受對氯硝基苯類化合物汙染的環境的生物修複方法
2023-11-03 01:08:57
專利名稱：受對氯硝基苯類化合物汙染的環境的生物修複方法
技術領域：
本發明涉及一種受汙染環境的生物修複方法，特別是涉及一種受對氯硝基苯類化合物汙染的環境的生物修複方法。
背景技術：
隨著我國工、農業的迅速發展，環境汙染問題日益成為我國社會發展過程中十分嚴重和迫切需要解決的問題，它不僅制約了我國的經濟發展和人民生活水平的提高，而且嚴重限制了我國社會的可持續發展，對人民健康產生極大威脅，因此，對汙染土壤的修復治理成為人們十分關注的問題。80年代中期，利用生物修復技術對汙染土壤進行整治開始得到應用，多年的研究表明，生物修復，既利用微生物或其他生物將土壤、水體中的汙染物降解為二氧化碳和水等無害物質的技術，是一種安全又經濟的方法。在有機汙染的生物修復過程中，起到關鍵作用的是具有降解不同汙染物能力的微生物，其次是植物。目前，人們逐漸將目光轉移到利用微生物與植物根系之間的相互作用促進汙染物的降解。植物根系能夠改變土壤的物理結構，增加土壤通氣量、含水量以及改變pH值；更重要的是，植物的根系能夠分泌大量物質，包括胺基酸、糖類、有機酸以及多肽等，這些物質可以為微生物的生長與繁殖提供營養物質，延長其存活時間；另外，某些有機化合物能夠刺激或誘導微生物的代謝活性，加速汙染物的降解；此外，植物根系還能夠深入土壤，促進微生物的廣泛分布，並且還能吸收土壤中的水分，因此一些水溶性的汙染物可以聚集在根系附近，有利於根系周圍微生物充分發揮其降解能力，達到快速高效降解汙染物的目的；另一方面，降解菌株通過對汙染物進行降解，降低了汙染物對植物的毒害作用，保護了植物，使得雙方受益，從而相互促進，加速了汙染物的降解過程。
氯代硝基苯類化合物(chloronitrobenzens，CNB)是一類重要的化工原料和中間體，被廣泛地運用於橡膠製造、染料以及農藥生產等領域。目前，我國氯代硝基苯工業經過50多年的發展，生產廠家達20多家，總年產能力近20萬噸，已佔世界總年產能力的50％以上。然而，隨之而來的是氯代硝基苯等芳香化合物通過各種途徑進入環境成為汙染物。例如，生產過程中排放的汙水中含有大量殘留物，或者環境中其他芳香化合物經過不徹底的降解或轉化形成了一些硝基取代的芳香化合物；在自來水的氯化消毒過程中，也會產生氯代硝基苯類化合物。研究表明，氯代硝基苯類化合物具有致畸、致癌、致突變的「三致」作用。在氯代硝基苯類化合物中，又以氯代硝基苯最為嚴重，例如，對氯硝基苯能夠引起人或動物的高鐵血紅蛋白症(methemoglobinemia)或貧血(anemia)，因此歐盟已經將氯代硝基苯確定為特別有害的化合物。
目前，國內外對氯代硝基苯類化合物降解的研究報導較少，只有個別報導了有關對氯硝基苯的微生物降解，而將這些微生物運用於實際的生物修復中則更少。
發明內容
本發明的目的是提供一種受對氯硝基苯類化合物汙染的環境的修複方法。
本發明所提供的受對氯硝基苯類化合物汙染的環境的修複方法，是將萌發出根芽的苜蓿種子浸泡於OD600值為1.8-2.2的睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonastestosteroni)CNB-l CGMCC No.1028的菌懸液中進行包被，再將經睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosteroni)CNB-1 CGMCC No.1028包被的苜蓿種子植入受氯硝基苯類化合物汙染的環境中進行培養，隨著苜蓿的生長，環境中的硝基苯類化合物逐步得到降解，起到修復作用。
睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosteroni)CNB-1 CGMCC No.1028已在專利「一種降解對氯代硝基苯的睪丸酮叢毛單胞菌及其用途」中公開，專利申請號200310114337.7。
在上述修複方法中，睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosteroni)CNB-1 CGMCCNo.1028菌懸液的OD600值優選為2.0；睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonastestosteroni)CNB-1 CGMCC No.1028的菌懸液的製備方法可為將睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosteroni)CNB-1 CGMCC No.1028菌體重懸於質量百分濃度為0.9％NaCl溶液中。
苜蓿種子萌發的條件可為將苜蓿種子置於溼潤濾紙上，在30℃下暗培養。
包被時間為50-70min，優選為60min。
本發明的修複方法既適用於受對氯硝基苯類化合物汙染的土壤環境，也適用於受此類化合物汙染的無土基質。所述對氯硝基苯類化合物為對氯硝基苯。
