一種表達重組對蝦肽Pen24的基因工程菌株及應用的製作方法

2023-11-12 05:32:32

專利名稱：一種表達重組對蝦肽Pen24的基因工程菌株及應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於基因工程技術領域，更屬於一種表達重組對蝦肽Pen24的基因工程菌株，更具體涉及含有對蝦肽基因的基因工程菌株E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)，對蝦肽相關的重組對蝦肽Pen24，重組對蝦肽Pen24對革蘭氏陽性細菌、革蘭氏陰性細菌、真菌、病毒均具有明顯的抗生物活性。還涉及基因工程菌株的製備方法，同時，還涉及重組基因工程蛋白質Pen24在預防和治療動物和植物的細菌、真菌和病毒病中的應用，以及作為防腐劑在化妝品、食品和飼料等領域中的用途。
背景技術：
抗菌肽是宿主免疫防禦系統的重要組成部分，也是機體理想的第一道防線。Boman G等最先通過注射陰溝桿菌及大腸桿菌誘導惜古比天蠶蛹產生具有抗菌活性的多肽，即cecropins[Boman H G et al.，1987]。此後科學家們在哺乳動物、被囊動物(tunicate)、兩棲動物、昆蟲、魚類、鳥類和植物等多種生物體中發現並分離獲得了約300種內源性抗菌肽。
抗菌肽是生物體抵禦外源性病原微生物的入侵而產生的一類小分子多肽，能對抗外界病原體的感染。抗菌肽是由細菌特定基因編碼產生的一類小分子多肽，具有廣譜抗菌性，尤其對耐藥菌株有明顯的殺滅作用，且不破壞生物體細胞，無免疫原性[Michael C et al.，2003]。如果蠅中的andropin、drosocin，蜜蜂中的apidaecin、abaecin，狼蛛的acanthoscurrin等。兩棲動物它們的皮膚能夠分泌大量的抗菌肽類物質，其含量非常高。如研究最廣泛的magaininsm、源於南美蛙的dermasep tin、來自樹蛙的bombininh以及日本蛙的melittin相關肽等。在海洋生物中發現與抗菌肽相關的肽類物質，海兔的dolabellanin。哺乳動物中，抗菌肽在吞噬細胞和黏膜上皮細胞表達，目前已發現防禦素和cathelicidins家族為代表的大量的抗菌活性肽。
抗菌肽除了抗菌活性外，同時還具有多種其他的調控功能。哺乳動物防禦素主要有α-防禦素和β-防禦素兩種，具有廣泛的抗革蘭氏陰性細菌和革蘭氏陽性細菌、真菌和一些具包膜病毒的活性。從大鼠附睪頭部上皮細胞中成功地克隆到一個特異表達的新基因，並觀察到這個基因所編碼的多肽具有抗菌功能，並可能與生育有關[張永蓮等，2002]。
抗菌肽抗菌廣譜，對病毒、寄生蟲、癌細胞均有抑制作用。哺乳動物抗菌肽具有保守的多個半胱氨酸，能形成幾個穩定的二硫鍵，具有十分廣泛的抗菌譜，除抗細菌、真菌、病毒外，還對支原體、衣原體、螺旋體及一些活性細胞(如腫瘤細胞)有殺滅作用。cecropin P1是一種哺乳動物抗菌肽，對G-菌及一些G+菌有抑制殺滅作用。抗菌肽高度保守的胺基酸殘基是一些抗菌肽分子具有抗菌活性所不可缺少的，另外一些天然抗菌肽的C端往往是醯胺化的，這與抗菌肽的廣譜抗菌活性有關。
一般地，大多數抗菌肽由30多個胺基酸殘基組成，C端富含丙氨酸、甘氨酸、纈氨酸等非極性胺基酸，N端富含精氨酸和賴氨酸等陽離子型胺基酸，中間部分富含脯氨酸[Daniel M L et al.，2003；Harder J et al.，2001]。在許多特定位置都有一些較保守的胺基酸殘基。大多數抗菌肽具有α-螺旋或者β-摺疊結構，有些同時包含這兩種結構。ceceopin P1是由31個胺基酸組成的多肽，分子量約為3ku，不含半胱氨酸，不能形成分子內二硫鍵，其分子內含有兩親性α-螺旋，中間是形成柔性彎曲的穀氨酸-甘氨酸(Glu-Gly)捲曲序列，與昆蟲cecropin IA有64％相似性，與cecropin B有75％的相似性。
抗菌肽被認為是魚、蝦、貝等防禦系統的主要成分之一。Chisholm等研究證明甲殼動物的血細胞溶胞上清液含有能殺滅細菌的因子[Chisholm J R S etal.，1995]；Pierce等從鱟血細胞中分離到的抗菌肽[Pierce J C et al.，1997]；Schnapp等從青蟹的血細胞中分離到3種具有殺菌作用的肽[Schnapp D et al.，1996]。至今，已在南美白對蝦、南美藍對蝦、印度對蝦、中國對蝦和斑節對蝦等體內發現多種抗菌肽。
Penaeidin家族是陽離子抗菌肽，COOH-端含有6個半胱氨酸，形成3個二硫鍵，NH2-端富含脯氨酸。Penaeidin前體N端具有保守性很強的信號肽，經加工獲得成熟肽。Penaeidin成熟肽有翻譯後修飾的特性，或者C端醯氨化，或者N端通過焦穀氨酸環化。
抗菌肽的天然產量有限，國內外學者通過化學合成獲得抗菌肽。但是，化學合成法步驟複雜、產量低、成本較高。目前國內外學者在研究抗菌肽一級結構的基礎上，採用分子生物學和基因工程技術方法在原核細胞、真核細胞或某些藻類中表達抗菌肽，並且獲得了抗菌肽轉基因的動植物。大腸桿菌為革蘭氏陰性細菌，遺傳背景清楚，有大量可用於克隆和表達外源性基因的菌株，並且易被大規模培養。但是，由於抗菌肽對大腸桿菌的毒性或殺菌作用，所以大腸桿菌不適宜用於表達抗菌肽，但也有少數成功的例子。邱定紅選擇自然界活性最強的天蠶素類抗菌肽B(CB)cDNA與人幹擾素A1(h IFN A1)cDNA融合，構建原核表達載體pBV-20的融合表達質粒pBV-20-hIFN A1-CB(pHC)，轉導入大腸桿菌E.coli JMB菌株，溫控誘導後表達純化了的融合蛋白hIFN A1-CB[邱定紅等，2002]。通過基因工程技術生產抗菌肽，實現抗菌肽批量生產具有重要的意義，將有希望使抗菌肽成為抑制和殺滅主要病原體、特別是耐藥菌的新型藥物。

發明內容
本發明的目的是在於提供一種表達重組對蝦肽Pen24的基因工程菌株。重組對蝦肽Pen24對蝦肽具有廣譜抗菌作用，對革蘭氏陽性細菌和革蘭氏陰性細菌均具有明顯的抑菌活性；對氨苄青黴素不敏感的強致病性細菌，如枯草芽孢桿菌、蘇雲金芽孢桿菌和綠膿桿菌等有很好的抗菌活性。同時，重組對蝦肽Pen24對抗氨苄青黴素的大腸桿菌具有抑菌活性。重組對蝦肽Pen24對昆蟲核型多角體病毒(包括家蠶核型多角體病毒、苜宿銀紋夜蛾核型多角體病毒、棉鈴蟲核型多角體病毒、甜菜夜蛾核型多角體病毒等)、對蝦白斑綜合症病毒(簡稱WSSV)的感染均具有明顯的抗病毒活性。基因工程重組對蝦肽Pen24可廣泛應用於動物和植物的細菌、真菌和病毒病的預防和治療，以及作為防腐劑應用於化妝品、食品和飼料等領域。
由於傳統抗生素的應用帶來的耐藥性、藥物殘留等問題，對抗生素肽的研究開發已成為世界上研究抗生素新產品的前沿性課題。抗菌肽與傳統的抗生素相比具有分子量小、抗菌譜廣、熱穩定性好、抗菌機理獨特等優點，具有抗細菌、黴菌、病毒、原蟲、癌細胞、螺旋體等多種活性，且不易產生耐藥性。利用抗菌肽替代傳統抗生素，作為新一代的抗菌藥來源，對提高畜產品品質，推動綠色生物科技的發展具有非常重要的意義和廣闊的應用前景。
本發明的目的是在於提供一種含有南美白對蝦Penaeidin-2基因的重組基因工程大腸桿菌菌株，其特徵在於該菌株是一種高效表達重組對蝦肽Pen24的基因工程菌株E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)，該菌株株於2006年1月15日保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NoM206003，含有插入了南美白對蝦Penaeidin-2表達盒的重組表達質粒，或者包含編碼本發明所述的基因工程重組對蝦肽Pen24的DNA片斷。利用該基因工程菌株E.coliOrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)，可表達基因工程重組對蝦肽Pen24。
本發明的目的是在於提供一種大腸桿菌宿主細胞的構建方法，方法簡便，操作方便，該宿主細胞包含重組對蝦肽Pen24的核苷酸序列。表達量高，基因工程蛋白的表達量最高可以達到菌體蛋白總量的20％，融合表達，安全性高，利於產業化生產。
本發明的目的之一是在於提供一種表達重組對蝦肽Pen24的基因工程菌株在預防或治療動物和植物的細菌、真菌和病毒病中的應用，還可作為防腐劑在化妝品、食品和動物飼料中應用。
