從粘質沙雷氏菌分離的s-腺苷甲硫氨酸合成酶基因序列及表達重組菌株的製作方法

2023-11-08 04:09:42 3

專利名稱：從粘質沙雷氏菌分離的s-腺苷甲硫氨酸合成酶基因序列及表達重組菌株的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術和酶工程領域，更具體地，本發明涉及一種粘質沙雷
氏菌(5"err^ia歷arcMce/7s)S-腺苷甲硫氨酸合成酶(metK)及其編碼基因， 以及表達metK酶的重組菌株。
背景技術：
群體感應(Quorum sensing)這個術語，是由Fuqua等1994年首先提出的。 其定義是當細菌的數量達到一定的密度(quorum)時才能發生的感應現象 (sensing)。當一個特定的環境中細菌的數量急劇增加時，由細菌所分泌的信 息分子的濃度也會相應的升高。通過擴散性信號小分子(又稱為自誘導物)與轉 錄活化蛋白的相互作用而打開與細胞群體密度有關的基因表達。這些信號分子 從細菌細胞擴散到環境中， 一旦達到一個臨界濃度(或者說達到某一特定的群 體密度)，這些信號分子就可誘導調節一系列目標基因的轉錄，從而在菌群範 圍內控制其行為。群體感應在細菌中廣泛存在，胞間交流可發生在細菌種內和
種間，細菌和其真核宿主間。在革蘭氏陰性菌中，自誘導物通常是f醯基高絲 氨酸內酯(AHLs)，它可調節的功能包括抗生素合成、毒性因子產生、胞外多 糖合成、細菌叢集、質粒結合轉移、生物膜形成、接合、孢子形成、生物發光 和穩定期進入等。
粘質沙雷氏菌能產生多種具工業應用潛力的物質，如殼質酶、蛋白酶、脂 酶、核酸酶、抗生素、表面活性劑等；並可發酵產生大量內消旋2,3-丁二醇， 靈菌紅素；可利用碳源廣，如單糖、蔗糖、甘油、纖維二糖等；是丙酮酸、琥 珀酸等有潛力的高產菌種；是兼性厭氧菌，在厭氧條件下，作為發酵工業菌株 具有節能優勢。Rob Van Houdt等人利用粘質沙雷氏菌MGl QS突變株，通過檢 測2，3-丁二醇的前體-乙偶姻，論證了 QS在2，3-丁二醇代謝合成中的生理作 用。結果表明，在邵71突變株中，2，3-丁二醇以及前體聯乙醯和乙偶姻產量 都會大大降低。當添加C4-HSL和3-oxo-C6-HSL時，突變株中三種化合物的產量水平能夠恢復到與野生型菌株一樣。突變株的發酵結果和突變株
比較一致。QS系統的失活導致了在指數生長末期和穩定期酸性化合物的不斷產 生，並且在利用糖發酵時，會引起早期生長停滯。Rice等人建立的在基本培養 基中添加葡萄糖和酪素考察生物膜變化的模型也說明了 QS系統對沙雷氏菌的 代謝調節功能。儘管QS系統調控2，3-丁二醇合成的精確機制還不清楚，但是 QS系統方面的工作對於研究細菌代謝將會有很重要的意義。
群體感應系統對粘質沙雷氏菌的次級代謝也具有重要的調控作用。很多沙 雷氏菌菌株產生靈菌紅素，靈菌紅素是一種次級代謝的紅色抗生素，它的生物 合成是由一個涉及高絲氨酸內酯群體感應系統和p&基因簇的複雜網絡調控， 同時，這個調控網絡至少有兩個單獨的雙組分信號轉導系統和大量的其它調節 因子。Sarah等人將5)^274的/7/g基因簇導入不產色素的粘質沙雷氏菌12 (5"歷a 12)中，結果5fej 12產生了紅色素，並且是受自身aHSL-QS和7i/; S系統的調 節。反過來將aHSL-QS調節基因座從5"歷a 12導入5"歷a 274發現，6)z/a 274表現 出由aHSL控制的一系列生理行為，包括紅色素的產生。QS調控系統、複合調 節網絡以及環境信號對靈菌紅素合成的影響被廣泛的研究。
在沙雷氏菌S 39006中，靈菌紅素和碳(雜)青黴烯是由以BHL和冊L為信 號分子的S/^I/R型的QS系統調控的，在沙雷氏菌SS-1中，靈菌紅素的合成、 核酸酶的分泌以及遊動性是由^p/7lR型的QS系統調節的。在不產生色素的MG1 菌株中，遊動性、蛋白酶的分泌和生物膜的形成受aHSL-QS控制。5"歷aluxS突 變株表現出了靈菌紅素產量減少、溶血和致病性降低，這都是由代謝缺陷引起 的，由此說明Zd/W在激活甲基循環中具有代謝功能。在S/ra 12 突變體 中，甲殼酶的分泌、細菌素的生成以及溶血活性都是由QS控制的。在S歷a 12 的調控體系中，S歷3R的作用有待進一步確認。 一些學者認為，5歷aR結合所有 它調節的基因的啟動子； 一些人則認為5歷aR依賴阻抑和aHSL型脫阻抑有關的 保守調節子發揮作用。這種調節蛋白具有保守的啟動子元件，在aHSL存在時， 5"歷sR能結合它，阻止轉錄。還有一些理論認為在QS系統控制下的多效調節子 調控靈菌紅素和碳(雜)青黴烯的合成，例如在菌株S 39006中，Rap受QS控制， 從而影響代謝。
儘管目前本領域對於粘質沙雷氏菌在工業上的用途有所了解，然而還需要 進一步清楚地研究其生理或代謝功能，找到一些對於調節生理或代謝有用的基 因。

發明內容
