，所述試劑盒鑑定中藥人參的步驟包括：(1)提取人參樣品的基因組dna；(2)以步驟(1)提取的基因組dna為模板，以p1為特異性引物，進行第一輪pcr擴增；(3)取步驟(2)的擴增產物，稀釋500倍後作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進行第二輪pcr擴增；(4)取第二輪pcr擴增的產物，稀釋60倍後作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進行第三輪pcr擴增；(5)收集第三輪pcr擴增的產物，並採用瓊脂糖凝膠電泳檢測。所述人參樣品的基因組dna的提取方法是試劑盒法或改良ctab法。所述pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個循環；72℃，7min。如圖1所示，將實施例1～3的擴增產物進行電泳檢測，條帶清晰可見，產物單一。sequencelisting蘇州市李良濟健康產業有限公司一種用於鑑定中藥人參的引物對及其應用7patentinversion3.3119dna人工序列1gcgtttcttttcctccgct19220dna人工序列2ggaggagaagtcgtaacaag20324dna人工序列3cggttatgcatgaacgtaatgctc24420dna人工序列4cgctggtggattcacaaatc20522dna人工序列5gcataacaataccggggtcatt22618dna人工序列6ggccagtcatggcaggag18740dna人工序列7cgcccgccgcgcgcggcgggcggggcgggggcacgggggg40當前第1頁12