本發明提供一種基因工程重組對蝦肽Pen24，其分子量為約24kDa。所述的基因工程重組對蝦肽Pen24具有抗細菌、真菌和病毒感染的生物活性。
本發明的目的之一是提供一種編碼基因工程重組對蝦肽Pen24的胺基酸序列，其胺基酸序列與序列表2的胺基酸序列至少有70％的同源性。
本發明的目的之一是提供一種編碼基因工程重組對蝦肽Pen24的胺基酸序列，其胺基酸序列與序列表2的胺基酸序列至少有80％的同源性。
本發明的目的之一是提供一種編碼基因工程重組對蝦肽Pen24的胺基酸序列，其胺基酸序列與序列表2的胺基酸序列至少有90％的同源性。
本發明的目的之一是提供一種編碼基因工程重組對蝦肽Pen24對應的核苷酸序列，其核苷酸序列與序列表1的核苷酸序列至少有50％的同源性。
本發明的目的之一是提供一種編碼基因工程重組對蝦肽Pen24對應的核苷酸序列，，其核苷酸序列與序列表1的核苷酸序列至少有80％的同源性。
本發明的目的之一是提供一種宿主細胞，該宿主細胞包含編碼本發明所述的基因工程重組對蝦肽Pen24的核苷酸序列，或者包含編碼本發明所述的基因工程重組對蝦肽Pen24的DNA片斷。
本發明的目的之一是提供一種大腸桿菌宿主細胞的構建方法，該宿主細胞包含本發明所述的基因工程重組對蝦肽Pen24的核苷酸片斷。
本發明還涉及重組對蝦肽Pen24在抗細菌感染中的應用。
本發明還涉及重組對蝦肽Pen24在抗真菌感染中的應用。
本發明還涉及重組對蝦肽Pen24在抗病毒感染中的應用。
為了達到上述目的，本發明採用以下技術措施
本發明提供一種DNA片斷的製備方法，該片段包含所述的編碼基因工程重組對蝦肽Pen24的核苷酸序列。
在本發明的一個實施方案中，本發明所提供的一種基因工程重組對蝦肽Pen24，其具有與序列表2所示胺基酸至少70％同源性的序列，其分子量為約24kDa，該基因工程重組對蝦肽Pen24具有抗細菌、真菌和病毒感染的生物活性。
在本發明的一個實施方案中，提供了一種基因工程重組對蝦肽Pen24，一種分離的蛋白質，其具有與序列表2所示胺基酸至少80％同源性的序列。
在本發明的一個實施方案中，提供了一種基因工程重組對蝦肽Pen24，一種分離的蛋白質，其具有與序列表2所示胺基酸至少90％同源性的序列。
在本發明的一個實施方案中，本發明所述的基因工程重組對蝦肽Pen24具有的胺基酸序列為序列表2。
本發明所述的基因工程重組對蝦肽Pen24的胺基酸序列可以在一定範圍內進行修飾、改變，所獲得的修飾後的蛋白質或蛋白質的片段與基因工程重組對蝦肽Pen24有相同的生物學功能。重組對蝦肽Pen24具有廣譜抗菌作用，對革蘭氏陽性細菌和革蘭氏陰性細菌均具有明顯的抑菌活性；對氨苄青黴素不敏感的強致病性細菌，如枯草芽孢桿菌、蘇雲金芽孢桿菌和綠膿桿菌等有很好的抗菌活性。同時，重組對蝦肽Pen24對抗氨苄青黴素的大腸桿菌具有抑菌活性。重組對蝦肽Pen24對昆蟲核型多角體病毒(包括家蠶核型多角體病毒、苜宿銀紋夜蛾核型多角體病毒、棉鈴蟲核型多角體病毒、甜菜夜蛾核型多角體病毒等)、對蝦白斑綜合症病毒(簡稱WSSV)的感染均具有明顯的抗病毒活性。
對蛋白質進行修飾和改變的方法為常規的方法[Joe Sambrook，DavidRussell et al.，Molecular CloningA Laboratry Manual，Cold Spring Harbor Lab(CSHL)Press，2001]，為本專業技術人員所熟悉。按照現代生命科學的理論，胺基酸序列同源性70％以上的蛋白質在生物學中常被詮釋為是具有相同生物學功能的蛋白質。在此範圍內對蛋白質胺基酸序列進行的修飾和突變均被認為並未改變蛋白質的生物學特性，這些改變和修飾包括(1)對個別胺基酸進行突變，特別是非功能決定位點的胺基酸。
(2)缺失或插入個別胺基酸，特別是非功能決定位點的胺基酸。這樣的改變如果沒有改變蛋白的空間構象，就不會影響蛋白質的生物學功能，也不會改變蛋白質的免疫原性。
(3)插入特殊的胺基酸殘基。為了增加或改變蛋白質的可溶性，增加穩定性，在基因工程生產過程中，往往會在蛋白質的N、C端加入一些胺基酸殘基，以避免形成包涵體，減少宿主細胞蛋白質內切酶的降解；或者在N、C端加入一些特殊的胺基酸功能位點以利於蛋白質的表達和純化。
以上對蛋白質進行修飾和改變的方法為常規的方法(常規方法同上)，為本專業技術人員所熟悉。通過上述方法獲得的與本發明所述的基因工程重組對蝦肽Pen24有70％同源性的蛋白質或片段都具有與本發明所述基因工程重組對蝦肽Pen24相同的生物學功能，即它們具有抗細菌、真菌和病毒感染的生物活性，能夠用於實現本發明的一個或多個目的。
根據蛋白質的胺基酸組成，結合SDS-PAGE的分析結果，本發明所涉及的基因工程重組對蝦肽Pen24的分子量為約24kDa。如果蛋白質的胺基酸序列發生部分或局部的改變，蛋白質的分子量會發生變化。選用不同的宿主菌株和表達載體，由於翻譯後修飾的原因，蛋白質的分子量也會發生變化。選用不同的檢測方法，蛋白質的分子量也會有一些差異，但這些變化和差異在原則上不會超過蛋白質分子量的10％。
本發明以南美白對蝦為材料，提取總RNA，設計Penaeidin-2特異引物，通過RT-PCR、PCR擴增，得到其成熟肽編碼區序列，核苷酸序列為tacaggggcggttacacaggcccgatacccaggccaccacccattggaagaccaccgttcagacctgtttgcaatgcatgctacagactttccgtctcagatgctcgcaattgctgcatcaagttcggaagctgttgtcacttagtaaaaggataa在本發明的一個實施方案中，提供了一種編碼基因工程重組對蝦肽Pen24的核苷酸序列為序列表1。
在本發明的一個實施方案中，提供了一種基因工程重組對蝦肽Pen24，該蛋白為基因工程融合蛋白，其N的胺基酸是載體所編碼的，N端胺基酸是MSDKIIHLTDDSFDTDVLKADGAILVDFWAEWCGPCKMIAPILDEIADEYQGKLTVAKLNIDQNPGTAPKYGIRGIPTLLLFKNGEVAATKVGALSKGQLKEFLDANLAGSGSGHMHHHHHHSSGLVPRGSGMKETAAAKFERQHMDSPDLGTDDDDKAMADIGSEF本發明提供一種編碼基因工程重組對蝦肽Pen24的核苷酸序列，其具有與序列表1所示核苷酸至少有50％同源性的序列。
在本發明的一個實施方案中，提供了一種編碼基因工程重組對蝦肽Pen24的核苷酸序列，其核苷酸序列與序列表1的核苷酸序列至少有80％的同源性。
基因工程蛋白質胺基酸序列的任何改變可能改變其編碼的胺基酸，進而改變其編碼蛋白質的結構和功能，但生物的胺基酸密碼子存在兼併性。本發明所述的基因工程重組對蝦肽Pen24的核苷酸序列可以進行突變，但其編碼的蛋白質有相同的生物學功能。這些突變包括錯義突變、同義突變和移碼突變。這些方法為常規的方法，可以通過點突變等方法實現。這些方法為本專業技術人員所熟悉，不需進行創造性勞動即可獲得。通過該方法獲得的與本發明所述的核苷酸序列有50％同源性的核苷酸序列都具有與本發明所述核苷酸序列相同的生物學功能，能夠用於實現本發明的一個或多個目的。按照現代生物學的概念，尤其是生物信息學的理論，同源性在70％以上的核苷酸序列可以判定為具有顯著的相似性，同源性在80％以上的核苷酸序列可以判定為具有相同的生物學功能。
本發明所述的編碼基因工程重組對蝦肽Pen24的核苷酸序列可以在一定範圍內進行改變，所獲得的核苷酸序列與編碼基因工程重組對蝦肽Pen24的核苷酸序列具有相同的生物學功能。
在本發明的一個實施方案中，所用pET-32a(+)質粒為Novagen公司產品，在pET-32a(+)質粒多克隆位點上遊還帶有His.Tag、S.Tag及腸激酶和凝血酶酶切位點，表達的重組對蝦肽Pen24為融合蛋白，其分子質量約24kDa。
在本發明的一個實施方案中，提供了一種Penaeidin-2DNA片斷及其製備方法。該片段包含本發明所述的編碼基因工程重組對蝦肽Pen24的核苷酸序列。
發明所涉及的DNA片斷可以通過以下方式獲得(1)人工合成，可直接用DNA合成儀人工合成本發明所述的DNA片斷，或者分段合成本發明所述的DNA片斷，這些合成產物具有與本發明所述的DNA片斷相同的生物學功能，可以實現本發明所述的一個或多個目的。
(2)PCR擴增，以本發明所述的DNA片斷為模板，或者以含有本發明所述的DNA片斷的質粒、載體、宿主細胞為模板，通過PCR擴增得到DNA片斷，這些PCR產物具有與本發明所述的DNA片斷相同的生物學功能，可以實現本發明所述的一個或多個目的。