可按常規方法對睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosteroni)CNB-1 CGMCCNo.1028菌進行培養，具體過程可包括以下步驟1)將睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosteroni)CNB-1 CGMCC No.1028接種於以對氯硝基苯為底物的無機鹽培養基中，在28-30℃下振蕩培養12-18h，得到種子液；所述無機鹽培養基配方為磷酸氫二鈉1.0g，磷酸二氫鉀0.5g，MgSO4·7H2O 0.03g，微量元素溶液5mL，對氯硝基苯200mg，用水定容至1000mL，pH6.8-7.2，所述儆量元素溶液含EDTA 0.5g，ZnSO4·7H2O 0.22g，CaCl20.055g，MnCl2·4H2O 0.051g，FeSO4·7H2O 0.0499g，(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.011g，CuSO4·5H2O 0.0157g，CoCl2·6H2O 0.0161g，用水定容至1000mL，pH6.0；2)將步驟1)獲得的睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosteroni)CNB-1 CGMCCNo.1028的種子液接種於LB液體培養基中，在28-30℃下振蕩培養。
所述步驟1)中無機鹽培養基的pH值優選為7.0；所述振速為100-150rpm，優選為130rpm。
步驟2)中睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosteroni)CNB-1 CGMCC No.1028種子液的接種量為1-2％；所述培養溫度優選為30℃，振速為100-150rpm，優選為130rpm，培養時間為12-24h，優選為12-18h。
本發明提供了一種受對氯硝基苯類化合物汙染的環境的修複方法。該方法利用了睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosteroni)CNB-1 CGMCC No.1028對對氯硝基苯類化合物的降解作用，同時與豆科植物苜蓿建立組合可對受到對氯硝基苯汙染的環境進行生物修復。該菌株可定植在苜蓿根系並與其相互促進，從而發揮高效降解汙染物-對氯硝基苯類化合物的效能，達到對受此類化合物汙染的環境的生物修復作用，使其恢復生態功能。本發明具有以下優點1)在汙染環境的生物修復過程中，微生物因其具有廣泛的代謝途徑，以及能夠降解多種類型的汙染物而起到關鍵作用，是生物修復的主體，而植物在汙染環境的生物修復中也起到重要作用，植物具有發達的根系，不僅能夠改善土壤的物理性質，還能夠分泌大量有機物質，不僅為微生物提供了生長繁殖所需的營養物質，而且其中一些有機化合物能夠誘導或增強微生物的某些代謝途徑，促進微生物對汙染物的利用和降解，或通過共代謝作用將汙染物降解，因此將具有對氯硝基苯類化合物高效降解能力的菌株與具有發達根系的豆科植物苜蓿形成組合可提高生物修復能力；2)將植物根系與高效降解菌株聯合，克服了單一的微生物修復技術或植物修復技術的不足首先，採用植物根系-微生物系統能較好地延長降解菌株在土壤中的存活時間，由於植物根系能分泌大量營養物質，為降解菌株提供了生長所必須的一些要素或生長因子，根系周圍的微觀環境優於非根系土壤，延長了降解菌株的存活周期，有利於其發揮降解活性；其次，植物發達的根系能夠吸收土壤中的水分，使得一些水溶性的汙染物隨著水的流動向植物根系靠近，這將有利於降解菌株於汙染物接觸，加速降解過程，而且植物根系能夠進入土壤深處，有利於降解菌株在土壤中的廣泛分布；另外，微生物通過降解汙染物，降低了土壤中汙染物對植物的毒性，間接地增強了植物對汙染物的耐受性，使得植物能夠更好的生長，從而促進降解菌株的存活，二者通過這種相互作用，起到了相互促進、互利互惠的效果，有利於汙染物的降解；3)所採用的高效降解菌株為從汙染源分離得到的野生型菌株，沒有經過基因工程改造，因此不會引起生物安全問題，容易被社會接受；4)該方法應用簡便，無需大量資金投入，經濟實用，適合大面積的汙染環境的修復，且不會產生二次汙染。
基於上述優點，本發明將在受對氯硝基苯類化合物汙染的環境的生物修復中發揮巨大作用，並為開發新型的汙染土壤生物修復技術以及汙水土地處理技術具有重要的實際應用意義。
下面結合具體實施例對本發明作進一步詳細說明。
圖1為實驗組和對照組植株在受不同濃度對氯硝基苯汙染的土壤中的生長情況圖2為經綠色螢光蛋白標記的降解菌-睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonastestosteroni)CNB-1::gfp2在苜蓿根系定植的共聚焦雷射掃描顯微照片具體實施方式
下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法。