本發明的目的在於提供一種來自於粘質沙雷氏菌的s-腺苷甲硫氨酸合成
酶(MetK)及其編碼基因，含有所述編碼基因的載體以及含有所述載體的重組菌 株。
本發明的目的還在於提供一種從粘質沙雷氏菌的基因組中分離S-腺苷甲 硫氨酸合成酶編碼基因的方法。
在本發明的第一方面，提供一種分離的s-腺苷甲硫氨酸合成酶多肽，該多
肽選自下組
(a) 具有SEQ ID NO: 2胺基酸序列的多肽；
(b) 將SEQ ID N0:2胺基酸序列經過一個或多個胺基酸殘基的取代、缺失或
添加而形成的，且具有合成s-腺苷甲硫氨酸功能的多肽。
在另一優選例中，所述的S-腺苷甲硫氨酸合成酶的分子量為41850道爾頓。 在另一優選例中，所述的S-腺苷甲硫氨酸合成酶來源於粘質沙雷氏菌。 在另一優選例中，該多肽是具有SEQ ID NO: 2所示胺基酸序列的多肽。
在本發明的第二方面，提供一種分離的多核苷酸，它包含一核苷酸序列， 該核苷酸序列選自下組
(a) 編碼所述多肽的多核苷酸；
(b) 與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。
在另一優選例中，該多核苷酸編碼具有SEQ ID NO: 2所示胺基酸序列的多肽。
在另一優選例中，該多核苷酸具有SEQ ID NO: l所示的序列。 在本發明的第三方面，提供一種載體，它含有所述的多核苷酸。 在本發明的第四方面，提供一種遺傳工程化的宿主細胞，它含有所述的載體。
在本發明的第五方面，提供所述的多肽的製備方法，該方法包含 (a)在適合表達的條件下，培養所述的宿主細胞；(b)從培養物中分離出S-腺苷甲硫氨酸合成酶多肽。
在本發明的第六方面，提供一種從粘質沙雷氏菌基因組中分離s-腺苷甲硫
氨酸合成酶的編碼基因的方法，所述的方法包括
(1) 用限制性內切酶HindIII消化粘質沙雷氏菌基因組DNA，從消化產物中 分離3-5kb的DNA片段，並使這些DNA片段自身環化連接，形成自身環化分子；
(2) 以步驟(l)獲得的自身環化分子為模板，以SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 6所示序列的引物進行PCR擴增，收集分子量約1155士50bp的擴增產物；
(2)對步驟(2)獲得的擴增產物進行測序驗證，獲得含有完整閱讀框的
基因，即為s-腺苷甲硫氨酸合成酶的編碼基因。
在另一優選例中，在步驟(1)中，自身環化連接的溫度是12'C。
本發明的其它方面由於本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而 易見的。


圖1顯示了利用簡併引物擴增的Met基因的部分片段，泳道M為標準DNA 分子量，自上向下的條帶分別為(kb): 2， 1， 0.75， 0.5， 0.25， 0.1。
圖2顯示了鵬"基因的反向PCR擴增片段的瓊脂糖凝膠電泳，其中泳道 CK為陰性對照；泳道M為標準DNA分子量，自上向下的條帶分別為(kb): 23. 13， 9.416， 6.557， 4.361， 2.322， 2.027， 0.564， 0.125。
圖3顯示了歷etvf基因的Southern Blot鑑定。
圖4顯示了歷e"結構基因擴增片段的瓊脂糖凝膠電泳；泳道M為標準DNA 分子量，自上向下的條帶分別為(kb): 2， 1， 0.75， 0.5， 0.25， 0.1。 圖5顯示了重組質粒pETmetK的圖譜。
圖6顯示了重組質粒pETmetK雙酶切鑑定的瓊脂糖凝膠電泳；M為標準DNA 分子量，自上向下的條帶分別為(kb): 2， 1， 0.75， 0.5， 0.25， 0.1。
圖7顯示了 ￡ co// BL21(DE3)/pETmetK誘導表達後的全菌體SDS-PAGE電 泳圖；泳道M為標準蛋白分子量，自上向下的條帶分別為(kDa): 94.0， 66.2， 45.0， 35.0， 24.0， 20.0， 14.4。
具體實施例方式
本發明人經過長期的研究和反覆的試驗，首次從粘質沙雷氏菌中分離獲得 一種S-腺苷甲硫氨酸合成酶(MetK)基因，經鑑定MetK是粘質沙雷氏菌QS系統 關鍵酶。該MetK酶的獲得通過設計特殊的引物，通過對粘質沙雷氏菌基因組 DNA進行特殊的處理，以及通過常規PCR和反向PCR相結合的方法而克隆獲得。 在此基礎上完成了本發明。
更具體的，本發明的提供了一種從粘質沙雷氏菌中分離的MetK酶及其結 構基因、重組質粒和轉化重組菌體。同時本發明提供了一種方法，即通過分子 生物學手段，將本發明涉及的酶基因克隆到其他受體菌，由其他菌株或在其他 培養條件下產生本發明涉及的MetK酶。
本發明的S-腺苷甲硫氨酸合成酶的編碼基因是從粘質沙雷氏菌中分離獲 得的，分離方法如下
(1) 用限制性內切酶HindIII消化粘質沙雷氏菌基因組DNA，從消化產物中 分離3-5kb的DNA片段，並使這些DNA片段自身環化連接，形成自身環化分子；