以上方法為分子生物學中常用的方法，為本領域技術人員所熟悉，不需通過創造性勞動即可獲得，所獲得的DNA片斷被視為與本發明所涉及的核苷酸序列有相同的生物學功能，能夠進一步通過基因工程的方法實現本發明的一個或多個發明目的。
在本發明的一個實施方案中，提供了一種宿主細胞——大腸桿菌E.coli，該宿主細胞包含編碼本發明所述的基因工程重組對蝦肽Pen24的核苷酸序列，或者包含編碼本發明所述的基因工程重組對蝦肽Pen24的DNA片斷。
在本發明的一個實施方案中，提供了一種大腸桿菌重組基因工程菌株，該菌株分類命名為E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)，保藏單位中國典型培養物保藏中心，保藏地址中國.武漢.武漢大學，保藏日期2006年1月10日，保藏編號CCTCC NoM206003，該宿主細胞包含本發明所述的基因工程重組對蝦肽Pen24的核苷酸序列。
在本發明的一個實施方案中，提供了一種大腸桿菌重組基因工程菌株E.coliOrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)的構建方法。
(1)南美白對蝦總RNA的提取及cDNA第一條鏈的合成採集健康南美白對蝦血淋巴，獲得血細胞，按Qiagen公司RNeasy Mini Kit說明書提取總RNA，並按Promega公司Universal Riboclone cDNA SynthesisSystem試劑盒操作手冊進行，反轉錄合成cDNA第一條鏈。
(2)PCR擴增Penaeidin-2基因以反轉錄合成的cDNA第一條鏈為模板，上遊引物P15＇GAATTCTACAGGGGCGGTTACACA 3＇(下劃線處為EcoR I位點)，下遊引物P23′GTGAATCATTTTCCTATTTTCGAA5＇(下劃線處為Hind III位點)。利用PCR儀擴增，獲得168bp目的基因。
(3)重組質粒pGEM-T/Pen的構建和鑑定回收PCR產物，將PCR產物連接到pGEM-T載體上，轉化E.coli JM109(購於美國Promega公司)感受態細胞，塗布於含X-gal、IPTG和Amp抗性的LB平板上進行藍白斑篩選，用PCR和限制性內切酶酶切鑑定、DNA測序分析鑑定重組質粒pGEM-T/Pen。
(4)重組表達質粒pET-pen的構建和鑑定用EcoR I、Hind III分別雙酶切表達載體pET-32a(+)和重組子pGEM-T/Pen質粒DNA，將Penaeidin-2基因定向插入表達載體pET-32a(+)，獲得重組質粒pET-pen。轉化E.coli Origami B(DE3)pLysS感受態細胞。用PCR、限制性內切酶酶切鑑定和DNA測序分析鑑定重組質粒pET-pen。該菌株命名為大腸桿菌重組基因工程菌株E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)。
在本發明的一個實施方案中，提供了一種利用大腸桿菌重組基因工程菌株E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)表達基因工程重組對蝦肽Pen24的方法。
(1)挑取單菌落接種於含200μg/mL氨苄青黴素(Amp)，34μg/mL氯黴素和15μg/mL卡那黴素的LB液體培養基中，37℃，250r/min下振蕩培養8-12h。4℃放置過夜。
(2)次日按4％接種量接入新鮮2YT液體培養基中，在37℃下繼續振蕩培養至菌液OD600值為0.6-0.8時，加入誘導物IPTG至終濃度為0.4mmoI/L，在37℃下誘導表達3-5h，4℃離心收集菌體。
(3)15％SDS-PAGE電泳檢測目的蛋白的表達。
在本發明的一個實施方案中，提供了一種純化基因工程重組對蝦肽Pen24的方法。
(1)超聲波破碎離心收集上清；(2)採用His·Bind resin柱，按照操作手冊純化基因工程重組對蝦肽Pen24；(3)PBS緩衝液(pH7.3)透析處理純化的基因工程重組對蝦肽Pen24；(4)15％ SDS-PAGE電泳，雷射掃描檢測重組對蝦肽蛋白Pen24純度。
(5)採用Bradford assay法，測定純化的重組對蝦肽蛋白Pen24濃度。
本發明與現有技術相比，具有以下優點和效果在本發明的一個實施方案中，檢測了基因工程重組對蝦肽Pen24抗細菌的生物活性。
(1)採用紙片擴散法，檢測重組對蝦肽Pen24對大腸桿菌的活力單位和抑菌效價。
(2)採用紙片擴散法，檢測重組對蝦肽Pen24對革蘭氏陽性細菌、革蘭氏陰性細菌和抗氨苄青黴素的大腸桿菌菌株E.coli BL21(pET-32a)的活性。
(3)採用液體生長抑制法，測定重組對蝦肽Pen24對MIC。
將過夜培養的不同菌種進行倍比稀釋，取10-3稀釋度進行MIC測定，最後通過計算菌落形成單位(CFU)判斷最小抑菌濃度。
重組對蝦肽Pen24對蝦肽具有廣譜抗菌作用，對革蘭氏陽性細菌和革蘭氏陰性細菌均具有明顯的抑菌活性；對氨苄青黴素不敏感的強致病性細菌，如枯草芽孢桿菌、蘇雲金芽孢桿菌和綠膿桿菌等有很好的抗菌活性。同時，重組對蝦肽Pen24對抗氨苄青黴素的大腸桿菌具有抑菌活性。
在本發明的一個實施方案中，檢測了基因工程重組對蝦肽Pen24抗家蠶核型多角體病毒(BmNPV)的生物活性。
採用舔食法，檢測該重組對蝦肽Pen24對家蠶核型多角體病毒(BmNPV)感染家蠶幼蟲的影響。重組對蝦肽Pen24具有明顯的抗家蠶核型多角體病毒(BmNPV)感染的活性。
在本發明的一個實施方案中，檢測了基因工程重組對蝦肽Pen24抗苜宿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcNPV)的生物活性。
採用舔食法，檢測該重組對蝦肽Pen24對苜宿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcNPV)感染銀紋夜蛾幼蟲的影響。重組對蝦肽Pen24具有明顯的抗苜宿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcNPV)感染的活性。
在本發明的一個實施方案中，檢測了基因工程重組對蝦肽Pen24抗棉鈴蟲核型多角體病毒(HaNPV)的生物活性。
採用舔食法，檢測該重組對蝦肽Pen24對棉鈴蟲核型多角體病毒(HaNPV)感染棉鈴蟲幼蟲的影響。重組對蝦肽Pen24具有明顯的抗棉鈴蟲核型多角體病毒(HaNPV)感染的活性。
在本發明的一個實施方案中，檢測了基因工程重組對蝦肽Pen24抗甜菜夜蛾核型多角體病毒(SeNPV)的生物活性。
採用舔食法，檢測該重組對蝦肽Pen24對甜菜夜蛾核型多角體病毒(SeNPV)感染甜菜夜蛾幼蟲的影響。重組對蝦肽Pen24具有明顯的抗甜菜夜蛾核型多角體病毒(SeNPV)感染的活性。
在本發明的一個實施方案中，檢測了基因工程重組對蝦肽Pen24抗對蝦白斑綜合症病毒(WSSV)的生物活性。
採用注射法，檢測該重組對蝦肽Pen24對對蝦白斑綜合症病毒(WSSV)感染克氏原螯蝦的影響。重組對蝦肽Pen24具有明顯的抗對蝦白斑綜合症病毒(WSSV)感染的活性。


本發明的上述和其它目的，特點和優勢可顯而易見地從下面對本發明優選實施例的詳細描述和附圖示出的內容得到，不同視圖中相同的參考符號代表相同的部分。附圖並不一定是按比例示出，其重點在於說明本發明的實施和效果。
圖1基因penaedin-2 RT-PCR鑑定圖。
Lane 1.DL2000 Markers；Lane 2.PCR product圖2重組質粒pGEM-T/Pen-2的PCR和酶切鑑定圖Lane 1 DL2000；Lane 2 PCR product；Lane 3 pGEM-T/Pen/EcoRI+HindIII；Lane 4pGEM-T/Pen/EcoRI；Lane 5 pGEM-T/Pen plasmid；lane6 marker III圖3重組表達質粒pET-pen的PCR和酶切鑑定圖Lane 1 DL2000 Markers；Lane 2.PCR product；Lane 3.pET-pen/EcoR I+Hind III；Lane 4.pET-pen/EcoRI；Lane 5.pET-32a(+)/EcoRI；Lane 6.Marker III.
