用於生產脂質體的方法

2023-11-11 16:29:07 1

用於生產脂質體的方法
【專利摘要】本發明公開了一種通過使用脂質粉末的水溶液的高剪切混合形成脂質體的方法；脂質粉末可以通過任意已知的技術來生產。脂質體的組分包括但不限於陽離子脂質、免疫刺激劑/免疫增強劑和作為用於形成脂質體的組分的大分子。所公開的方法描述了一種通過高剪切混合配製單獨的穩定脂質體或複合了具有高濃度的帶與脂質體相反的電荷的大分子比如蛋白質、DNA和RNA的穩定脂質體的方法，其中歸因於配製方法，避免了聚集。
【專利說明】用於生產脂質體的方法
發明領域
[0001]本發明涉及脂質體生產及製劑。尤其，本發明涉及陽離子脂質體的生產和配製，這是通過可由不含有機溶劑的方法(超臨界流體技術(fx critical fluid technologies))得到的脂質粉末和高剪切混合的獨特組合，藉此在過程期間沒有使用有機溶劑下，將脂質體組分混合且配製成穩定的脂質體。在治療和預防醫學中，脂質體可以用作抗原組分的佐劑或用作藥物遞送系統。尤其，本發明涉及用於免疫的在水介質中的疫苗的佐劑。
[0002]發明背景
[0003]術語脂質體是用於由封閉含水區室(aqueous compartment)的脂質雙層組成的囊泡的廣泛定義。膜形成脂質是兩親的且因此包含極性和非極性區域。極性區域通常由磷酸酯基團、酸性基團和/或叔胺或季銨鹽組成，且在生理PH下可以具有淨的負表面電荷(陰離子)、中性表面電荷或正表面電荷(陽離子)，這取決於脂質頭基(head group)的組成。非極性區域通常由具有≤8個碳的一個或多個脂肪酸鏈和/或膽固醇(cholesterol)組成。構成囊泡雙層膜的脂質被排布(organized)，使得非極性的烴「尾部」指向雙層的中心，而極性的「頭部」分別朝向水相內部和水相外部。
[0004]獲得均勻的脂質體的一種方法涉及使磷脂溶解在有機溶劑中，其然後被蒸發至乾燥，在試管內部留下薄的脂質膜(Bangham等，1965)。幹的脂質膜然後在適量的水相中水化，且混合物被加熱至高於脂質/脂質混合物的相轉變溫度Tm且脂質膜被允許「膨脹」。通過振動試管來分散得到的通常由多層囊泡(Multilamellar Vesicles) (MLV)組成的脂質體。這種製備為通過例如超聲處理(Papahadjopoulos等，1967)或如Cullis等在美國專利第5，008, 050號中描述的擠出的方法生產單層囊泡(UV)提供了基礎。
[0005]用於製備小囊泡的其它技術為由Szoka和Papahadjopoulos介紹的反相蒸發法(Szoka和Papahadjopoulos，1978 ;美國專利第4，235，871號)。這種技術包括在有機溶劑和待包封的(encapsulated)物質的緩衝水溶液中形成脂質的油包水乳液。在減壓下除去有機溶劑產生粘性凝膠。當這種凝膠崩解(collapse)時,形成脂質囊泡的水懸浮液。
[0006]通過用於包封不具有對脂質體的強的親和力的水溶性化合物例如蛋白質的復乳法(double emulsion method)來製備憐脂的脂質體被Schneider描述在US4, 008, 801和US4, 224，179中。具有包含化合物的脂質體的乳液是通過復乳法製備的:使小體積的具有水溶性的化合物比如蛋白質抗原和/或免疫刺激劑(immunostimulator)的水溶液與較大體積的具有溶解的磷脂的有機溶劑混合。所形成的乳液與較大體積的水溶液混合且用氣流除去有機溶劑。
[0007]Carmona-Ribeiro 和 Chaimovich (Ribeiro 和 Chaimovich, 1983)所描述的方法涉及向緩衝水溶液注入期望脂質的例如氯仿、甲醇、乙醇的有機溶液，其中當溶劑蒸發時脂質自發地形成脂質體。在近些年中已經評估了用於脂質體的大規模生產的乙醇注射方法(Wagner2006, Justo2010)，且這種製造方法被判斷為對於大規模生產比例如磷脂膜方法更可行。
[0008]已知幾種從有機溶劑溶液獲得均勻的脂質粉末的方法，比如冷凍乾燥、噴霧乾燥、溶劑蒸發(Mehnert和Mader，2001 )。在這些方法中，其中溶解了脂質的有機溶劑是通過所描述的技術來除去的。由於許多方法在藥物產品中留下了殘餘的溶劑，因此有機溶劑的使用具有若干缺點。而且，在大規模生產上(on upscaling),對於人員和環境問題,需要非常注意。同時，已經考察了用於製造脂質粉末的熱或冷均化方法(Mehnert和Mader, 2001)。
[0009]在近些年中，可選擇地，已經通過超臨界流體方法來生產脂質粉末，方法被開發用於生產不溶於水的藥物的穩定懸浮液(Badens等,2001, Cape等,2008)。超臨界流體方法利用處於其超臨界狀態的壓縮氣體例如CO2作為一些方法中的溶劑或作為其它方法中的反溶齊[I (ant1-solvent) (Pasquali等,2008)。這可以有助於通過經由從其中化合物被液化或溶解/部分溶解的超臨界溶液中快速膨脹使不溶於水的化合物沉澱，或通過應用經由將化合物的溶液噴到壓縮氣體、液體或超臨界流體中的反溶劑方法，來製備亞微顆粒。對於生產磷脂囊泡，該方法是公知的(W09714407、US5, 554，382、W02010004287)。最經常地，應用有機溶劑或添加的共溶劑。
[0010]已經考察了直接從超臨界CO2溶液中製造的用於包封(61103口811131:；[011)的脂質體，其應用乙醇作為由磷脂和膽固醇組成的脂質體的共溶劑(Frederiksen等人，1997)。
[0011]已經考察了製造脂質體包載/包封的物質比如大分子、DNA/RNA、酶、蛋白質、肽和激素的技術。脂質體包載技術的一個實例是脫水-再水化程序(Gregoriadisl987、1993、1999，Kirby等，1984，Zadi, 2000)0在這個方法中，脂質體是通過例如上文所述的脂質膜水化方法來進行的，其中在脫水-再水化方法之前除去所應用的有機溶劑。脂質膜通過使用水/緩衝液來形成「空的」脂質體，或可選擇地通過使用含有待包封的物質的水溶液來水化。水化程序可以通過已知的技術來完成，比如通過加熱水溶液直至高於脂質組分的相轉變溫度Tm且以一定間隔旋轉混合。隨後，冷凍乾燥脂質體製劑，且然後在高於脂質的凝膠-液晶轉變溫度的控制條件下，首先用少量的水或含有物質的溶液再次水化，之後稀釋至最終體積。產生的脫水-再水化囊泡(DRV)可以通過微流化至合適的尺寸來處理，且通過色譜、離心步驟等除去剩下的未 包載的物質。然而，包載後的尺寸減少趨向於導致較低的包載載量(entrapment load)和效率。