(2) 以步驟(l)獲得的自身環化分子為模板，以SEQIDN0: 5和SEQ ID NO: 6所示序列的引物進行PCR擴增，收集分子量約1155土50bp的擴增產物；
(2)對步驟(2)獲得的擴增產物進行測序驗證，獲得含有完整閱讀框的 基因，即為S-腺苷甲硫氨酸合成酶的編碼基因。
在上述方法中，限制性內切酶的選擇是重要的，本發明人發現，選擇 HindIII酶以外的其它限制性內切酶消化粘質沙雷氏菌基因組DNA無法獲得量 較多的3-5kb的DNA片段，獲得從酶切產物中無法良好地擴增獲得S-腺苷甲硫 氨酸合成酶。
並且，在酶切後，將自身環化連接的溫度設置為12°C，該溫度可獲得連接 較好的自身環化分子，用於後續作為PCR擴增的模板。而採用常規的連接溫度 如16"C，自身環化連接的效果不夠理想。
上述方法中，採用SEQIDNO: 5和SEQ ID NO: 6所示序列的引物進行PCR 擴增，該PCR擴增為反向PCR擴增。
在本發明的實施例中，本發明人利用PCR技術(反向PCR和普通PCR)和分 子雜交相結合的方法成功克隆了粘質沙雷氏菌QS系統關鍵酶基因i/etf，同時
8利用pET28a")表達載體，表達分析了這一個基因，蛋白分子量的大小與預測的 分子量基本一致。^e"關鍵酶基因的克隆為深入研究QS調控系統遺傳特點以 及研究QS系統在代謝中的功能奠定了基礎。
如本文所用，"分離的"是指物質從其原始環境中分離出來(如果是天然 的物質，原始環境即是天然環境)。如活體細胞內的天然狀態下的多聚核苷酸 和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態中同存在 的其他物質中分開，則為分離純化的。
如本文所用，"分離的s-腺苷甲硫氨酸合成酶蛋白或多肽"是指s-腺苷甲
硫氨酸合成酶多肽基本上不含天然與其相關的其它蛋白、脂類、糖類或其它物
質。本領域的技術人員能用標準的蛋白質純化技術純化s-腺苷甲硫氮酸合成酶
蛋白。基本上純的多肽在非還原聚丙烯醯胺凝膠上能產生單一的主帶。s-腺苷 甲硫氨酸合成酶多肽的純度能用胺基酸序列分析。
本發明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優選重組多肽。本 發明的多肽可以是天然純化的產物，或是化學合成的產物，或使用重組技術從 原核或真核宿主(例如，細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞)中產生。 根據重組生產方案所用的宿主，本發明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖 基化的。本發明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。
在本發明中，"S-腺苷甲硫氨酸合成酶保守性變異多肽"指與SEQ ID NO: 2的胺基酸序列相比，有至多3個，較佳地至多2個，更佳地至多l個胺基酸被性 質相似或相近的胺基酸所替換而形成的多肽。
本發明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組 DNA或人工合成的DNA。 DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編 碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區序列可以與SEQ ID NO: l所示的編碼區序列相同 或者是簡併的變異體。如本文所用，"簡併的變異體"在本發明中是指編碼具 有SEQ ID NO: 2的蛋白質，但與SEQ ID NO: l所示的編碼區序列有差別的核酸 序列。
編碼SEQ ID NO: 2的成熟多肽的多核苷酸包括只編碼成熟多肽的編碼序 列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選 的附加編碼序列)以及非編碼序列。術語"編碼多肽的多核苷酸"可以是包括編碼此多肽的多核苷酸，也可以 是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發明有相同的胺基酸序 列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發 生的等位變異體或非天然發生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、 缺失變異體和插入變異體。如本領域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替 換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質上改 變其編碼的多肽的功能。