無機鹽培養基磷酸氫二鈉1g，磷酸二氫鉀0.5g，MgSO4·7H2O 0.03g，微量元素溶液5mL，對氯硝基苯200mg，用蒸餾水定容至1000mL，pH7.0；微量元素溶液EDTA 0.5g，ZnSO4·7H2O 0.22g，CaCl20.055g，MnCl2·4H2O 0.051g，FeSO4·7H2O 0.0499g，(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.011g，CuSO4·5H2O 0.0157g，CoCl2·6H2O 0.0161g，用水定容至1000mL，pH6.0；121℃滅菌30min。
LB液體培養基蛋白腖10g，酵母粉5g，NaCl 10g，用蒸餾水定容至1000mL，pH7.2。
實施例1、檢測本發明方法對受對氯硝基苯類化合物汙染的無土基質的修復能力以對氯硝基苯為例，檢測本發明方法對受對氯硝基苯類化合物汙染的無土基質的修復能力，具體過程包括以下步驟1)將睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosteroni)CNB-1 CGMCC No.1028接種於以對氯硝基苯為底物的無機鹽培養基中，在28℃、130rpm下振蕩培養16h，得到種子液；2)將步驟1)獲得的睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosteroni)CNB-1 CGMCCNo.1028的種子液按1％的接種比例接種於LB液體培養基中，在30℃下振蕩培養18h；3)6000rpm離心收集菌體，將其重懸於無菌的質量百分濃度為0.9％NaCl溶液中，使其OD600達到2.0，得到睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosteroni)CNB-1 CGMCCNo.1028的菌懸液；4)將苜蓿種子置於溼潤濾紙上，30℃避光萌發2天，待長出根芽(約5mm)後，將其浸泡於步驟3)獲得的睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosteroni)CNB-1 CGMCCNo.1028的菌懸液中進行包被，浸泡時間為60min；5)將經睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosteroni)CNB-1 CGMCC No.1028包被的苜蓿種子移栽於營養基質(KNO318.5mg，KH2PO424.8mg，MgSO4·7H2O 65.9mg，CaCl260mg，FeSO4·7H2O 30mg，EDTA·2Na 20mg，微量元素溶液(同上)1mL，H2O 1000mL，pH 6.8-7.0，蛭石若干)上進行無土栽培，同時設未包被的苜蓿作為對照，在營養基質中添加終濃度分別為0、50、100、200μg/mL的對氯硝基苯，在25℃溫室中進行培養，每天光照培養(光照強度為1400lux)18h，避光培養6h，考查苜蓿的生長情況以及對氯硝基苯的降解情況。實驗進行8天後進行數據分析，採用菌落計數法(CFU法)對培養體系中苜蓿根系和非根系土壤基質的降解菌數量進行計數，採用HPLC法分析對氯硝基苯的降解情況，結果如表1所示，苜蓿根系區域的降解菌數量明顯高於非根系區域，經包被處理的苜蓿其生長量在汙染物存在的情況下要明顯高於未包被的對照組，表明其本發明的方法對無土基質中的汙染物-對硝基苯具有較好的降解效果，可起到環境修復作用。該結果說明本發明方法中所形成的微生物-植物體系中，睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosteroni)CNB-1 CGMCC No.1028和苜蓿具有相互促進的作用關係，苜蓿根係為降解菌提供某種有利因素，而降解菌的存在可以很好地保護植物免受汙染物的危害，使系統處理汙染物的能力充分發揮。
表1對受對氯硝基苯類化合物汙染的無土基質的修復能力檢測結果
實施例2、檢測本發明方法對受對氯硝基苯類化合物汙染的土壤的修復能力以對氯硝基苯為例，用盆栽實驗檢測本發明方法對受對氯硝基苯類化合物汙染的土壤的修復能力，具體過程包括以下步驟1)將睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosteroni)CNB-1 CGMCC No.1028接種於以對氯硝基苯為底物的無機鹽培養基中，在30℃、130rpm下振蕩培養16h，得到種子液；2)將步驟1)獲得的睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosteroni)CNB-1 CGMCCNo.1028的種子液按1％的接種比例接種於LB液體培養基中，在28℃下振蕩培養18h；3)7000rpm離心收集菌體，將其重懸於無菌的質量百分濃度為0.9％NaCl溶液中，使其OD600達到2.0，得到睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosteroni)CNB-1 CGMCCNo.1028的菌懸液；4)將苜蓿種子置於溼潤濾紙上，30℃避光萌發2天，待長出根芽(約5mm)後，將其浸泡於步驟3)獲得的睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosteroni)CNB-1 CGMCCNo.1028的菌懸液中進行包被，浸泡時間為60min；5)將經睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosteroni)CNB-1 CGMCC No.1028包被的苜蓿種子以10粒為一組進行盆載種植作為實驗組；以未經包被處理的苜蓿種子10粒為一組進行盆載作為對照組。