[0012]然而，所有這些方法都包括了有機溶劑/共溶劑的使用。由於已知很多有機溶劑是致癌的和/或對中樞神經系統具有損傷效應，因此重要的是，減少在人用的藥物產品中的殘餘的有機溶劑的含量，且證明(document)留在藥物產品中的痕量沒有超過可容忍的藥典水平。而且，有機溶劑在生產中的使用導致了大量的這些化合物被丟棄。因此，存在著在使用有機溶劑時應遵守的許多規章和條例，這使得生產過程較為複雜化。使用現今所用的防護配件和設備，最小化人員的暴露且維持高標準的工作環境是可能的。因此，現今當局更為關注的是對於外部環境的暴露。當揮發性的組分比如有機溶劑通過抽吸從工作環境移除到外部環境時，那些這些溶劑可以引起空氣中的光化學汙染物比如臭氧或煙霧的形成。因此，新的政府舉措包括限制來自工業的空氣汙染物的指南。這個指南包括保持揮發性有機組分的非常精確的平衡，因此必須登記進入和出去的每一種物品。這使得在現代工業中採用有機溶劑的工作是非常耗時且昂貴的。在本發明中，不含有機溶劑的生產方法的使用因此是高度有利的。
[0013]在最近幾十年中，已經廣泛研究了脂質體作為疫苗遞送系統和佐劑的應用。陽離子脂質體是用於疫苗抗原的最有效的脂質體遞送系統且是比其它脂質體系統更有效力的免疫增強劑的脂質體遞送系統。然而，儘管一些證據表明陽離子脂質體本身可以改進針對共同施用的疫苗抗原的免疫應答，但是它們的主要功能是保護抗原不在體內清除且將抗原遞送至專門的抗原呈遞細胞(Christensen等,2007)。最近的研究表明，對於疫苗在注射部位處的保留，陽離子電荷是重要的因素，使得天然免疫細胞的延長的抗原呈遞和天然免疫細胞的延長的免疫刺激成為可能(Henriksen-Lacey等,2010)。此外，陽離子脂質體可以用於引入免疫刺激劑，以以所需方向增強且調節的免疫應答，且因此在設計用於特定疾病祀標的特製(tailor-made)的佐劑時,提供了有效的工具(Christensen等,2007)。構成脂質體的陽離子活性劑組分可以包括表面活性劑如二甲基雙十八烷基銨(DDA)、3-[N-(N』，N』 -二甲基氨基乙烷)_氨基甲醯基]膽固醇(DC-Chol)、l，2-醯基-3-三甲基銨-丙烷(DxTAP)、N-[1-(2，3-醯氧基)丙基]-N，N，N-三甲銨(DxTMA)、醯氧基(乙基-2-醯基-3-羥乙基)咪唑啉鎗(DxTIM)、1, 2-醯基-甘油基-3-乙基磷酸膽鹼(DxEPC)、3-十四烷基氨基 _ 叔丁基 _N_ 十四烷基丙脈(3-tetradecylamino-tert-butyl-N-tetradecylpropion-amidine) ( 二 C14-脒)、N-棕櫚醯基-D-鞘氨氧基(erythrospingosyl) -1-0-氨基甲醯基精胺(CCS)和二甲基二醯基銨(DDxA)，其中X代表具有不同的鏈長度的醯基鏈比如:月桂醯(C12)、肉豆蘧醯(C14)、棕櫚醯基(C16)、硬脂醯基(C18)、二十烷醯基(C20)和山嵛醯基(C22)。
[0014]這些脂質體的免疫原性(immunogenicity)可以通過包含所謂的模式識別受體(PRR)的免疫刺激配體(又稱免疫增強劑)來增強，所謂的模式識別受體(PRR)識別已知為病原體相關分子模式(PAMP)的保守分子結構。PAMP調節先天免疫應答且因此調節隨後的適應性應答的能力可以被有利地開發，用於疫苗。PRR包括C型凝集素受體、核苷酸結合寡聚化結構域(NOD)蛋白質和常生 Toll 樣受體(ever-growing toll-like receptor) (TLR)家族。PAMP在病原體之間變化且包括分子比如索狀因子(TDM)、鞭毛蛋白、脂多糖(LPS)、肽聚糖及幾種核酸變體，比如胞嘧啶:磷酸酯:鳥嘌呤(CpG)寡聚脫氧核苷酸和雙鏈核糖核酸(dsRNA)。多年來，已經開發了受PAMPS啟發的許多免疫刺激劑。這些包括海藻糖二山箭酸酯(trehalose dibehenate) (TDB)、合成的單分枝酸基甘油(monomycolyl glycerol)(MMG)、單磷醯脂質A(MPL)、聚肌苷酸:聚胞苷酸(聚(1:C))。對於開發疫苗佐劑，脂質體和這些PAMP/免疫刺激劑的組合是一種有吸引力的方法，因為脂質體不僅遞送疫苗抗原，而且遞送PAMP/免疫刺激劑至抗原提呈細胞，從而增強免疫應答。
[0015]已經提出了誘導細胞介導的免疫應答的多種佐劑，但是總體上沒有任何佐劑對所有的方面都是理想的。
[0016]一種對促進細胞介導的免疫應答特別有效的佐劑類型是季銨化合物類，例如二甲基雙十八烷基銨(DDA)。DDA是合成的兩親物，其包括親水的帶正電的二甲基銨頭基和兩個長的疏水烷基鏈。在水環境中，DDA分子自組裝以形成類似於由天然磷脂形成的脂質體的泡狀雙層。從文獻中已知DDA與其它免疫增強劑的組合。
[0017]不幸地，兩親的季銨化合物例如單獨的DDA的懸浮液是物理學不穩定的，並且在4°C下的延長的儲存而沒有聚集和沉澱的發生是不可能的。由於沉澱將會妨礙製劑的臨床使用，因此DDA製劑穩定性的缺乏目前已經是在人中進行任何應用的主要障礙。
[0018]已經設想了用來穩定兩親的季銨化合物的懸浮液的若干方式。這些方式包括使用例如聚乙二醇(PEG)、糖脂(比 如TDB)和聚合物來穩定雙層。W02006002642公開了物理學穩定的脂質體製劑。該文件涉及通過將糖脂結合到脂質雙層中來立體穩定陽離子脂質體以及脂質膜的增加的水化。穩定的脂質體可以用作抗原組分的佐劑或用作藥物遞送系統。尤其，該文件涉及用於免疫的在水相中具有佐劑的疫苗，其中最終產品是穩定的且不含有機溶劑。