本發明還涉及與上述的序列雜交且兩個序列之間具有至少50%，較佳地至
少70%，更佳地至少80%相同性的多核苷酸。本發明特別涉及在嚴格條件下與本
發明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發明中，"嚴格條件"是指(1)
在較低離子強度和較高溫度下的雜交和洗脫，如O. 2XSSC， 0. 1%SDS， 60°C;或 (2)雜交時加有變性劑，如50呢(v/v)甲醯胺,0. 1%小牛血清/0. 1% Ficoll， 42 。C等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在90%以上，更好是95%以上時才發 生雜交。並且，可雜交的多核苷酸編碼的多肽與SEQ ID NO: 2所示的成熟多肽 有相同的生物學功能和活性。
本發明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段。如本文所用，"核酸片段" 的長度至少含15個核苷酸，較好是至少30個核苷酸，更好是至少50個核苷酸， 最好是至少100個核苷酸以上。核酸片段可用於核酸的擴增技術(如PCR)以確定
和/或分離編碼s-腺苷甲硫氨酸合成酶的多聚核苷酸。
本發明中的多肽和多核苷酸優選以分離的形式提供，更佳地被純化至均質。
本發明的S-腺苷甲硫氨酸合成酶核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR 擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對於PCR擴增法，可根據本發明所公 開的有關核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，並用市售的cDNA庫 或按本領域技術人員已知的常規方法所製備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關 序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然後再將各次擴增 出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通 常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然後通過常規方法從增殖後的宿主細胞中 分離得到有關序列。此外，還可用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。 通常，通過先合成多個小片段，然後再進行連接可獲得序列很長的片段。
目前，己經可以完全通過化學合成來得到編碼本發明蛋白(或其片段，或 其衍生物)的DNA序列。然後可將該DNA序列引入本領域中已知的各種現有的DNA
分子(或如載體)和細胞中。此外，還可通過化學合成將突變引入本發明蛋白序 列中。
應用PCR技術擴增DNA/RNA的方法(Saiki， et al. Science 1985; 230: 1350-1354)被優選用於獲得本發明的基因。特別是很難從文庫中得到全長的 cDNA時，可優選使用RACE法(RACE-cDNA末端快速擴增法)，用於PCR的引物可根
據本文所公開的本發明的序列信息適當地選擇，並可用常規方法合成。可用常 規方法如通過凝膠電泳分離和純化擴增的DNA/RNA片段。
本發明也涉及包含本發明的多核苷酸的載體，以及用本發明的載體或S-腺 苷甲硫氨酸合成酶編碼序列經基因工程產生的宿主細胞，以及經重組技術產生 本發明所述多肽的方法。
通過常規的重組DNA技術(Science, 1984; 224: 1431)，可利用本發明的 多聚核苷酸序列可用來表達或生產重組的S-腺苷甲硫氨酸合成酶。 一般來說有 以下步驟
(1) .用本發明的編碼S-腺苷甲硫氨酸合成酶的多核苷酸，或用含有該多核 苷酸的重組表達載體轉化或轉導合適的宿主細胞；
(2) .在合適的培養基中培養的宿主細胞；
(3) .從培養基或細胞中分離、純化蛋白質。
本發明中，S-腺苷甲硫氨酸合成酶多核苷酸序列可插入到重組表達載體 中。術語"重組表達載體"指本領域熟知的細菌質粒、噬菌體、酵母質粒、植 物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒如腺病毒、逆轉錄病毒或其他載體。在本發明 中適用的載體包括但不限於在細菌中表達的基於T7的表達載體(Rosenberg, et al. Gene, 1987, 56: 125);在哺乳動物細胞中表達的pMSXND表達載體(Lee and Nathans, J Bio Chem. 263: 3521, 1988)和在昆蟲細胞中表達的來源於杆 狀病毒的載體。總之，只要能在宿主體內複製和穩定，任何質粒和載體都可以 用。表達載體的一個重要特徵是通常含有複製起點、啟動子、標記基因和翻譯 控制元件。