盆載所用的土壤為沙土+花卉營養土+蛭石(混合比例1∶1∶1)，每盆土壤350g，所有盆載都在室外自然光照環境條件下進行培養。待苜蓿生長5天後，對照組和實驗組中的植株再分為不同濃度處理組，每天分別用15mL含不同濃度(0，50，100，200mg/L)對氯硝基苯的水溶液澆灌一次。經過15天的培養後，測定苜蓿的生長情況以及對氯硝基苯的降解情況。
苜蓿的生長情況如圖1所示，數據如表2所示，經包被處理的實驗組，在經過10天不同濃度對氯硝基苯澆灌後，各盆苜蓿的平均株高、根長以及總生長量沒有明顯的差異，特別是經50mg/L對氯硝基苯溶液澆灌的實驗組，苜蓿的平均根長和總生長量還略高於其他實驗組；而經未包被的對照組，在經過10天不同濃度對氯硝基苯溶液澆灌後，各盆苜蓿的平均株高和根長以及總生長量存在明顯差異，且隨汙染物濃度的提高長勢呈現明顯的下降趨勢。上述檢測結果表明在所實驗的對氯硝基苯濃度範圍內，該降解菌的存在完全可以保護苜蓿免受汙染物的危害，也說明了睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosteroni)CNB-1 CGMCC No.1028對對氯硝基苯類化合物具有降解作用。
表2對受對氯硝基苯類化合物汙染的土壤的修復能力的盆栽實驗結果
實施例3、睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosteroni)CNB-1 CGMCC No.1028在苜蓿根系定植能力的檢測為了便於觀察對氯硝基苯降解菌株睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosteroni)CNB-1 CGMCC No.1028在生物修復過程中在植物根系的定植情況，現將綠色螢光蛋白(green flouresence protein，GFP)基因整合在睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonastestosteroni)CNB-1的基因組DNA上，具體方法為(1)睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosteroni)CNB-1感受態細胞的製備將發明內容步驟1)中得到的種子液按照1％的接種量接入LB液體培養基中，在28℃下，130rpm振蕩培養，使其OD600達到0.3-0.4，(以下操作均在4℃進行)4500rpm下離心收集菌體細胞，用4℃預冷的超純水將菌體細胞重新懸浮，4500rpm下離心收集菌體細胞，重複上述操作兩次後，用4℃預冷的10％(v/v)甘油將菌體重新懸浮，4500rpm下離心收集菌體細胞，用10％(v/v)甘油將菌體重新懸浮，使其濃度達到1011個細胞/mL，此即為感受態細胞，置於-70℃保存；(2)取200μL上述感受態細胞，加入1μg質粒pFAJ1820(該質粒含有綠色螢光蛋白基因和卡那黴素抗性基因Xi C，Lambrechts M，VanderleydenJ and Michiels J.Bi-functional gfp-and gusA-containing mini-Tn5 transposonderivatives for combined gene expression and bacterial localization studies.Journal of Microbiological Methods，1999，3585-92.)，混合後置於電擊杯中進行電擊轉化，轉化條件為2.5kV，200Ω，25μF；(3)用1.0mL SOC液體培養基將電擊轉化的細胞懸浮(SOC液體培養基的組成為蛋白腖10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 0.5g/L，葡萄糖20mM，pH7.0)，置於28℃，130rpm振蕩培養40-60分鐘，取200μL上述細胞懸液塗布於含有150μg/mL卡那黴素的LB固體平板上，置於30℃暗培養24h；(4)將生長出菌落的LB固體平板置於手提式紫外燈下觀察，將具有明顯綠色螢光的菌落挑出，命名為CNB-1::gfp2，經檢測該突變株的生長和降解活性與原始菌株相同，並且能穩定地表達綠色螢光蛋白，在螢光顯微鏡下可觀察到明顯的綠色螢光。採用與實施例2同樣的處理方法，使用苜蓿與睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonastestosteroni)CNB-1::gfp2對含有對氯硝基苯的汙染土壤進行修復實驗。一定時間後，將苜蓿取出，用無菌水清洗根，取約1cm根組織，放在載玻片上，加幾滴無菌水，蓋上蓋玻片後，在螢光顯微鏡或共聚焦雷射掃描顯微鏡(confocal leaserscanning microscopy，CLSM)下觀察，如圖2所示，可以看到標記菌株能夠定植在根表面，根細胞間隙或死亡的根表皮細胞內，表明降解菌睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosteroni)CNB-1 CGMCC No.1028能夠在苜蓿根系中定植，這是高效發揮其降解對氯硝基類汙染物功效的基礎。