[0019]此外，W02006002642公開了糖脂之外的其它免疫增強劑例如聚(1:C)和CpG向囊泡製劑的添加，然而未提出如何將這些進一步的組合製成穩定的製劑，因為這些免疫增強劑的結合使得製劑不穩定。然而，免疫增強劑和/或抗原向穩定製劑的進一步添加可造成不穩定。尤其，因為高度帶電的聚合電解質與帶相反電荷的脂質體的結合促進了脂質雙層膜的自身不穩定性的事實，聚陰離子如(聚(1:C))難以配製到陽離子脂質體和脂質體佐劑。電荷的中和與外部表面積的伴隨的減少在雙層正常方向中產生側向壓力的梯度。這產生彎矩(bending moment),其反過來導致脂質體不穩定，引起較大聚集物隨時間過去而形成、寬的尺寸分布及結構不均勻性，導致脂質體的沉澱。
[0020]存在用於使寡核苷酸、肽或蛋白質結合/複合脂質體中或與脂質體結合/複合的在文獻中描述的幾種方法，其中在用有機溶劑結合/複合之前已經製備了脂質體。在一種方法中，存在於水相中的寡核苷酸、肽或蛋白質通過冷凍乾燥被部分地包載，之後重新水化凍幹的脂質體(Kirby 和 Gregoriadis, 1984)。
[0021]可選擇地,肽或蛋白質通過使用由Pick(Pick, 1981)和由Bally等在美國專利第4，975，282號中描述的冷凍和融解技術來結合。在這種技術中，通過上述方法生產的預先形成的囊泡與肽或蛋白質混合，並且在液氮中反覆地迅速冷凍和加熱到相關脂質的相轉變溫度Tm以上的溫度。由於這種方式應用了預先形成的脂質體，用於生產此類脂質體的上述方法也應用到這裡，例如有機溶劑的使用和在規模化方法時的困難，比如快速冷凍較大的批料。
[0022]對於使用有機溶劑和復乳法使高濃度的親水陰離子化合物例如聚陰離子如聚(I:C)吸附到季銨化合物的陽離子脂質的脂質體的最近的實例被描述在(Nordly等，2011)中。
[0023]本發明公開了一種通過不含有機溶劑的方法從脂質粉末，優選地從不含有機溶劑的方法中得到的脂質粉末中製造和配製陽離子脂質體的方法。本發明還公開了用來配製具有添加的聚陰離子免疫增強劑的穩定的陽離子脂質體的方法。
[0024]發明概述
[0025]本發明公開了一種通過使用高剪切混合，通過脂質粉末的再水化而沒有使用有機溶劑來形成脂質體的新方法，所述脂質粉末可優選地在沒有有機溶劑或共溶劑的使用下獲得。本發明使用超臨界流體技術，以產生均勻的脂質粉末，但脂質粉末可通過其它已知的技術來生產。脂質體的組分包括但不限於陽離子脂質、免疫刺激劑/免疫增強劑和作為用於形成脂質體的組分的大分子。
[0026]本發明公開了一種用於通過高剪切混合，配製單獨的穩定脂質體或複合了高濃度的帶與脂質體相反電荷的大分子比如蛋白質、DNA和RNA的穩定脂質體的方法，其中由於所公開的配製方法，聚集被避免了。
[0027]本發明還公開了這些複合有聚陰離子免疫刺激劑的穩定脂質體作為疫苗佐劑的用途。[0028]發明詳述
[0029]本發明公開了一種用脂質粉末在水溶液中的高剪切混合來生產脂質體的方法。
[0030]水溶液可以是純水或包含緩衝液、鹽、糖、大分子、酸、鹼、胺基酸、肽、蛋白質等的水溶液。溶液的pH可以在pHl-14，優選地pH5-9，且最優選地pH6-8之間。
[0031 ] 在本發明的優選實施方式中，脂質粉末是通過超臨界流體方法來生產的。
[0032]優選的脂質粉末是均勻的混合物，其中一種脂質組分是季銨化合物，例如其中季銨化合物為二甲基雙十八烷基銨(DDA)、或二甲基雙十八烯基銨(D0DA)、或1，2_ 二油酸基_3_ 二甲基銨丙烷(D0TAP)、1，2- 二肉蘧酸基-3- 二甲基銨丙烷、I, 2- 二掠櫚酸基-3-三甲基銨丙烷、I, 2- 二硬脂醯基-3-三甲基銨丙烷和二油醯基-3- 二甲基銨丙烷(DODAP)、N-[l-(2, 3- 二油醯氧基)丙基]-N，N，N-三甲基銨(DOTMA)、十八烯醯氧基(乙基-2-十七烯基-3-羥基乙基)咪唑啉鎗(DOTIM)、I, 2- 二油烯基-sn-甘油基-3-乙基磷酸膽鹼(DOEPC)和3-十四烷基氨基-叔丁基-N-十四烷基丙脒(二 C14-脒)。
[0033]本發明的脂質體還可以包括中性脂質比如磷脂；穩定化糖脂，比如a，a '-海藻糖6，6' -二山嵛酸酯(TDB)或單分枝醯基甘油(MMG)或其合成類似物；免疫增強劑，比如C型凝集素受體、核苷酸結合寡聚化結構域(NOD)蛋白質及toll樣受體(TLR)家族，比如索狀因子(TDM)或合成類似物TDB，鞭毛蛋白，脂多糖，肽聚糖或核酸變體，比如胞嘧啶:磷酸酯:鳥嘌呤(CpG)寡聚脫氧核苷酸和雙鏈核糖核酸(dsRNA)如聚肌苷酸:聚胞苷酸(聚(1:C))。
[0034]在另外的實施方式中，應用高剪切混合程序和控制的添加包含待與脂質體複合的物質的溶液，所生產 的脂質體與大分子比如寡核苷酸、肽、蛋白質、碳水化合物和/或脂質複合。高剪切混合可以基於其中轉子的旋轉速度為至少3.400rpm的轉子-定子原理。其它高剪切混合技術包括但不限於均化和擠出。
[0035]通過所述方法生產的脂質體可以用於佐劑、遞送系統、藥物或藥妝品的製造。
[0036]在應用氧化敏感的組分如磷脂、不飽和脂肪酸或在應用對氧化、脫氨基等敏感的活性藥物成分的情況下，在本發明中的所有步驟易於在惰性氣氛下處理。
[0037]本發明還公開了被穩定以用作疫苗佐劑的脂質體產品，其中疫苗可以針對任意的疾病比如流感、鏈球菌、結核病、糖尿病、癌症、瘧疾、衣原體等。
[0038]通過本發明的方法製造或穩定的脂質粉末或脂質體可以在藥學上用於注射，用於遞送系統、局部應用、皮膚內應用、鼻內應用、肺應用或應用在其它製劑中，比如但不限於化妝品。
[0039]定義
[0040]「脂質粉末」被定義成組成脂質粉末製劑的脂質混合物的乾燥的微粒材料。對於脂質粉末進一步用於脂質體製造，脂質粉末為製劑的脂質的均勻混合物是期望的。
[0041]「脂質體」被定義成由一個或多個脂質雙層圍繞著水性核心(aqueous core)構成的封閉的囊泡結構。每個脂質雙層由兩個脂質單層體組成，每個單層體具有一個疏水的「尾部」區域和一個親水的極性「頭部」區域。在脂質雙層中，脂質單層體的疏水「尾部」朝向雙層內部，而親水「頭部」朝向雙層外部。脂質體可具有多種物理化學性質，例如尺寸、脂質組成、表面電荷、流動性及雙層膜的數量。根據脂質雙層的數量，脂質體可歸類為包括單個脂質雙層的單層囊泡(UV)或小的單層囊泡(SUV)，或包括每一個通過水層與另一個分開的兩個或更多個同心的雙層的多層囊泡(MLV)。水溶性化合物被包載入脂質體的水相/核，相反地，親脂性化合物被包載入脂質雙層膜的核/中心。