本領域的技術人員熟知的方法能用於構建含S-腺苷甲硫氨酸合成酶編碼
11DNA序列和合適的轉錄/翻譯控制信號的表達載體。這些方法包括體外重組DNA 技術、DNA合成技術、體內重組技術等(Sambroook， et al. Molecular Cloning, a Laboratory Manual, cold Spring Harbor Laboratory. New York, 1989)。 所述的DNA序列可有效連接到表達載體中的適當啟動子上，以指導mRNA合成。 這些啟動子的代表性例子有大腸桿菌的lac或trp啟動子；入噬菌體PL啟動子； 真核啟動子包括CMV立即早期啟動子、HSV胸苷激酶啟動子、早期和晚期SV40啟 動子、反轉錄病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核細胞或其 病毒中表達的啟動子。表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結合位點和轉錄終 止子。
此外，表達載體優選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用於選擇 轉化的宿主細胞的表型性狀，如真核細胞培養用的二氫葉酸還原酶、新黴素抗 性，或用於大腸桿菌的四環素或氨苄青黴素抗性。
包含上述的適當DNA序列以及適當啟動子或者控制序列的載體，可以用於 轉化適當的宿主細胞，以使其能夠表達蛋白質。
宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞； 或是高等真核細胞，如哺乳動物細胞。原核細胞的代表性例子如大腸桿菌。
作為本發明的最優選方式，提供了一種轉化重組大腸桿菌BL21/pETmetK， 該重組大腸桿菌含重組質粒pETmetK，插入的該質粒DNA片段的大小為6. 4kb， 該質粒pETmetK中含有序列表中SEQ ID NO: 1所示的DNA序列。利用該重組
大腸桿菌可良好地表達s-腺苷甲硫氨酸合成酶。
重組DNA轉化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規技術進行。當宿主 為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態細胞可在指數生長期後收穫， 用CaCl2法處理，所用的步驟在本領域眾所周知。另一種方法是使用MgCh。如 果需要，轉化也可用電穿孔的方法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的函A 轉染方法磷酸鈣共沉澱法，常規機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質體包裝 等。
獲得的轉化子可以用常規方法培養，表達本發明的基因所編碼的多肽。根 據所用的宿主細胞，培養中所用的培養基可選自各種常規培養基。在適於宿主 細胞生長的條件下進行培養。當宿主細胞生長到適當的細胞密度後，用合適的 方法(如溫度轉換或化學誘導)誘導選擇的啟動子，將細胞再培養一段時間。
在上面的方法中的重組多肽可在細胞內、或在細胞膜上表達、或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學的和其它特性通過各種分離方法分離 和純化重組的蛋白。這些方法是本領域技術人員所熟知的。這些方法的例子包 括但並不限於常規的復性處理、用蛋白沉澱劑處理(鹽析方法)、離心、滲透 破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、 高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術及這些方法的結合。
在本發明的一個實例中，提供了一種分離的多核苷酸，它編碼具有SEQID NO: 2所示胺基酸序列的多肽。本發明的多核苷酸是從粘質沙雷氏菌中分離出 的。其序列如SEQIDNO: 1所示，它包含的多核苷酸序列全長為1155個鹼基， 編碼全長為384個胺基酸的S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SEQ ID N0: 2)，該重組酶 的分子量為41850道爾頓。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說 明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方 法，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室指南(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照製造廠 商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。