圖4重組表達質粒pET-pen的構建過程5 15％SDS-PAGE檢測Pen24的表達Lane 1.純化的Pen24融合蛋白；Lane 2.分子量標準；Lane 3.E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)未誘導；Lane 4.E.coli Origami B(DE3)pLysS(pET-pen)誘導前；Lane 5.E.coli Origami B(DE3)pLysS(pET-pen)誘導4h；Lane 6.E.coliOrigami B(DE3)pLysS(pET-pen)誘導3h；Lane 7.E.coli Origami B(DE3)pLysS(pET-32)誘導4h；Lane 8.E.coli Origami B(DE3)pLysS(pET-32)誘導前；Lane 9.E.coli Origami B(DE3)pLysS(pET-32)未誘導圖6重組對蝦肽Pen24抑菌效價測定圖7重組對蝦肽Pen24抑制BmNPV感染家蠶的活性測定注TN+BmNPVBmNPV陽性對照組；E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET)破碎上清液+BmNPVE.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET)破碎上清液+BmNPV組；A組，B組E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)破碎上清液+BmNPV組；TNTN Buffer對照組圖8重組對蝦肽Pen24抑制AcNPV感染銀紋夜蛾的活性測定注AcNPVAcNPV陽性對照組；AcNPV+E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET)E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET)破碎上清液+AcNPV組；AcNPV+Pen-24E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)破碎上清液+AcNPV組；PBSPBS Buffer對照組圖9重組對蝦肽Pen24抑制HaNPV感染銀紋夜蛾的活性測定注HaNPVHaNPV陽性對照組；HaNPV+Pen-24E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)破碎上清液+HaNPV組；HaNPV+E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET)E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET)破碎上清液+HaNPV組；PBSPBS Buffer對照組圖10重組對蝦肽Pen24抑制SeMNPV感染銀紋夜蛾的活性測定注SeMNPV+E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET)E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET)破碎上清液+SeMNPV組；SeMNPV+Pen-24E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)破碎上清液+SeMNPV組；SeMNPVSeMNPV陽性對照組；PBSPBS Buffer對照組圖11重組對蝦肽Pen-24抑制WSSV感染克氏原螯蝦的活性測定注WSSV+E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET)E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET)破碎上清液+WSSV組；WSSV+PBSWSSV陽性對照組；WSSV+Pen-24重組對蝦肽Pen24+WSSV組；PBSPBS Buffer對照組具體實施方式
實施例1 南美白對蝦總RNA的提取將南美白對蝦飼養於通氧22℃的水箱中待用。選取蛻皮間期健康蝦，用DEPC處理過的滅菌水漂洗後，用2.5mL一次性注射器從蝦的腹竇處收集血淋巴750μL，加入等體積的抗凝劑(PH7.0)，鏡檢記數，取細胞含量為1×107的血淋巴於4℃、、800g離心15min，移去上清，收集血細胞。按照Qiagen公司RNeasyMini Kit的產品說明書提取總RNA。將提取到的RNA溶液貯存於-80℃，以備用。
對提取的南美白對蝦總RNA進行瓊脂糖凝膠電泳，結果顯示28S和18S兩條帶清晰可見，並且兩條帶的顯色強度近似為2∶1，說明所提取的總RNA基本上沒有降解，完整性較好。
實施例2 南美白對蝦反轉錄cDNA第一條鏈的合成以Oligo(dT)15為引物，按照Promega公司的Reverse Transcription Reaction試劑盒說明書合成cDNA第一鏈。具體操作步驟如下將以下試劑加入到經DEPC浸泡並滅菌處理過的PCR反應管中25mM MgCl2，4μL；10×反轉錄緩衝液，2μL；10mM dNTP混合物，2μL；重組的RNasin核糖核酸酶抑制劑，0.5μL；24U/μLAMV反轉錄酶，0.8μL；0.5μg/μL Oligo(dT)15引物1μL；總RNA，3μL；無核酸酶的水，2.7μL。反應條件為42℃，1小時；95℃，5分鐘；3℃，5分鐘。
將合成的cDNA第一鏈存放於-80℃備用。
實施例3 南美白對蝦Penaeidin-2基因的擴增1.擴增引物的合成設計引物，上遊引物P15＇GAATTCTACAGGGGCGGTTACACA 3＇(下劃線處為EcoR I位點)，下遊引物P23＇GTGAATCATTTTCCTATTTTCGAA5＇(下劃線處為Hind III位點)。引物由上海生工生物工程有限公司合成，經PAGE純化。
2.目的基因的PCR擴增按照Reverse Transcription Reaction試劑盒操作手冊，以反轉錄合成的cDNA第一條鏈為模板，PCR擴增目的基因Penaeidin-2。PCR反應體系10×reactionbuffer，5μL；1.5mM MgCl2，3μL；0.2mM dNTP，1μL；20pmol上遊引物P1，1μL；20pmol下遊引物P2，1μL；5U/μL Taq DNA聚合酶1μL；模板6μL；加無菌水至終體積為50μL。PCR反應條件95℃，5min；94℃，30s；53℃，45s；72℃30s(35個循環)；72℃，5min。
瓊脂糖凝膠電泳結果如附圖1所示。PCR擴增目的基因Penaeidin-2產物經1.2％的瓊脂糖凝膠電泳，有一約為168bp DNA帶，與預測目的基因Penaeidin-2結果相符。
實施例4 南美白對蝦Penaeidin-2基因的克隆1.目的基因penaedin-2片段的回收採用DNA膠回收試劑盒(Omega公司產品)，按照Omega公司DNA膠回收試劑盒說明書回收目的基因片段。具體操作步驟如下(1)PCR產物經1.2％瓊脂糖凝膠電泳(1×TAE)，用紫外燈觀察電泳情況，當要回收的DNA帶與其他帶完全分離時，停止電泳，在紫外燈下用刀片切下欲回收帶，用PCR產物純化試劑盒純化。
(2)在Eppendorf管中將膠搗碎，加入等體積的溶膠液Binding Buffer，65℃水浴7min，其間每2min輕搖Eppendorf管一次直至膠完全融解。
(3)將融解的樣品加入層析柱中，12000rpm離心1min，棄去液體。
(4)加300μL Binding Buffer，離心棄去液體。
(5)加750μL Washing Buffer，離心棄去液體。
(6)重複步驟(5)。
(7)空柱子12000rpm離心1min以甩幹液體。
(8)將柱子放於1.5mL Eppendorf管，加入30μL Elution buffer，37℃保溫2min，12000rpm離心1min，收集離心液，貯存於-20℃。
2.目的基因penaedin-2片段克隆入pGEM-T載體，構建重組質粒pGEM-T/Pen將以上純化的PCR產物克隆於pGEM-T載體，pGEM-T載體購自Promega公司。反應體系為2×Ligation buffer，5.0μL；pGEM-T載體，0.5μL；PCR產物，4.0μL；T4DNA ligase，0.5μL；無加菌ddH2O至10μL。在冰上混合上述液體，16℃連接15h。
3.質粒的轉化
(1)感受態細胞的製備採用冷氯化鈣法製備大腸桿菌感受態細胞。挑取單個E.coli JM109菌落，接種於5mL LB培養基中，37℃、220rpm培養過夜，次日取上述菌液按比例1∶100再接種於50mL LB培養液中，37℃，220rpm振蕩，待菌液OD值為0.6時，取1.5mL菌液加入無菌的Eppendorf離心管中，4,000rpm離心10min，棄上清。加入800μL冰預冷的0.1M氯化鈣，輕輕振蕩重懸菌體沉澱，冰浴30min。4,000rpm離心10min，棄上清。加入100μL冰預冷的0.1M氯化鈣重懸沉澱，4℃保存，7～10天內使用。
(2)質粒轉化E.coli JM109感受態細胞取上述連接產物10μL加入100μL感受態細胞中，輕輕混勻，冰浴60分鐘，42℃熱休克90秒，再置冰浴2分鐘，加入390μL新鮮LB液體培養基，37℃，150rpm輕搖，50min。取100μL菌液塗布於含5-溴-4氯-3吲哚-D-半乳糖苷(X-gal)、異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)和Amp抗性的LB平板上，37℃培養過夜，觀察結果，進行藍白斑篩選。挑取白色菌落快速提取質粒進行PCR和酶切鑑定。
4.重組質粒pGEM-T/Pen的鑑定隨機挑取10個單克隆白斑，擴大培養後用質粒提取試劑盒(Qiagen公司產品)抽提質粒。以質粒pGEM-T/Pen為模板，用引物P1、P2擴增出與預測結果相符的片斷，表明目的基因已克隆入pGEM-T載體中。PCR與酶切鑑定結果見附圖2。重組質粒pGEM-T/Pen經EcoRI+HindIII雙酶切，得到約3000bp和168bp的預期DNA片斷，pGEM-T/Pen經EcoRI單酶切，得到單一約3168bp的預期DNA片斷。
5.Penaeidin-2核苷酸序列測定質粒pGEM-T/Pen DNA經PCR和酶切鑑定後，隨機選取陽性克隆送北京華大基因公司進行DNA測序分析。pGEM-T/Pen質粒經全自動測序分析，Penaeidin-2基因核苷酸序列為tacaggggcggttacacaggcccgatacccaggccaccacccattggaagaccaccgttcagacctgtttgcaatgcatgctacagactttccgtctcagatgctcgcaattgctgcatcaagttcggaagctgttgtcacttagtaaaaggataa實施例5 基因工程菌株E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)的構建和鑑定1.重組表達質粒pET-pen的構建用EcoR I、Hind III分別雙酶切表達載體pET-32a(+)和重組子pGEM-T/Pen質粒DNA，分別用膠回收試劑盒回收、純化目的DNA片斷，再將Penaeidin-2DNA片斷與pET-32a(+)DNA片斷連接，16℃連接15h後，產物轉化E.coli OrigamiB(DE3)pLysS感受態細胞，塗布於含12.5μg/ml Tetracycline、15μg/mlKanamycin、34μg/ml Chloramphenicol的LB平板上，37℃培養過夜。