[0042]術語「陽離子脂質」意圖包括具有疏水且極性的頭基部分，在生理可接受的pH下具有淨正電荷，並且可以在水中形成雙層囊泡或者膠束(micelle)的任意的兩親脂質，包括天然的及合成的脂質和脂質類似物。
[0043]用於本發明的陽離子脂質一種特別優選的類型是具有通式NR1R2R3R4-X的季銨化合物，其中R1和R2各自獨立地是包含從I至3個碳原子的短鏈烷基，R3獨立地是氫或者甲基或者包含從12至20個碳原子，優選從14至18個碳原子的烷基，且R4獨立地是包含從12至20個碳原子，優選從14至18個碳原子的烴基。X是藥物上可接受的陰離子，其本身無毒性。這樣陰離子的實例為滷素陰離子，例如氯離子、溴離子和碘離子。還可使用無機陰離子例如硫酸根和磷酸根，或者由簡單的有機酸如乙酸衍生的有機陰離子。R1和R2基團可以是甲基、乙基、丙基和異丙基，而R3可以是氧、甲基或者十二烷基、十二烷基、十四烷基、十五烷基、十TK烷基、十七烷基、十八烷基、十九烷基和二十烷基(eicocyl), R4可以是十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基、十九烷基和二十烷基。然而其它C12-C2tl烴基也是可能的，因為儘管R3和R4基團優選是飽和的，且無分支側鏈，但是它們在較少程度上可以帶有支鏈，例如甲基和乙基側鏈。R3和R4還可以具有較少的不飽和度，例如每一個包含I至3個雙鍵，但是優選地，它們是飽和的烷基。
[0044]陽離子脂質最優選二甲基雙十八烷基溴化銨或氯化銨(DDA-B或DDA-C)，或者其硫酸鹽、磷酸鹽或者乙酸鹽(DDA-X);或者二甲基雙十八烯基溴化銨或氯化銨(D0DA-B或D0DA-C)，或者其硫酸鹽、磷酸鹽或者乙酸鹽化合物(DODA-X)。
[0045]其它優選的 陽離子脂質為1，2-二油醯基-3-三甲基銨丙烷(DOTAP)、1，2-二肉豆蘧醯基_3_ 二甲基銨丙烷、1，2- 二棕櫚醯基-3- 二甲基銨丙烷、1，2- 二硬脂醯基-3- 二甲基銨丙烷和二油醯基-3-二甲基銨丙烷(DODAP)、N-[l-(2，3-二油醯氧基)丙基]-N，N，N-三甲基銨(DOTMA)、十八烯醯氧基(乙基-2-十七烯基-3-羥基乙基)咪唑啉鎗(DOTIM)、1，2-二油烯基-sn-甘油基-3-乙基磷酸膽鹼(DOEPC)和3-十四烷基氨基-叔丁基-N-十四烷基丙脒(二 C14-脒)。
[0046]烷基鏈是指可以是直鏈的或支鏈的脂肪族烴鏈。鏈可以是飽和的，或其可以包含一個或多個雙鍵，例如為不飽和的。
[0047]醯基鏈稱為烷基-OC(O)基團，其中烷基如之前所描述的。
[0048]脂肪酸鏈是指支鏈的或無支鏈的、飽和的或不飽和的烷基或醯基的烴鏈。
[0049]術語藥學上可接受的是指不會干擾有效成分的效力或者生物活性且對主體或患者沒有毒性的物質。
[0050]用於本發明的相轉變溫度或Tm是一種溫度，在此溫度下脂質體雙層從較低溫度的凝膠相物理地變成高溫流體相，較低溫度的凝膠相以有序的脂肪酸鏈(有序的固體相)為特徵，在高溫流體相中脂肪酸鏈具有高度的構象無序(液體無序相)，如通過差示掃描量熱法(DSC)測量的。
[0051]通過將糖脂結合到脂質體膜中來穩定陽離子脂質體。結合是指將分子的疏水區域和親水區域包埋在膜、膠束、脂質體或雙層的相應的疏水和親水的區域或部分中的程序。將糖脂結合到脂質體中的程序可以是「薄膜方法」、「反相蒸發方法」和「有機溶液注射方法」，以及將來的目前未知的具有將糖脂結合到脂質體膜中的相同效果的方法。所有目前已知的方法在發明章節的背景中提及。
[0052]糖脂被定義成包含通過糖苷鍵與疏水部分例如長鏈脂肪酸、醯基甘油、鞘氨醇(sphingoid)、神經醯胺或異戊二烯磷酸酯結合的一個或多個單糖或甘油殘基的任何化合物。本發明的糖脂可以是合成來源的、植物來源的或微生物來源的，例如來自分枝桿菌。
[0053]用於本發明的一類糖脂是醯化(或烷基化)的糖苷，其包括與一個、兩個或甚至三個脂肪酸酯化的一個或兩個糖殘基。脂肪酸可以是直鏈的，包括飽和脂肪酸例如肉豆蘧酸C14:0、十五烷酸C:15、棕櫚酸C16:0、十七烷酸C17:0、硬脂酸(steric acid)C18:O、十九烷酸C: 19、二十烷酸C:20、二十一烷酸C21:0、二十二烷酸C:22，以及不飽和脂肪酸例如油酸C18: ln-9、亞油酸18:2n-6 ;或複雜的支鏈脂肪酸例如黴菌酸、甲氧基黴菌酸、酮基黴菌酸、環氧黴菌酸和棒狀桿菌分支菌酸(corynomycolic acids)。糖殘基可以是簡單的單糖例如葡萄糖和果糖，或含有兩個共價鍵接的單糖的二糖，例如由葡萄糖和果糖組成的蔗糖和其中兩個葡萄糖單元通過糖苷鍵連接的海藻糖。用於本發明的一類糖脂是從分枝桿菌分離的細胞壁糖脂，其包括與一個、兩個或三個正十六烷酸C16:0、油酸C18: ln-9、亞油酸18: 2n-6，或複雜的羥基支鏈脂肪酸即在60至90個碳原子的長度範圍內的黴菌酸殘基酯化的二糖。用於本發明的其它細菌糖脂具有較短的脂肪酸鏈，例如從棒狀桿菌、諾卡氏菌中分離的棒狀桿菌分支菌酸(22-36個碳)或者諾卡氏分枝黴菌酸(nocardomycolic acid)(44-60個碳)。優選的分枝桿菌糖脂是常稱作索狀因子的a，a ' _海藻糖6，6' -二黴菌酸酯(TDM)，它是分枝桿菌細胞壁的最重要的免疫調節組分之一。在特別優選的實施方案中，糖脂包括與兩個二十二烷脂肪酸(山嵛酸)酯化的二糖a，a '-海藻糖，例如為TDM的純合成類似物的a，a '-海藻糖6，6' -二山嵛酸酯(TDB)。另外優選的分支桿菌糖脂是單分枝醯基甘油，或優選地合成類似物3-羥基-2-十四烷基-十八烷酸2，3- 二羥基丙酯或具有較短或較長的 醯基骨架的密切相關的化合物。
[0054]用於本發明的其它類型的糖脂包括但不限於:基於甘油的糖脂:這些脂質包括與甘油的羥基糖苷鍵連接(linked glycosidically)的單糖或寡糖部分,所述甘油可用一個或兩個脂肪酸醯化(或者烷基化)。而且，這些糖脂可以是不帶電荷的且因此通常被稱為中性甘油糖脂，或者可以包含硫酸根或磷酸根。這種類型的優選糖脂為單分枝醯基甘油(MMG)(Andersen等2009a, Andersen等2009b )或其合成類似物，比如3-羥基-2-十四烷基-十八烷酸-2，3- 二羥基丙酯或具有較短或較長的醯基骨架的密切相關的化合物(Andersen等2009b, Nordly 等 2011)。