除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟 悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用於 本發明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示範之用。
實施例l粘質沙雷氏菌基因組DNA的提取
按照生產商提供的使用說明書，用Genomic DNA Purification Kit (Biodev， 北京)抽提處於對數生長期的粘質沙雷氏菌H30(購自ATCC)的基因組DNA，並 用0. 8%瓊脂糖凝膠電泳對獲得的細菌基因組進行檢測。
實施例2 MetK酶基因的克隆和重組菌構建
1、簡併引物擴增
根據已報導其它種類的細菌///e"基因的序列，運用Genefisher軟體設計 簡併弓l物/z;et/i7禾口歷"￡ ，引物序列為(其中，N=A/T/G/C， Y=C/T， D=A/G/T， R=A/G):
歷etA7: 5， 一AACAAAATCCATGGCATCGAYRCNGTNGT—3， (SEQ ID NO: 3);禾口歷eZ^麼5' -TGCCGCCATAGGTATCCACDATDATYT丁-3'(SEQ ID NO: 4); 以實施例1獲得的粘質沙雷氏菌的基因組DNA為模板，擴增沙雷氏菌基因 片段。
PCR擴增體系為基因組DNA2u 1，引物歷e^7和歷ez^ 各2u 1，dNTP2u 1， 10X7"ag緩衝液5ul， TAKARA Tag聚合酶lul， ddH20 38 ul。
PCR反應程序為95°C預變性5min， 94°C變性30s， 59°C退火30s， 72°C延伸30s，循環30次，72。C延伸lOmin。
將擴增條帶切膠後用博大泰克公司柱式割膠回收試劑盒回收，連接於 TaKaRa公司pMD-T載體上並轉化大腸桿菌DH5 a 。通過在氨苄青黴素LB平板 上進行藍白斑篩選結合菌落PCR擴增，鑑定出陽性克隆，並在上海英駿生物技 術公司進行序列測定。測序之後，設計反向PCR所需特異引物metK3和metK4: 5， —CAGCGAGATGTCTTCTGAGTGC-3，(SEQ ID NO: 5);禾口
歷"昆5， -TGGCTGACGGCGGGCACCAAAT-3，(SEQ ID NO: 6)。
2、 粘質沙雷氏菌基因組DNA的酶切
取10 u L基因組DNA用限制性內切酶#i/7d III消化12h後，用0. 8%瓊脂 糖凝膠對消化後細菌基因組進行電泳分離，用割膠回收試劑盒回收大小在3-5 kb的片段，溶解於無菌水中。
3、 酶切片段的自身環化
取8"L回收的基因組DNA片段，用TaKaRa自身環化連接試劑盒進行自身 環化連接反應。連接酶切片段時，注意反應條件要有利於形成自身環化分子。 反應體系為8uLDNA片段，lwL連接緩衝液，1PL連接酶；在12。C條件下 連接過夜，低於常規的連接溫度16"C。
4、 反向PCR擴增
用博大泰克公司DNA清潔試劑盒對連接反應液進行清潔處理，並將DNA洗 脫到20n L無菌的去離子水中，然後利用引物metK3和metK4進行反向PCR。
反向PCR擴增體系為基因組DNA2ul，弓|物歷etvf/和歷efy^各2u 1， dNTP 2ul， 10X7i^緩衝液5ul， TAKARA Tag聚合酶ddH20 38 ul。
反向PCR反應程序為95°C預變性5min， 94°C變性30s, 58°C退火30s，72°C延伸5min，循環30次，72°C延伸10min。
5、 反向PCR擴增產物的Southern雜交鑑定
為了確保反向PCR擴增產物含有核心區，在測序之前對反向PCR擴增產物 的特異性先進行鑑定，將反向PCR擴增產物在0.8y。瓊脂糖凝膠上電泳。隨後參 照Amersham Pharmacia的《分子克隆》第二版(科學出版社出版時間 1999. 10.01)進行凝膠的變性、中和、轉膜及雜交鑑定。
6、 反向PCR擴增產物的測序
再次電泳分離反向PCR產物後，根據Southern雜交鑑定成陽性的條帶的 大小，切膠後，用博大泰克公司柱式割膠回收試劑盒回收，連接於TaKaRa公 司pMD-T載體上並轉化大腸桿菌DH5 a 。通過在氨苄青黴素LB平板上進行藍白 斑篩選結合菌落PCR擴增，鑑定出陽性克隆，並在上海英駿生物技術公司進行 序列測定。將測得全長序列在GenBank資料庫中進行分析，並藉助NCBI的ORF Finder程序(http:〃爾.ncbi. nlm. nih. gov/gorf/gorf. html)確定其中的完 整閱讀框，同時設計結構基因引物FpEXmetKl和RpEXmetK2:
FpEXmetKh 5， -GGAATTCCATATGATGGCTAAACACCTCTTCACG-3， (SEQIDN0: 7);和
RpEXmetK2: 5, -CCCAAGCTTTCGGGGCTTATTTCAGGC-3，(SEQ ID NO: 8)。
7、 /z/e"基因的表達
利用pET28a(+)質粒(Novagen)，構建表達載體，表達目的基因，進一步確 認克隆基因的正確性。
7. "結構基因的擴增
根據反向PCR擴增產物序列的拼接結果，設計FpEXmetKl和RpEXmetK2表 達引物。以基因組DNA為模板，擴增出歷e"的完整結構基因。
PCR擴增體系為基因組DNA 2u 1,引物FpEXmetKl和RpEXmetK2各1， dNTP 2ixl， 10X7ag緩衝液5ul， TAKARA Tag聚合酶lul， ddH20 38 ul。
PCR反應程序為95°C預變性5min， 94°C變性30s， 57°C退火30s， 72°C延伸75s，循環30次，72°C延伸lOmin。
15並用DNA清潔試劑盒對擴增產物進行清潔處理。 7.2限制性酶切反應，純化及連接反應
經純化後的PCR產物，用預先設計在引物序列中酶切位點所對應的酶進行 酶切反應。本實驗中，所用的酶是A^el和氾/7d III。酶切體系為PCR產物或 質粒溶液20 ul， Wellul，歷'77dlIIlul， IOX緩衝液3ul， ddH20 5 ul， 總體積30 u 1。
由於所選用的兩個酶切位點在pET28a(+'空質粒上相距很近(約30bp)，因 此，酶切之後的PCR產物和質粒載體只需經過PCR清潔試劑盒即可達到純化的 目的。
經酶切純化後的PCR產物和質粒載體，可以用於連接反應。連接反應體系 為酶切純化的PCR產物lOu 1，酶切純化的質粒3til，T4連接酶lul，10X 連接酶緩衝液2ul， ddH20 4 "1。連接後獲得重組質粒pETmetK，其主要結 構如圖5所示。
7. 3質粒製備與轉化
質粒抽提採用質粒提取試劑盒製備，參照生產商的說明書進行操作。 質粒轉化細胞使用氯化鈣法。具體操作如下
7.3.1大腸桿菌感受態細胞的製備
(1) 從新鮮的大腸桿菌培養平板上接種一單菌落於5ml LB液體培養基， 37X培養過夜。
(2) 按0. 5-1%的比例轉接於100ml LB液體培養基，37T培養2-4個小時， 當菌液0D,約為0.3。
(3) 將菌液轉移到預冷的50ml離心管中，冰浴30分鐘，4000rpm離心 10分鐘。
(4) 去上清，沉澱懸浮於5ml預冷的0. 1M的CaCl2溶液中，冰浴15分鐘， 4000rpm離心10分鐘。
(5) 去上清，沉澱懸浮於2ml預冷的0. 1M的CaCl2溶液中，冰浴10分鐘， 4000rpm離心10分鐘。
(6) 去上清，沉澱懸浮於lml預冷的0. 1M的CaCl2溶液中，加入高壓滅菌的甘油至終濃度15%。
(7)取200 u 1分裝於1.5ml tip管中，於-70。C保存，備用。
7. 3. 2重組質粒pETmetK的轉化
(1) 取0. 1-1 g重組質粒pETmetK DNA於200u 1感受態細胞中，冰浴 30分鐘。
(2) 42°C水浴熱激90秒，快速置於冰上1-3分鐘。
(3) 加入新鮮LB液體培養基800u 1,於37。C振蕩培養45分鐘。
(4) 取200y 1菌液塗布於選擇性LB固體培養基表面。37°C培養12-16 個小時至單菌落出現。
7.3.3重組子的鑑定
將陽性菌落接種於含有卡那黴素(50mg/L)的LB液體培養基中進行培養並 提取質粒，按照"7.2限制性酶切反應，純化及連接反應"中的酶切體系和條 件用Ndel和氾/^ III重組質粒進行雙酶切鑑定，酶切產物進行瓊脂糖凝膠電 泳，結果見圖6，說明獲得的重組質粒是正確的。
經電泳結果證實，該陽性克隆菌落有DNA片段插入質粒pETmetK，含此重 組質粒pETmetK的重組大腸桿菌，即為轉化的重組大腸桿菌BL21/pETmetK。測 序結果顯示插入片段含有一個長H55bp的開放閱讀框架。
本發明的重組大腸桿菌BL21/pETmetK可用於研究MetK基因的功能，以及 對QS系統合成信號分子的調控作用。同時也是研究QS系統調控微生物代謝的 重要工程菌。
實施例3 MetK酶的誘導表達
本發明的重組大腸桿菌BL21/pETmetK表達的條件為37°C培養，IPTG誘 導；獲得的重組菌￡ cWiBL21(DE3)/pETmetK的菌體懸於磷酸緩衝液(pH7)中， 利用超聲波破碎細胞，離心上清液為可溶性目標蛋白。