2.重組表達質粒pET-pen的鑑定隨機挑取10個陽性克隆，經擴大培養後，用質粒提取試劑盒抽提質粒，PCR和EcoR I、Hind III酶切鑑定pET-pen重組表達質粒。以質粒pET-pen為模板，用引物P1、P2擴增出與預測結果相符的片斷，表明目的基因已克隆入pET-32a(+)載體中。PCR與酶切鑑定結果如附圖3。重組質粒pET-pen DNA經EcoRI+HindIII雙酶切，得到約5875bp和168bp的二個DNA片斷，pET-pen DNA經EcoRI單酶切，得到單一約6043bp的DNA片斷。
重組表達質粒pET-pen的構建過程如附圖4。
3.核苷酸序列測定質粒pET-pen DNA經PCR和酶切鑑定後，隨機選取陽性克隆送北京華大基因公司進行DNA測序分析。pET-pen質粒經全自動測序分析，結果表明6個His序列成功的融合到Penaeidin-2基因成熟肽起始密碼子tac前，序列閱讀框沒有移碼。
上述所構建的菌株為E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)。
實施例6 基因工程重組對蝦肽Pen24的表達挑取用甘油保存的菌種E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)，接種於含100μg/mL Ampicillin，34μg/mL chloramphenicol和15μg/mL kanamycin(sulfate)的LB液體培養基中，37℃，250r/min下振蕩培養8-12h。次日按4％接種量接入新鮮含100μg/mL Ampicillin，34μg/mL chloramphenicol和15μg/mL kanamycin(sulfate)的2YT液體培養基中，37℃培養至菌液OD600值為0.6-0.8時，加入誘導物IPTG(終濃度為0.4mM)，37℃下誘導表達，誘導後2h，3h，4h分別取樣，離心沉澱，去上清，加入300μLPBS(PH6.9)緩衝液，超聲波破碎，12,000g離心10min，上清加入5×SDS-PAGE樣品緩衝液，參照《分子克隆》進行SDS-PAGE，用考馬斯亮藍R250染色檢測分析表達結果。結果如附圖5所示。15％SDS-PAGE電泳結果表明在IPTG誘導後基因工程菌株能夠表達重組對蝦肽Pen24，表達產物分子量與預期相符，為24kDa。
實施例7 基因工程重組對蝦肽Pen24的純化(1)挑取用甘油保存的菌種E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)，接種於含100μg/mL Ampicillin，34μg/mL chloramphenicol和15μg/mL kanamycin(sulfate)的LB液體培養基中，37℃，250r/min下振蕩培養8-12h。次日按4％接種量接入新鮮含100μg/mL Ampicillin，34μg/mL chloramphenicol和15μg/mL kanamycin(sulfate)的2YT液體培養基中，37℃培養至菌液OD600值為0.6-0.8時，加入誘導物IPTG(終濃度為0.4mM)，37℃下誘導表達，誘導表達4h後，5000g離心收集菌體。
(2)重懸於Binding Buffer pH7.920mmol/L Tris-HCl，5mmol/L NaCl中，4℃，進行超聲波破碎菌處理(處理30min，每次10s，間隔30s)。12,000g離心20min兩次，收集上清，上清即為基因工程重組對蝦肽Pen24的提取液。
(3)Ni++柱層析樣品處理基因工程重組對蝦肽Pen24的提取液經0.45μm的濾膜過濾，用1×Binding Buffer定容至100ml Ni++柱層析樣品。用10床1×Binding Buffer，20床無菌水清洗柱床；用10床1×Charge Buffer(5mM NiSO4)，結合Ni++；再用10床1×Binding Buffer平衡柱床後，備用(1床即是柱內介質的體積)。樣品經蠕動泵以循環方式通過Ni++柱，使帶有6×His的蛋白樣品流動相充分與Ni++柱中的Ni++相結合，過夜後從Ni++柱出口收集未與Ni++結合的樣品(穿漏液)。分別採用50床1×Binding Buffer；75床60mM咪唑；75床100mM咪唑；30床150mM咪唑梯度洗滌留在柱內的少量樣品和與Ni++柱結合的非目的蛋白。用1×Elute Buffer(1M咪唑+0.5M NaCl+20mM Tris·HCl pH7.9)洗脫與Ni++柱結合的目的蛋白，分部收集，1mL/管。Ni++柱用1×Elute Buffer繼續洗脫，洗樣柱中全部蛋白；再用1×Strip Buffer(100mM EDTA+0.5M NaCl+20mMTris·HCl pH7.9)洗柱子。通過SDS-PAGE檢驗目的蛋白在洗脫液中的分布，參照《分子克隆》進行SDS-PAGE，用考馬斯亮藍R250染色檢測分析表達結果。結果如附圖5所示。純化樣品經15％SDS-PAGE檢測，有大小為24.1kDa的單一條帶。
實施例8 基因工程重組對蝦肽Pen24純化樣品中蛋白質含量的確定將15mL經Ni++柱洗脫、收集的基因工程重組對蝦肽Pen24純化樣品裝入經處理的透析袋中，放入盛有1000mL PBS緩衝液(PH6.9)燒杯中透析、過夜。以上操作均在4℃進行。用Bradford法確定重組對蝦肽Pen24含量，用mg/mL標定。
Bradford法具體操作如下(1)將0、1、2、3、4、5、6μL 1mg/ml牛血清白蛋白(BSA)標準溶液依次加入酶標微孔板中，用PBS補足50μL。
(2)向每孔中加入200μL Bradford試劑工作液(0.1％考馬斯亮藍G250，5％乙醇，8.5％磷酸)。振蕩、混勻後，室溫放置2分鐘。
(3)用酶標儀測BSA蛋白各濃度的OD570值(λ＝570nm)。以BSA蛋白質濃度為橫坐標，以BSA蛋白各濃度的OD570值為縱坐標製作標準曲線。
(4)用同樣方法測定樣品的OD570值，用標準曲線中確定樣品的濃度。
實施例9 基因工程重組對蝦肽Pen24抗細菌的生物活性(1)重組對蝦肽Pen24抑菌效價和活力單位測定採用紙片擴散法，檢測重組對蝦肽Pen24對大腸桿菌的活力單位和抑菌效價。濾紙片直徑為0.6cm。實驗菌種大腸桿菌(Escherichia coli)，將培養至對數生長期的大腸桿菌(CFU＝1.5×106個/mL)以1∶200比例均勻塗布於LB瓊脂平板上，待乾燥後貼上無菌紙片，將待測重組抗菌肽Pen24溶液20μL加到紙片上，以E.coli Origami B(DE3)pLysS(pET-32a)20μL作陰性對照，同時以含氨苄青黴素的藥敏紙片作陽性對照，37℃孵育12h後，測量抑菌圈直徑大小。
結果如附圖6所示。當對蝦肽Pen24為2.80μg時，抑菌圈直徑為17.44mm，2.80μg Pen24和10μg(含15IU)的氨苄青黴素藥敏紙片產生的抑菌圈大小相等，表明重組對蝦肽Pen24的殺菌活力為1μg抗菌肽與5IU的氨苄青黴素殺菌活力相當。試驗中，每片藥敏紙片中重組對蝦肽Pen24含量增加，抑菌圈直徑逐漸增大。
(2)採用紙片擴散法，檢測重組對蝦肽Pen24對革蘭氏陽性細菌、革蘭氏陰性細菌和抗氨苄青黴素的大腸桿菌菌株E.coli BL21(pET-32a)的活性。實驗菌種包括抗氨苄青黴素大腸桿菌Escherichia coliBL21(pET-32a)、大腸桿菌(Escherichia coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus megaterium)、蘇雲金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)(中國典型培養物保藏中心提供)。將培養至對數生長期的不同細菌(CFU＝1.5×106個/mL)以1∶200比例均勻塗布於LB瓊脂平板上，待乾燥後貼上無菌紙片，將待測重組抗菌肽Pen24溶液20μL加到紙片上，以E.coli Origami B(DE3)pLysS(pET-32a)20μL作陰性對照，同時以含氨苄青黴素的藥敏紙片作陽性對照，37℃孵育12h後，測量抑菌圈直徑大小。
重組對蝦肽Pen24對革蘭氏陽性細菌、革蘭氏陰性細菌和抗氨苄青黴素的大腸桿菌菌株E.coli BL21(pET-32a)的活性結果見表1。抑菌圈大小又表明重組對蝦肽Pen24對革蘭氏陽性細菌和革蘭氏陰性細菌均有不同程度的抗菌活性，並且對包括氨苄青黴素抗性菌在內的多種細菌都有抑制作用，且隨著抗菌肽含量的提高，抑菌圈逐漸加大，效果不斷加強。
表1 重組對蝦肽Pen24活力測定

(3)重組對蝦肽Penaeidin-2最小抑菌濃度(MIC)值測定最小抑菌濃度(MIC)值的測定參照液體生長抑制法，將過夜培養的不同菌種進行10倍稀釋，取10-3稀釋度進行MIC測定，分別各取5μL(CFU＝1.5×107個/mL)加入1.5mL EP管中，向各管中依次加入0μL、10μL、20μL、30μL、35μL、36μL、38μL、40μL等經過透析處理的並已經定量的純化重組對蝦肽，37℃靜止培養24小時，均勻塗布於瓊脂平板，37℃過夜培養後計算菌落形成單位(CFU)。結果見表2。表明重組對蝦肽Pen-24對多種強致病性細菌均有很好的抑菌作用，Pen-24對革蘭氏陽性細菌抑菌效果較革蘭氏陰性細菌顯著。
表2 重組對蝦肽Pen24最小抑菌濃度(MIC)的測定

實施例10 基因工程重組對蝦肽Pen24抗家蠶核形多角體病毒感染的生物活性1.樣品的製備(1)家蠶核形多角體病毒(BmNPV)樣品的製備家蠶核形多角體病毒(BmNPV)粗提液經蔗糖梯度純化，於顯微鏡下計數，BmNPV含量為1.6×109PIB/mL。
(2)E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)破碎上清液樣品製備菌種E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)經發酵，收集菌體。100克溼菌體用500mL NT Buffer重懸，超聲波破碎，離心，取上清。
(3)E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-32a(+))破碎上清液樣品製備菌種E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-32a(+))經發酵，收集菌體。100克溼菌體用500mL NT Buffer重懸，超聲波破碎，離心，取上清。