[0055]基於神經醯胺的糖脂:根據碳水化物部分的結構，鞘糖脂(glycosphingolipid)被分為含有未取代的糖基的中性鞘糖脂和含有帶有酸性的羧基、硫酸根或磷酸根的糖基的酸性鞘糖脂。
[0056]脂多糖(LPS):這些複雜的化合物是在革蘭氏陰性細菌的細胞壁中發現的內毒素的抗原(S-脂多糖)。脂質部分(脂質A)通過糖苷鍵與多糖形成複合物。脂質A包括在氨基葡萄糖I的I位和氨基葡萄糖II的4位具有2個磷酸酯基團的b-1，6-氨基葡萄糖-氨基葡萄糖(b-1, 6-glucosaminyl-glucosamine)主鏈。氨基葡萄糖II的3位與長鏈多糖形成酸不穩定的(acid-labile)糖苷鍵。用羥基化的脂肪酸如羥基肉豆蘧酸酯(鍵合兩個酯且鍵合兩個醯胺)和常規的脂肪酸(月桂酸酯)來取代其它基團(在埃希氏菌中)。本發明特別優選的脂多糖是脂質A的單磷醯基衍生物(MPL)，其是無毒的且具有優良的佐劑性能。[0057]留醇類的糖苷:此家族包括與一留醇分子的羥基鍵合的一碳水合物單元。確定甾醇部分包括多種留醇:膽固醇、菜油留醇、豆留醇、谷留醇、菜子留醇和二氫谷留醇。糖部分包括葡萄糖、木糖和甚至阿拉伯糖。
[0058]脂肪酸或脂肪醇的糖苷:許多簡單的糖脂發現於細菌、酵母和低等有機體(海綿)中。這些化合物包括與脂肪醇或羥基脂肪酸的一個羥基鍵合或者與脂肪酸的一個羧基鍵合(酯鍵)的糖基部分(一個或幾個單元)。這些化合物通常具有令人感興趣的物理或生物學性質。它們中的一些由於它們的洗漆劑性能(detergent properties),被工業化生產(燒基糖苷)。[0059]而且，糖脂例如TDB和MMG本身具有免疫刺激特性且可以以協同的方式與季銨化合物起作用，以增強免疫應答。而且，大分子例如寡核苷酸、肽或蛋白質抗原可以被包載在單層和多層脂質體的水相內。
[0060]免疫增強劑是指增強疫苗遞送系統和抗原的效果或與疫苗遞送系統和抗原協同地起作用以獲得免疫應答的任意組分。這種增強作用可以通過模式識別受體非特異性地或特異性地完成，模式識別受體包括但不限於c型凝集素受體、核苷酸結合寡聚化結構域(NOD)蛋白質和toll樣受體(TLR)。
[0061]物質的複合包括但不限於非共價結合，例如大分子與相同或相反帶電的脂質體的靜電相互作用、疏水引力。
[0062]大分子:大分子被定義成由連接到一起的許多較小的結構單元組成的非常大的分子，比如蛋白質；同時，複雜的和非常大的分子比如DNA和RNA被定義成大分子。術語被用於四種常規的生物聚合物(核酸、蛋白質、碳水化合物及脂質)，以及具有大的分子量的非聚合分子。本發明的大分子的使用中包括但不限於寡核苷酸、肽、蛋白質、碳水化合物及脂質。
[0063]本發明公開了在水化之前和在可能用於與其它大分子的隨後複合的水化後，脂質體的脂質組分比如陽離子型表面活性劑如DDA和糖脂如TDB的均勻混合。脂質組分與其它大分子(例如，寡核苷酸)的混合也可以在水化前完成，且在進行複合時具有高剪切混合。陽離子脂質和尤其是帶負電荷的大分子(例如，寡核苷酸)之間的複合物通常是熱力學不穩定的，導致較大的聚集物隨著的時間的過去而形成、寬的尺寸分布及結構不均勻。高度帶電的聚合電解質與帶相反電荷的脂質體的結合增強了膜本身的不穩定性。電荷的中和外部表面積的伴隨的減少產生在雙層正常方向中的側向壓力的梯度。這產生彎矩，其反過來引起脂質體的不穩定性。
[0064]生產脂質粉末
[0065]為乾燥的微粒材料的脂質粉末必須是製劑的脂質的均勻混合物。較不均勻的脂質粉末將導致較不穩定的且較不均勻的脂質體製劑。存在獲得均勻粉末的幾種已知的方式，比如冷凍乾燥、噴霧乾燥、溶劑蒸發，所有均為其中從脂質在有機溶劑中的溶液中除去有機溶劑的方法。由於許多方法在藥物產品中留下殘餘溶劑，因此有機溶劑的使用具有若干缺點。而且關於擴大規模時，重點在於人員及環境問題。
[0066]本發明公開了一種方法，其在從脂質原料到配製的陽離子脂質體或具有添加的聚陰離子免疫增強劑的配製的陽離子脂質體的整個脂質體製造過程期間避免了有機溶劑的使用。重點在於應用可以在沒有使用有機溶劑的情況下獲得的均勻的脂質粉末。均勻的粉末可以通過將進入的初始材料溶解、液化或熔化成均勻的共混物來獲得，其在從超臨界流體或從得到的熔化物的冷卻中固化時，得到可以被研磨至粉末的脂質粉末或固體脂質粉末。一種這樣的方法超臨界流體，例如超臨界C02。脂質在超臨界CO2中被液化/分散/溶解，這可保證脂質的均勻混合。產生的乾燥脂質粉末可通過包含脂質混合物的超臨界CO2的快速膨脹來獲得。以這種方式，獲得細微粒脂質粉末。
[0067]在本發明中實現均勻粉末的其它類型包括但不限於化合物的簡單熔化。在熔化過程例如攪拌或粒化期間或之後，這可使用或不使用壓力，使用或不使用有效的冷卻且使用或不使用機械攪拌來進行。
[0068]優選地，脂質粉末是通過使用超臨界流體技術來生產的，以產生均勻的脂質粉末，但任意的脂質粉末可以被用作脂質體生產的基礎材料。
[0069]生產脂質體
[0070]根據本發明， 在脂質粉末水化步驟期間使用高剪切混合(圖1)，以簡單的方式從脂質粉來配製脂質體，而沒有使用有機溶劑。這種高剪切混合方法可以用於複合與脂質體和帶相反電荷的大分子比如寡核苷酸、肽或蛋白質，得到穩定的脂質體-大分子複合物。
[0071]高剪切混合的結果是至少以下兩種物質的混合:不溶解在彼此中，難於溶解在彼此中，或彼此間沒有化學反應。兩個不互溶的物質的一個此類實例是將脂質水化到緩衝水溶液以形成脂質體。在高剪切混合期間，一種物質被分布遍及另一種物質。
[0072]高剪切混合的優選方法是基於轉子-定子(rotor-stator)原理。在此，以高的圓周速度轉動轉子。旋轉產生抽吸，這拉動介質至轉子中且然後在來自定子的齒的幫助下將其推動至外部。這確保了脂質體製劑和任意添加的免疫增強劑或其它物質的完全混合。穩定的脂質體和脂質體-大分子複合物是用從3400至40000rpm的旋轉速度來形成的；現今，旋轉速度被限制到約40000rpm，但是對於製備穩定的脂質體溶液，似乎沒有上限。在製造過程中，將溫度保持為低於沸點且高於5°C。