權利要求
1.一種受對氯硝基苯類化合物汙染的環境的生物修複方法，是將萌發出根芽的苜蓿種子浸泡於OD600值為1.8-2.2的睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonastestosteroni)CNB-1CGMCC No.1028的菌懸液中進行包被，再將經睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosteroni)CNB-1CGMCC No.1028包被的苜蓿種子植入受氯硝基苯類化合物汙染的環境中進行培養，環境得到修復。
2.根據權利要求1所述的生物修複方法，其特徵在於所述睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosteroni)CNB-1CGMCC No.1028菌懸液的OD600值為2.0。
3.根據權利要求1或2所述的生物修複方法，其特徵在於所述睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosteroni)CNB-1CGMCC No.1028的菌懸液的製備方法為將睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosteroni)CNB-1CGMCC No.1028菌體重懸於質量百分濃度為0.9％NaCl溶液中。
4.根據權利要求1所述的生物修複方法，其特徵在於所述苜蓿種子萌發的條件為將苜蓿種子置於溼潤濾紙上，在30℃下暗培養。
5.根據權利要求1所述的生物修複方法，其特徵在於所述包被時間為50-70min。
6.根據權利要求1-5任一項所述的生物修複方法，其特徵在於所述對氯硝基苯類化合物為對氯硝基苯。
7.根據權利要求1-5任一項所述的生物修複方法，其特徵在於所述環境包括土壤環境和無土環境。
8.根據權利要求1-5任一項所述的生物修複方法，其特徵在於所述睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosteroni)CNB-1CGMCC No.1028菌的培養方法，包括以下步驟1)將睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosteroni)CNB-1 CGMCC No.1028接種於以對氯硝基苯為底物的無機鹽培養基中，在28-30℃下振蕩培養12-18h，得到種子液；所述無機鹽培養基配方為磷酸氫二鈉1.0g，磷酸二氫鉀0.5g，MgSO4·7H2O 0.03g，微量元素溶液5.0mL，對氯硝基苯200mg，用水定容至1000mL，pH6.8-7.2；所述微量元素溶液含EDTA 0.5g，ZnSO4·7H2O 0.22g，CaCl20.055g，MnCl2·4H2O 0.051g，FeSO4·7H2O 0.0499g，(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.011g，CuSO4·5H2O 0.0157g，CoCl2·6H2O 0.0161g，用水定容至1000mL，pH6.0；2)將步驟1)獲得的睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosteroni)CNB-1 CGMCCNo.1028的種子液接種於LB液體培養基中，在28-30℃下振蕩培養。
9.根據權利要求8所述的生物修複方法，其特徵在於所述步驟1)中無機鹽培養基的pH值為7.0；所述振速為130rpm。
10.根據權利要求8所述的生物修複方法，其特徵在於所述步驟2)中睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosteroni)CNB-1 CGMCC No.1028種子液的接種量為1-2％；振蕩培養條件為在30℃、130rpm下培養12-18h。
全文摘要
本發明公開了一種受對氯硝基苯類化合物汙染的環境的生物修複方法。該方法是將萌發出根芽的苜蓿種子浸泡於OD
文檔編號C12N1/20GK1803228SQ200610001778
公開日2006年7月19日 申請日期2006年1月25日 優先權日2006年1月25日
發明者劉雙江, 劉磊, 劉志培, 姜成英, 吳建峰 申請人:中國科學院微生物研究所