2.Pen24抗家蠶核形多角體病毒(BmNPV)感染生物活性測定家蠶購於武漢從蠶業研究所，於室溫飼養。將五齡家蠶幼蟲分成5組，選擇8×108PIB/mL BmNPV作為病毒感染劑量。分別用下述4種樣品添食感染①E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)破碎上清液+BmNPV組E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)破碎上清液樣品與BmNPV懸液混合，26℃下作用1h後，塗於4片中等大小、新鮮乾淨桑葉上，每片300μL，等其乾燥後餵養家蠶。
②E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-32a(+))破碎上清液+BmNPV組E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-32a(+))破碎上清液樣品與BmNPV懸液混合，26℃下作用1h後，塗於4片中等大小、新鮮乾淨桑葉上，每片300μL，等其乾燥後餵養家蠶。
③BmNPV陽性對照組BmNPV懸液塗於4片中等大小、新鮮乾淨桑葉上，每片300μL，等其乾燥後餵養家蠶。
④TN Buffer對照組TN Buffer塗於4片中等大小、新鮮乾淨桑葉上，每片300μL，等其乾燥後餵養家蠶。
家蠶幼蟲於20-25℃條件下飼養，感染BmNPV病毒3天後，每天餵食新鮮乾淨桑葉兩次，一天兩次記錄家蠶幼蟲死亡的情況。
結果見附圖7。結果表明，第6天，E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)破碎上清液)+BmNPV組死亡率分別為10％，20％；BmNPV陽性對照組死亡率為40％；E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-32a(+))破碎上清液+BmNPV對照組死亡率為40％。第7天，E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)破碎上清液)+BmNPV組死亡率分別為60％，70％；BmNPV陽性對照組死亡率100％；E.coliOrigamiB(DE3)pLysS(pET-32a(+))破碎上清液+BmNPV對照組死亡率為100％。抗菌肽Pen24能有效地抑制BmNPV對五齡家蠶幼蟲感染，具有抗BmNPV病毒感染的生物活性。
實施例11 基因工程重組對蝦肽Pen24抗苜宿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcNPV)感染的生物活性採用舔食法，檢測基因工程重組對蝦肽Pen24抗苜宿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcNPV)感染銀紋夜蛾幼蟲的影響。
1.樣品的製備(1)苜宿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcNPV)樣品的製備苜宿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcNPV)粗提液經蔗糖梯度純化，於顯微鏡下計數，AcNPV含量為1.1×109PIB/mL。
(2)E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)破碎上清液樣品製備菌種E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)經發酵，收集菌體。100克溼菌體用500mL PBS Buffer重懸，超聲波破碎，離心，取上清。
(3)E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-32a(+))破碎上清液樣品製備菌種E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-32a(+))經發酵，收集菌體。100克溼菌體用500mL PBS Buffer重懸，超聲波破碎，離心，取上清。
2.Pen24抗苜宿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcNPV)感染生物活性測定選擇1.1×104PIB/mL AcNPV作為病毒感染劑量。將銀紋夜蛾飼養於26℃，用人工飼料飼養。將三齡銀紋夜蛾幼蟲分成4組，分別用下述4種樣品添食感染①E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)破碎上清液+AcNPV組E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)破碎上清液樣品與AcNPV懸液混合，26℃下作用1h後，按300μL塗於1cm3人工飼料表面，餵養銀紋夜蛾幼蟲。
②E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-32a(+))破碎上清液+AcNPV組E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-32a(+))破碎上清液樣品與AcNPV懸液混合，26℃下作用1h後，按300μL塗於1cm3人工飼料表面，餵養銀紋夜蛾幼蟲。
③AcNPV陽性對照組AcNPV懸液按300μL塗於1cm3人工飼料表面，餵養銀紋夜蛾幼蟲。
④PBS Buffer對照組PBS Buffer懸液按300μL塗於1cm3人工飼料表面，餵養銀紋夜蛾幼蟲。
銀紋夜蛾幼蟲於20-25℃條件下飼養，感染AcNPV病毒三天後，每天餵食新鮮人工飼料，一天兩次記錄銀紋夜蛾幼蟲死亡情況。
結果見附圖8。結果表明，第5天，E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)破碎上清液+AcNPV組死亡率為58％；AcNPV陽性對照組死亡率為84％；E.coliOrigamiB(DE3)pLysS(pET-32a(+))破碎上清液+AcNPV對照組死亡率為92％。第7天，E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)破碎上清液+AcNPV組死亡率為75％；AcNPV陽性對照組死亡率100％；E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-32a(+))破碎上清液+AcNPV對照組死亡率為100％。抗菌肽Pen24能有效地抑制AcNPV對三齡銀紋夜蛾幼蟲的感染，具有抗AcNPV病毒感染的生物活性。
實施例12 基因工程重組對蝦肽Pen24抗棉鈴蟲核形多角體病毒(HaNPV)感染的生物活性採用舔食法，檢測基因工程重組對蝦肽Pen24抗棉鈴蟲核形多角體病毒(HaNPV)感染棉鈴蟲幼蟲的影響。
1.樣品的製備
(1)棉鈴蟲核形多角體病毒(HaNPV)樣品的製備棉鈴蟲核形多角體病毒(HaNPV)粗提液經蔗糖梯度純化，於顯微鏡下計數，HaNPV含量為1.5×109PIB/mL。
(2)E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)破碎上清液樣品製備菌種E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)經發酵，收集菌體。100克溼菌體用500mL PBS Buffer重懸，超聲波破碎，離心，取上清。
(3)E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-32a(+))破碎上清液樣品製備菌種E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-32a(+))經發酵，收集菌體。100克溼菌體用500mL PBS Buffer重懸，超聲波破碎，離心，取上清。
2.Pen24抗棉鈴蟲核形多角體病毒(HaNPV)感染生物活性測定選擇1.5×104PIB/mL HaNPV作為病毒感染劑量。將棉鈴蟲飼養於26℃，用人工飼料飼養。將三齡棉鈴蟲幼蟲分成4組，分別用下述4種樣品添食感染①E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)破碎上清液+HaNPV組E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)破碎上清液樣品與HaNPV懸液混合，26℃下作用1h後，按300μL塗於1cm3人工飼料表面，餵養棉鈴蟲幼蟲。
②E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-32a(+))破碎上清液+HaNPV組E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-32a(+))破碎上清液樣品與HaNPV懸液混合，26℃下作用1h後，按300μL塗於1cm3人工飼料表面，餵養棉鈴蟲幼蟲。
③HaNPV陽性對照組HaNPV懸液按300μL塗於1cm3人工飼料表面，餵養棉鈴蟲幼蟲。
④PBS Buffer對照組PBS Buffer懸液按300μL塗於1cm3人工飼料表面，餵養棉鈴蟲幼蟲。
棉鈴蟲幼蟲於20-25℃條件下飼養，感染HaNPV病毒三天後，每天餵食新鮮人工飼料，一天兩次記錄棉鈴蟲幼蟲死亡情況。
結果見附圖9。結果表明，第4天，E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)破碎上清液+HaNPV組死亡率為33％；HaNPV陽性對照組死亡率為75％；E.coliOrigamiB(DE3)pLysS(pET-32a(+))破碎上清液+HaNPV對照組死亡率為75％。第5天，E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)破碎上清液+HaNPV組死亡率為67％；HaNPV陽性對照組死亡率為92％；E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-32a(+))破碎上清液+HaNPV對照組死亡率為92％。第6天，E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)破碎上清液+HaNPV組死亡率為83％；HaNPV陽性對照組死亡率100％；E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-32a(+))破碎上清液+HaNPV對照組死亡率為100％。抗菌肽Pen24能有效地抑制HaNPV對三齡棉鈴蟲幼蟲的感染，具有抗HaNPV病毒感染的生物活性。
實施例13 基因工程重組對蝦肽Pen24抗甜菜夜蛾核形多角體病毒(SeMNPV)感染的生物活性採用舔食法，檢測基因工程重組對蝦肽Pen24抗甜菜夜蛾核形多角體病毒(SeMNPV)感染甜菜夜蛾幼蟲的影響。