[0073]所用的其它類型的高剪切混合包括但不限於:均化，超聲及擠出。均化是通過脂質體或脂質體-大分子複合物的強烈共混來進行的。超聲被用於混合多層(微米級)囊泡且縮減(downsize)多層(微米級)囊泡的尺寸,所述多層囊泡是通過加熱且攪拌成小的(納米級)單層囊泡中來製造的。擠出被用於混合如上所製造的多層囊泡且縮減如上所製造的多層囊泡的尺寸，其中限定尺寸且均勻的脂質體是通過穿過聚碳酸酯膜的連續擠出來製備的。
[0074]在本發明呈現的方法被用於製造脂質體製劑和包括結合或封裝大分子和免疫調節劑的脂質體-單分子複合物。
[0075]使用本發明，可以形成穩定的脂質體製劑且尤其是脂質體-大分子複合物的穩定製劑。在本方法中，可以使具有對脂質體膜的化合物的靜電親和力的所有物質實際上結合。靜電親和力是在多種帶相反電荷的原子形成離子鍵時產生的在兩種或更多種化合物之間的親和力。製造的脂質體是具有高度正的]-電勢的陽離子。這導致物質的高的吸附程度，所述物質包括但不限於例如在生理PH下具有低於7.4的pi的大分子，因為它們帶負電荷且具有對帶正電荷的脂質體的靜電親和力。
[0076]通過本發明所呈現的方法形成的脂質體和脂質體-大分子複合物隨著時間的過去是非常穩定的。藥物製劑的穩定性是指在產品的貯存期限過程中製劑維持在限定的範圍內的能力。脂質體分散體展示化學及物理的穩定特徵。
[0077]化學穩定性涉及化學降解，而物理穩定性涉及系統的膠體穩定性。[0078]脂質體分散體的物理穩定性是通過囊泡間的相互作用來確定，其依賴吸引力和排斥力之間的平衡。膠體系統是通過排斥力即靜電排斥和立體排斥來穩定，這是由於在主體(bulk)中和在相互作用區域中的水之間的化學電勢的差。
[0079]本發明還呈現這些脂質體作為佐劑例如用於疫苗組合物中的應用。尤其，本發明涉及用於免疫的具有在水介質中的佐劑的疫苗，其中最終產品是穩定的。
[0080]佐劑是可增強其它化合物的效力或效價，但本身具有很少的藥理作用或不具有藥理作用的劑。佐劑還可以作為穩定劑或遞送系統起作用。佐劑是廣泛用於人的治療(humantherapies)中，比如廣譜的疫苗、聯合治療(其中使用多種藥物)、癌症治療例如化學治療、激素治療、放射治療、免疫治療和革G向治療，王要為小分子和大克隆抗體。在化妝品工業中，佐劑主要用於皮膚癌、光老化及在傷口癒合的區域內的藥妝品，但也可以用於其它應用中。佐劑還被用於農業中，例如用於動物保健和農業噴霧劑兩者中，以增強殺蟲劑、殺菌劑、除草劑、取食刺激劑等的性能。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0081]圖1通過高剪切混合製造的CAFOl脂質體的Cryo-TEM圖。製劑包含小的單層囊泡，如SUV或如多囊泡UV』 S。
[0082]圖2超臨界流體方法之前DDA和TDB作為單一組分原料的DSC分析。使用來自TAinstruments的微量熱計來測量。
[0083]圖3超臨界流體方法(RESS)生產的DDA/TDB脂質粉末(DDA:TDB比例為5: lw/w)的DSC分析。使用來自TA instruments的微量熱計來測量。對於沒有使用有機溶劑的方法，比較了超臨界流體方法期間的攪拌和沒有攪拌的影響。
[0084]圖4在標準的高壓釜中通過超臨界CO2方法製造的DDA/TDB脂質粉末(DDA: TDB比例為5: lw/w)的DSC分析。脂質粉末的峰明顯地區別於圖2所示的DDA和TDB原料的那些峰。使用來自TA instruments的微量熱計來測量。
[0085]圖5用高剪切混合再水化的DDA脂質體和CAFOl (DDA/TDB)脂質體的DSC溫度過程線(thermograph)。從30_55°C，以30°C /小時掃描，操作壓力為35psi。VP-DSC微熱量計(Microcal, Northhampton, MAX
[0086]圖6用高剪切混合再水化的CAFOl (DDA/TDB)脂質體的尺寸分布。尺寸分布是用來自 Malvern Instruments Ltd.,英國的 Malvern Zetasizer-Nano 來測量的。
[0087]圖7A)通過以 16000rpm(- ? -)、12000rpm和 24000rpm(- ▲-)的高剪切混合製備的CAFOl (DDA/TDB)脂質體的平均粒徑的時間進展(Time development)。脂質體被分散在調節至PH7.4的IOmM Tris緩衝液中。在6000rpm下製備的CAF01脂質體聚集到一定的程度，使得在71天後通過PCS進行進一步測量是不可能的。B)來自血液淋巴細胞的IFN-Y的釋放，所述血液淋巴細胞從用通過超聲或高剪切方法製備的CAF01 (DDA/TDB)中的2 ii g的Ag85B-ESAT-6/DDA/TDB免疫的C57BI/6j小鼠中分離。血液淋巴細胞是在第三次免疫的I周后分離的且用0.05,0.5和5 ii g/ml的Ag85B_ESAT_6體外再刺激。
[0088]圖8A)來自血液淋巴細胞的IFN-Y的釋放，血液淋巴細胞從用通過在6000、12000和24000rpm下的高剪切方法製備的CAF05(DDA/TDB/聚(1:C))中的5 y g的卵白蛋白來免疫的C57Bl/6j小鼠中分離。在第三次免疫後3周分離脾細胞(spleenocyte)，且用g/ml的卵白蛋白體外再刺激。B)用通過在6000、12000和24000rpm下的高剪切方法製備的CAF05 (DDA/TDB/聚(1:C))中的卵白蛋白三次免疫後的％SIINFEKL-陽性⑶8+T細胞(%SIINFEKL-positive CD8+T_cell)。在第三次免疫後3周分離脾細胞，且用5 y g/ml的SIINFEKL體外再刺激。
[0089]圖9A)來自血液淋巴細胞的IFN- y的釋放，所述血液淋巴細胞從用通過高剪切混合、DRV、凍融、復乳和超聲方法製備的CAF05 (DDA/TDB/聚(1:C))中的5 y g卵白蛋白來免疫的C57Bl/6j小鼠中分離。在第三次免疫後3周分離脾細胞，且用5 ii g/ml的卵白蛋白體外再刺激。B)用通過高剪切混合、DRV、凍融、復乳和超聲方法製備的CAF05 (DDA/TDB/聚(1:C))中的g卵白蛋白免疫三次後的％SIINFEKL-陽性⑶8+T細胞。