將重組大腸桿菌BL21/pETmetK接種於添加適當抗生素的LB液體培養基中 (LB培養基組成為酵母粉O. 5%、胰蛋白腖1%、 NaCl 1%， pH7. 0) ， 37'C搖床 培養過夜；再以5%的接種量轉接到裝有30mLLB培養基的250 mL搖瓶中，37°C 搖床培養4小時，加入IPTG誘導(終濃度lmM)，然後繼續培養6小時後，離心收集菌體。將收集的菌體進行全菌SDS-PAGE電泳，結果如圖7所示，表明基 因工程菌表達出了 MetK，圖中泳道M為標準蛋白分子量(自上向下的條帶分別 為97.4, 66.2， 43， 31， 20.1， 14. 4 kDa)。在43kD左右出現了一條明顯的蛋 白條帶，酶已成功表達。
經驗證，所獲得的MetK酶具有良好的合成S-腺苷甲硫氨酸的功能，酶活 性很高。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻 被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，
本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申 請所附權利要求書所限定的範圍。序列表
<110〉 華東理工大學
從粘質沙雷氏菌分離的S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因序列及表達重組菌株
<130〉 076397
<160〉 8
<170〉 Patentln version 3. 3
<210〉 1
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<400〉 8
cccaagcttt cggggcttat ttcaggc 2權利要求
1. 一種分離的S-腺苷甲硫氨酸合成酶多肽，其特徵在於，該多肽選自下組(a)具有SEQ ID NO2胺基酸序列的多肽；(b)將SEQ ID NO2胺基酸序列經過一個或多個胺基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有合成S-腺苷甲硫氨酸功能的多肽。
2. 如權利要求l所述的多肽，其特徵在於，該多肽是具有SEQ ID NO: 2所 示胺基酸序列的多肽。
3. —種分離的多核苷酸，其特徵在於，它包含一核苷酸序列，該核苷酸 序列選自下組(a) 編碼如權利要求l所述多肽的多核苷酸；(b) 與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。
4. 如權利要求3所述的多核苷酸，其特徵在於，該多核苷酸編碼具有SEQID N0: 2所示胺基酸序列的多肽。
5. 如權利要求3所述的多核苷酸，其特徵在於，該多核苷酸具有SEQIDNO: l所示的序列。
6. —種載體，其特徵在於，它含有權利要求3所述的多核苷酸。
7. —種遺傳工程化的宿主細胞，其特徵在於，它含有權利要求6所述的載體。
8. 權利要求l所述的多肽的製備方法，其特徵在於，該方法包含(a) 在適合表達的條件下，培養權利要求7所述的宿主細胞；(b) 從培養物中分離出s-腺苷甲硫氨酸合成酶多肽。
9. 一種從粘質沙雷氏菌基因組中分離S-腺苷甲硫氨酸合成酶的編碼基因 的方法，其特徵在於，所述的方法包括(1) 用限制性內切酶HindIII消化粘質沙雷氏菌基因組DNA,從消化產物中 分離3-5kb的DNA片段，並使這些DNA片段自身環化連接，形成自身環化分子；(2) 以步驟(l)獲得的自身環化分子為模板，以SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 6所示序列的引物進行PCR擴增，收集分子量約1155土50bp的擴增產物；(2)對步驟(2)獲得的擴增產物進行測序驗證，獲得含有完整閱讀框的基因，即為s-腺苷甲硫氨酸合成酶的編碼基因。
10.如權利要求9所述的方法，其特徵在於，在步驟(1)中，自身環化連 接的溫度是12'C。
全文摘要
本發明屬於生物技術和酶工程領域，公開了一種從粘質沙雷氏菌分離的S-腺苷甲硫氨酸合成酶多肽，該多肽是具有SEQ ID NO2胺基酸序列的多肽或將SEQ ID NO2胺基酸序列經過一個或多個胺基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有合成S-腺苷甲硫氨酸功能的多肽。本發明還公開了所述酶的編碼基因，含有所述編碼基因的載體，以及含有所述載體的宿主細胞。本發明還公開了從粘質沙雷氏菌中分離S-腺苷甲硫氨酸合成酶編碼基因的方法。
文檔編號C12N9/00GK101429498SQ20071004801
公開日2009年5月13日 申請日期2007年11月9日 優先權日2007年11月9日
發明者周文瑜, 孫建安, 張燎原, 虎 朱, 楊雲龍, 沈亞領, 昱 邱, 魏東芝 申請人:華東理工大學