1.樣品的製備(1)甜菜夜蛾核形多角體病毒(SeMNPV)樣品的製備甜菜夜蛾核形多角體病毒(SeMNPV)粗提液經蔗糖梯度純化，於顯微鏡下計數，SeMNPV含量為7.8×109PIB/mL。
(2)E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)破碎上清液樣品製備菌種E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)經發酵，收集菌體。100克溼菌體用500mL PBS Buffer重懸，超聲波破碎，離心，取上清。
(3)E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-32a(+))破碎上清液樣品製備菌種E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-32a(+))經發酵，收集菌體。100克溼菌體用500mL PBS Buffer重懸，超聲波破碎，離心，取上清。
2.Pen24抗甜菜夜蛾核形多角體病毒(SeMNPV)感染生物活性測定選擇7.8×104PIB/mL SeMNPV作為病毒感染劑量。將甜菜夜蛾飼養於26℃，用人工飼料飼養。將三齡甜菜夜蛾幼蟲分成4組，分別用下述4種樣品添食感染①E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)破碎上清液+SeMNPV組E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)破碎上清液樣品與SeMNPV懸液混合，26℃下作用1h後，按300μL塗於1cm3人工飼料表面，餵養甜菜夜蛾幼蟲。
②E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-32a(+))破碎上清液+SeMNPV組E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-32a(+))破碎上清液樣品與SeMNPV懸液混合，26℃下作用1h後，按300μL塗於1cm3人工飼料表面，餵養甜菜夜蛾幼蟲。
③SeMNPV陽性對照組SeMNPV懸液按300μL塗於1cm3人工飼料表面，餵養甜菜夜蛾幼蟲。
④PBS Buffer對照組PBS Buffer懸液按300μL塗於1cm3人工飼料表面，餵養甜菜夜蛾幼蟲。
甜菜夜蛾幼蟲於20-25℃條件下飼養，感染SeMNPV病毒三天後，每天餵食新鮮人工飼料，一天兩次記錄甜菜夜蛾幼蟲死亡情況。
結果見附圖10。結果表明，第4天，E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)破碎上清液+SeMNPV組死亡率為58％；SeMNPV陽性對照組死亡率為75％；E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-32a(+))破碎上清液+SeMNPV對照組死亡率為75％。第5天，E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)破碎上清液+SeMNPV組死亡率為58％；SeMNPV陽性對照組死亡率為100％；E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-32a(+))破碎上清液+SeMNPV對照組死亡率為100％。第7天，E.coliOrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)破碎上清液+SeMNPV組死亡率為75％；SeMNPV陽性對照組死亡率100％；E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-32a(+))破碎上清液+SeMNPV對照組死亡率為100％。抗菌肽Pen24能有效地抑制SeMNPV對三齡甜菜夜蛾幼蟲的感染，具有抗SeMNPV病毒感染的生物活性。
實施例14 基因工程重組對蝦肽Pen24抗對蝦白斑綜合症病毒感染的生物活性1.樣品的製備和處理(1)對蝦白斑綜合症病毒(WSSV)樣品的製備將-20℃凍存的經對蝦白斑綜合症病毒(WSSV)感染的克氏原螯蝦置冰上，取頭胸部(腮、肝、心臟等器官)，用手術剪刀剪成小塊，放入玻璃勻漿器內，冰浴勻漿。勻漿液12000r/min 4℃離心20min，上清液用0.45μm濾膜過濾除菌，分裝1.5ml EP管-20℃凍存備用。
用上述WSSV病毒懸液，用150μl/頭WSSV懸液注射克氏原螯蝦，22-24℃感染，結果6.5天內全部死亡。用100μl/頭WSSV懸液注射克氏原螯蝦，22-24℃感染，結果9天內全部死亡。我們選擇0.1mL WSSV病毒懸液為基因工程重組對蝦肽Pen24抗對蝦白斑綜合症病毒感染體實驗的WSSV病毒感染劑量。
(2)四種試驗樣品的處理①基因工程重組對蝦肽Pen24純化樣品試驗組樣品將定量的1mg/mL重組對蝦肽Pen24純化樣品與WSSV病毒懸液等體積混勻，26℃下作用1h。
②E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-32a(+))破碎上清液樣品製備和處理菌種E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-32a(+))經發酵，收集菌體。100克溼菌體用500mL PBS Buffer重懸，超聲波破碎，離心，取上清。將破碎上清液與WSSV病毒懸液等體積混勻，26℃下作用1h。
③WSSV陽性對照組樣品WSSV病毒懸液用PBS稀釋1倍，26℃下作用1h。
④健康對照組樣品PBS Buffer。
2.Pen24抗對蝦白斑綜合症病毒(WSSV)感染生物活性測定克氏原螯蝦於22-24℃於室溫飼養，對蝦餌料(0號)購於湛江粵華水產飼料有限公司。將克氏原螯蝦分成4組，分別用上述4種試驗樣品注射克氏原螯蝦。劑量0.15mL/尾，每組25尾，兩個重複。在自然氣溫(15～22℃)的條件下養殖，每天換水並投餵人工蝦飼料一次，一天兩次記錄螯蝦死亡的情況。
結果見表3和附圖11。室溫(20-25℃)飼養的結果顯示，克氏原螯蝦於22-24℃養殖，在第4天，基因工程重組對蝦肽Pen24樣品試驗組無死亡；WSSV陽性對照組組死亡率為15％；E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-32a(+))破碎上清液組死亡率為20％。第9天，WSSV陽性對照組和E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-32a(+))破碎上清液組死亡率均為100％，基因工程重組對蝦肽Pen24純化樣品試驗組死亡率為85％，有15％的存活率。表明基因工程重組對蝦肽Pen24在克氏原螯蝦體內能較有效地抵抗WSSV的感染，具有抗WSSV病毒感染的生物活性。
表3重組對蝦肽Pen24抗WSSV感染的測定

序列表1SEQUENCE LISTING110武漢大學120一種表達重組對蝦肽Pen24的基因工程菌株及應用130一種重組對蝦肽Pen24核苷酸序列1602170PatentIn version 3.12101211657212DNA213重組DNA220
221CDS222(1)..(657)223
4001atg agc gat aaa att att cac ctg act gac gac agt ttt gac acg gat 48Met Ser Asp Lys Ile Ile His Leu Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr Asp1 5 10 15gta ctc aaa gcg gac ggg gcg atc ctc gtc gat ttc tgg gca gag tgg 96Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile Leu Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp20 25 30tgc ggt ccg tgc aaa atg atc gcc ccg att ctg gat gaa atc gct gac144Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala Pro Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp35 40 45gaa tat cag ggc aaa ctg acc gtt gca aaa ctg aac atc gat caa aac192Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val Ala Lys Leu Asn Ile Asp Gln Asn50 55 60cct ggc act gcg ccg aaa tat ggc atc cgt ggt atc ccg act ctg ctg240Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu Leu65 70 75 80ctg ttc aaa aac ggt gaa gtg gcg gca acc aaa gtg ggt gca ctg tct288Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu Ser85 90 95aaa ggt cag ttg aaa gag ttc ctc gac gct aac ctg gcc ggt tct ggt336Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu Asp Ala Asn Leu Ala Gly Ser Gly100 105 110tct ggc cat atg cac cat cat cat cat cat tct tct ggt ctg gtg cca384Ser Gly His Met His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