[0090]圖10用高剪切混合製造的H56-CAF01疫苗的尺寸分布。粒徑分布為148.7±0.6d.nm,用來自 Malvern Instruments Ltd.,英國的 Malvern Zetasizer-Nano 測量。
[0091]圖11CAF05 (DDA/TDB/聚(1:C))的DLS穩定性。通過動態光散射來測量隨著時間的變化的平均粒徑(n=3 )。在2-8 V下儲藏時，CAF05製劑在160天內是穩定的，並且在規定(specification)內。
[0092]圖12CAF05 (DDA/TDB/ 聚(1: C))的 HPLC 穩定性。
[0093]隨著時間的過去，測量CAF05中的DDA和TDB含量。CAF05佐劑樣品的兩種極性脂質DDA和TDB的含量是用反相HPLC和通過蒸發光散射檢測(ELSD)的檢測來量化的。CAF05佐劑中的DDA和TDB的含量在360天內沒有改變，是穩定的，並且在規定(specification)內，表明當根據所公開的發明來製造時，CAF05是穩定的。
[0094]圖13增加聚IC含量的穩定CAF05製劑的粒徑。
[0095]在時間0下，具有從5/1:0.1至5/1:1的不同DDA/TDB:聚(1:C)比率的CAF05(DDA/TDB/聚(1:C))的製劑的直徑都在157-220nm內。觀察到，對於含有較高的聚(1.C)的製劑，粒徑隨著時間的增加較為顯著，儘管所有的製劑都是穩定的。
[0096]圖14粒徑對濃度。
[0097]在時間0下，對於所有濃縮的整體產品，CAF05(DDA/TDB/聚(1:C))和CAF09(DDA/MMG/聚(1:C))的製劑的直徑都在165-225nm內。
[0098]圖15CAF04 (DDA/MMG)的DLS穩定性。在此，MMG是類似物3_羥基_2_十四烷基-十八烷酸_2，3- 二羥基丙酯。通過動態光散射來測量隨著時間變化的平均粒徑(n=3)。在2-8 °C下儲藏時，CAF04製劑在240天內是穩定的並且在規定內。
[0099]圖16CAF04(DDA/MMG)的 HPLC 穩定性
[0100]測量隨著時間變化的CAF04中的DDA含量。? DDA/MMG類似物10.000/4.000 ； DDA/MMG類似物10.000/2.000。CAF04佐劑樣品的極性脂質DDA的含量是用反相HPLC和通過蒸發光散射檢測(ELSD)的檢測來量化的。CAF04佐劑中的DDA的含量在60天內沒有改變，是穩定的，並且在規定內，表明當根據所公開的發明來製造時，CAF04是穩定的。
實施例
[0101]實施例1:用差不掃描儀(differential scanning calometry)(DSC)來檢測 DDA、TDB和脂質粉末混合物的熔化溫度。
[0102]起始材料和在超臨界CO2流體方法後產生的粉末的DSC溫度過程線呈現在圖2和圖3中。溫度過程線是用來自TA instruments的微量熱計獲得的。用TA instruments的通用軟體版本3.9A (universal software v.3.9A)來進行數據採集和分析。
[0103]在圖2中，DDA的相轉變顯示出具有89°C的頂點的窄峰。TDB的相轉變顯示出分別具有在77°C和93°C處的頂點的兩個峰。
[0104]圖3中所示的溫度過程線表明，在超臨界方法(RESS)期間攪拌沒有影響。用超臨界流體方法製備的粉末顯示出與通過其中使用有機溶劑/共溶劑的脂質膜方法製備的粉末的本質相似性(intrinsic similarity)。
[0105]用於獲得圖3中的圖形的超臨界流體方法的條件為75°C和140巴。
[0106]實施例2:使用超臨界二氧化碳方法，沒有使用乙醇來製備DDA/TDB脂質粉末。
[0107]DDA/TDB脂質粉末(DDA:TDB比率為5: lw/w)的DSC溫度過程線顯示在圖4中。脂質組分被裝載到標準的高壓釜中，密封且加熱至操作條件，對於超臨界流體方法，用於獲得圖4中的圖形的操作條件為75°C和140巴。沒有添加共溶劑。攪拌液化的懸浮液，之後，在通風之前，使樣品冷卻至室溫。可獲得的脂質粉末塊可以容易地研磨成細粉末。
[0108]實施例3:通過高剪切混合生產穩定的CAFOl (DDA/TDB)脂質體
[0109]根據所需的最終脂質含量，稱取脂質體粉末。根據所稱取的脂質含量和所需的最終含量，添加期望的緩衝液，例如1OmM Tris pH7.4。在與應用低速下的高剪切混合的同時，將緩衝液和脂質粉末加熱至高於相轉變溫度Tm的溫度。可以應用較高的速度水平，然而，不期望的發泡風險隨速度的增加而增加。當達到溫度Tm時，開始在高旋轉速度下的高剪切混合。在高旋轉速度下攪拌混合物，直到達到所需的尺寸分布。使脂質體混合物冷卻至室溫，然後冷凍。
[0110]實施例4:通過高剪切混合生產穩定的CAF05 (DDA/TDB/聚(1: C))脂質體
[0111]CAF05由三種組分DDA、TDB和聚(1:C)組成。首先，將用高剪切混合水化的DDA/TDB (CAFOl)冷卻至60°C。在60°C下，將聚(1:C)溶液滴加到液面下，至脂質體溶液中，同時保持高剪切混合。當添加完成時，繼續高剪切混合，持續大約5分鐘。使CAF05溶液冷卻至室溫，然後冷凍。穩定性數據顯示在圖11 (粒徑分布)和圖12 (DDA和TDB的HPLC)中。通過應用本發明所公開的製造方法，製造高的脂質和聚(1:C)含量的CAF05製劑是可能的。對於分別高至 8000ug/mL、1600ug/mL 和 1600ug/mL 的 DDA/TDB/ 聚(1:C)含量的 CAF05 製劑，實例顯示在圖14中。
[0112]實施例5:用高剪切混合生產的DDA和CAFOl (DDA/TDB)脂質體的熔化溫度的測定。
[0113]脂質體的DSC溫度過程線顯示在圖5中。DDA的相轉變顯示出具有46.7°C的頂點的窄峰。DDA/TDB的相轉變為分別具有在41.6°C和46.1°C處的兩個頂點的從39至47.5°C的寬峰。
[0114]用VP_DSC微量熱計(Microcal, Northhampton, MA)來進行量熱實驗。使用從30至55°C的30°C/小時的掃描速率。操作壓力為35psi。總的脂質濃度為2750 y g/mL。用Microcal』 s 0rigin7軟體來進行數據採集和分析。相轉變溫度被定義成在峰最大值處的溫度。