115 120 125cgc ggt tct ggt atg aaa gaa acc gct gct gct aaa ttc gaa cgc cag432Arg Gly Ser Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln130 135 140cac atg gac agc cca gat ctg ggt acc gac gac gac gac aag gcc atg480His Met Asp Ser Pro Asp Leu Gly Thr Asp Asp Asp Asp Lys Ala Met145 150 155 160gct gat atc gga tcc gaa ttc tac agg ggc ggt tac aca ggc ccg ata528Ala Asp Ile Gly Ser Glu Phe Tyr Arg Gly Gly Tyr Thr Gly Pro Ile165 170 175ccc agg cca cca ccc att gga aga cca ccg ttc aga cct gtt tgc aat576Pro Arg Pro Pro Pro Ile Gly Arg Pro Pro Phe Arg Pro Val Cys Asn180 185 190gca tgc tac aga ctt tcc gtc tca gat gct cgc aat tgc tgc atc aag624Ala Cys Tyr Arg Leu Ser Val Ser Asp Ala Arg Asn Cys Cys Ile Lys195 200 205ttc gga agc tgt tgt cac tta gta aaa gga taa657Phe Gly Ser Cys Cys His Leu Val Lys Gly210 2152102211218212PRT213重組DNA4002Met Ser Asp Lys Ile Ile His Leu Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr Asp1 5 10 15Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile Leu Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp20 25 30Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala Pro Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp35 40 45Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val Ala Lys Leu Asn Ile Asp Gln Asn50 55 60Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu Leu65 70 75 80Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu Ser85 90 95Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu Asp Ala Asn Leu Ala Gly Ser Gly100 105 110Ser Gly His Met His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro115 120 125
Arg Gly Ser Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln130 135 140His Met Asp Ser Pro Asp Leu Gly Thr Asp Asp Asp Asp Lys Ala Met145 150 155 160Ala Asp Ile Gly Ser Glu Phe Tyr Arg Gly Gly Tyr Thr Gly Pro Ile165 170 175Pro Arg Pro Pro Pro Ile Gly Arg Pro Pro Phe Arg Pro Val Cys Asn180 185 190Ala Cys Tyr Arg Leu Ser Val Ser Asp Ala Arg Asn Cys Cys Ile Lys195 200 205Phe Gly Ser Cys Cys His Leu Val Lys Gly210 215
序列表2SEQUENCE LISTING110武漢大學120一種表達重組對蝦肽Pen24的基因工程菌株及應用130一種重組對蝦肽Pen24胺基酸序列1601170PatentIn version 3.12101211218212PRT213重組蛋白質4001Met Ser Asp Lys Ile Ile His Leu Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr Asp1 5 10 15Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile Leu Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp20 25 30Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala Pro Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp35 40 45Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val Ala Lys Leu Asn Ile Asp Gln Asn50 55 60Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu Leu65 70 75 80Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu Ser85 90 95Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu Asp Ala Asn Leu Ala Gly Ser Gly100 105 110Ser Gly His Met His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro115 120 125Arg Gly Ser Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln130 135 140His Met Asp Ser Pro Asp Leu Gly Thr Asp Asp Asp Asp Lys Ala Met145 150 155 160Ala Asp Ile Gly Ser Glu Phe Tyr Arg Gly Gly Tyr Thr Gly Pro Ile165 170 175Pro Arg Pro Pro Pro Ile Gly Arg Pro Pro Phe Arg Pro Val Cys Asn180 185 190Ala Cys Tyr Arg Leu Ser Val Ser Asp Ala Arg Asn Cys Cys Ile Lys195 200 205Phe Gly Ser Cys Cys His Leu Val Lys Gly210 21權利要求
1.一種基因工程表達、分離和純化的重組對蝦肽Pen24，其具有與序列表2所示胺基酸序列至少70％同源性的序列。
2.一種基因工程表達、分離和純化的重組對蝦肽Pen24，其具有與序列表2所示胺基酸序列至少80％同源性的序列。
3.一種基因工程表達、分離和純化的重組對蝦肽Pen24，其具有與序列表2所示胺基酸序列至少90％同源性的序列。
4.根據權利要求1或2所述的蛋白質，其特徵在於所述的蛋白質的分子量為24千道爾頓。
5.一種基因工程表達、分離和純化的重組對蝦肽Pen24，其具有與序列表1所示核苷酸序列至少50％同源性的序列。
6.一種基因工程表達、分離和純化的重組對蝦肽Pen24，其具有與序列表1所示核苷酸序列至少80％同源性的序列。
7.一種DNA片斷，其特徵在於包括如權利要求5或6所述的核苷酸序列。
8.一種基因工程菌株，其特徵在於包含如權利要求5或6所述的核苷酸序列。
9.一種表達重組對蝦肽Pen24基因工程菌株，其特徵在於所述的菌株是基因工程菌株E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)，CCTCC NoM206003。
10.一種表達重組對蝦肽Pen24的基因工程菌株的構建方法，它包括下列步驟A、美白對蝦總RNA的提取及cDNA第一條鏈的合成採集南美白對蝦血淋巴，獲得血細胞，提取總RNA，並按Promega公司Universal Riboclone cDNASynthesis System試劑盒操作手冊進行，反轉錄合成cDNA第一條鏈；B、PCR擴增Penaeidin-2基因以反轉錄合成的cDNA第一條鏈為模板，上遊引物P15′GAATTCTACAGGGGCGGTTACACA 3′；下遊引物P23′GTGAATCATTTTCCTATTTTCGAA 5′，利用PCR儀擴增，獲得168bp目的基因；C、重組質粒pGEM-T/Pen的構建和鑑定回收PCR產物，將PCR產物連接到pGEM-T載體上，轉化E.coli JM109感受態細胞，塗布於含X-gal、IPTG和Amp抗性的LB平板上進行藍白斑篩選，用PCR和限制性內切酶酶切鑑定、DNA測序分析鑑定重組質粒pGEM-T/Pen；D、重組表達質粒pET-pen的構建和鑑定用EcoR I、Hind III分別雙酶切表達載體pET-32a(+)和重組子pGEM-T/Pen質粒DNA，將Penaeidin-2基因定向插入表達載體pET-32a(+)，獲得重組表達質粒pET-pen，轉化E.coli Origami B(DE3)pLysS感受態細胞獲得大腸桿菌重組基因工程菌株E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)，用PCR和限制性內切酶酶切鑑定、DNA測序分析鑑定重組表達質粒pET-pen。
11.重組對蝦肽Pen24在抗細菌感染中的應用。
12.重組對蝦肽Pen24在抗真菌感染中的應用。
13.重組對蝦肽Pen24在抗病毒感染中的應用。
14.重組對蝦肽Pen24作為防腐劑在化妝品中的應用。
15.重組對蝦肽Pen24作為防腐劑在食品中的應用。
16.重組對蝦肽Pen24作為防腐劑在動物飼料中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種表達重組對蝦肽Pen24基因工程菌株及應用，編碼該Pen24的核苷酸和胺基酸序列，表達重組對蝦肽Pen24的基因工程菌株E.coliOrigamiB(DE3) pLysS(pET－pen)，CCTCC NoM206003，利用工程菌株表達重組對蝦肽Pen24。Pen24對革蘭氏陽性細菌、陰性細菌；抗氨苄青黴素的大腸桿菌和強致病性細菌，如枯草芽孢桿菌、蘇雲金芽孢桿菌和綠膿桿菌等均有很好的抗菌活性。Pen24對病毒感染具有明顯的抗病毒活性。Pen24在治療或預防動物和植物的細菌、真菌和病毒病中的應用，作為防腐劑在化妝品、食品和動物飼料中應用。
文檔編號C12N1/21GK1896238SQ20061001936
公開日2007年1月17日 申請日期2006年6月15日 優先權日2006年6月15日
發明者徐進平, 孟小林, 王健, 魯偉, 付百玲 申請人:武漢大學