[0115]實施例6:脂質體的尺寸分布
[0116]在來自英國的 Malvern Instruments Ltd 的 Malvern Zetasizer-Nano 系列上的動態光掃描來測量脂質體的平均尺寸。數據是在25°C下獲得的且收集測量值三次。使用Malvern Zetasizer PCS版本6.20軟體來收集並計算數據。用高剪切混合再水化的CAFOl (DDA/TDB)脂質體的尺寸分布顯示在圖6中。顯示在圖6中的CAFOl脂質體的平均流體動力直徑(hydrodynamic diameter)為163.2±0.493nm。測量值的多分散指數為0.258±0.008。
[0117]實施例7 =CAFOl (DDA/TDB)脂質體的穩定性
[0118]通過在6000、12000和24000rpm下的高剪切混合方法製備的CAFOl (DDA/TDB)的顆粒的穩定性是通過經由使用 Malvern ZetaSizer nanoZS (Malvern Instruments Ltd.,英國)的動態光散射測量來測量隨時間變化的粒徑來確定的。在第0天，CAFOl (DDA/TDB)的製劑被分散在具有pH7.4的IOmM Tris緩衝液中。沉澱後,在第I天、第6天、第15天、第21天、第29天、第71天、第92天和第132天進行測量(圖7A)。隨時間變化的粒徑穩定性的比較表明穩定的脂質體是通過在12000rpm和24000rpm下的高剪切混合來獲得的。相反，在6000rpm下導致粒徑增加，且在4°C下儲藏71天後觀察到可見的聚集物，且在92天後由於聚集，使進一步的粒徑測量是不可能的。
[0119]實施例8:H56-CAF01TB 疫苗
[0120]疫苗候選物H56-CAF01包含與H56重組亞單元蛋白質(ESAT6_Ag85B-Rv2660)複合的CAF01 (DDA/TDB)脂質體。將用高剪切混合水化的DDA/TDB冷卻至室溫，同時維持高剪切混合。緩慢添加H56蛋白質抗原的水溶液，同時維持高剪切混合，持續大約5分鐘。在圖10中顯示的是，應用這種程序，可獲得疫苗，而沒有可檢測的觀察到的聚集物。呈現在圖10中的CAF01 (DDA/TDB)脂質體的平均流體動力直徑為148.7±0.600nm。測量值的多分散指數為0.251 ±0.007。
[0121 ]實施例 9:CAF05 (DDA/TDB/ 聚(1:C))的穩定性
[0122]具有不同的聚(1:C)含量的通過高剪切混合方法製備的CAF05 (DDA/TDB/聚(1:C))脂質體的顆粒的穩定性是通過經由使用Malvern Zetasizer nano (MalvernInstruments Ltd.，英國)的動態光散射測量來測量隨時間變化的粒徑來確定的。在第0天，對於在PH7.4的Tris緩衝液中的不同比率的DDA/TDB:聚(1:C)，如實施例4中所述地製備CAF05 (DDA/TDB/聚(1:C))的製劑。在製備後的第0天、第7天和第14天進行粒徑分布的測量(圖13)。隨時間變化的粒徑穩定性的比較表明是通過根據所公開的發明的高剪切混合獲得了穩定的CAF05脂質體。
[0123]實施例10:通過高剪切混合和用旋轉混合水化脂質製備的脂質體的免疫原性的比較。
[0124]在尾部的基部(the base of the tail),皮下地(s.c.)免疫小鼠，同時每一次免疫之間間隔2周。疫苗(0.2ml/小鼠)包含在300 u g CAF01 (DDA/TDB)中乳化的2 y g的熔合蛋白Ag85B-ESAT-6。在末次免疫後三周，純化血液淋巴細胞且在用0.05,0.5和5 y g的Ag85B-ESAT-6體外再刺激後測量IFN- y釋放水平。與用旋轉混合方法產生的免疫應答相比，在12000rpm下的高剪切混合得到較高的(儘管不是顯著較高的)IFN-Y應答(圖7B)。而且，如在用低的抗原濃度再刺激後用未改變的回憶應答(recall response)所觀察到的，維持抗原親合力(antigen avidity)(圖7B)。
[0125]實施例11:通過在6000、12000和24000rpm下高剪切混合製備的CAF01脂質體的免疫原性的比較。
[0126] 在尾部的基部，皮下地(s.c.)免疫小鼠，同時每一次免疫之間間隔2周。疫苗(0.2ml/小鼠)包含在通過在6000、12000和24000rpm下高剪切混合製備的300 u g CAFOl中乳化的g的卵白蛋白。末次免疫後三周,從單個小鼠中純化脾細胞,且在用g的卵白蛋白體外再刺激後測量IFN-Y釋放水平(圖8A)。在不同的製劑之間未觀察到顯著的變化，儘管24000rpm的方法得到稍微較低的應答。
[0127]此外，通過FACS考察⑶8+細胞的量:在I U g/ml抗-⑶28和抗-⑶49d的存在下，用5 u g/ml OVA或5 ii g/ml的OVA的⑶8肽抗原表位來刺激分離的脾細胞，持續I小時。在添加IOii g/ml布雷菲德菌素A和0.7 ii 1/ml莫能菌素/Golg1-stop後,細胞隨後在37°C下孵育5-6小時。在4°C下儲存過夜後，在FACS緩衝液中洗滌細胞，且隨後使用在FACS緩衝液中的抗-CD8-PerCP-Cy5.5的1:200稀釋液，在4°C下用mAb來進行表面標誌物(surfacemarker)染色,持續30分鐘。
[0128]立即通過流式細胞術，使用FACScan流式細胞儀(BD)來檢驗染色的細胞。在三種製劑之間，沒有獲得以％計的CD+細胞的顯著差異(圖SB)。
[0129]實施例12:通過高剪切混合、DRV、凍融、復乳和超聲方法製備的CAFOl脂質體的免疫原性的比較。
[0130]在尾部的基部，皮下地(s.c.)免疫小鼠，同時每一次免疫之間間隔2周。疫苗(0.2ml/小鼠)包含在通過高剪切混合、DRV、凍融、復乳和超聲方法製備的300 ii g CAFOl(DDA/TDB)佐劑中乳化的5 ii g的卵白蛋白。末次免疫後三周，從單個小鼠中純化脾細胞，且在用5 ii g的卵白蛋白體外再刺激後測量IFN-Y釋放水平(圖9A)。在不同的製劑之間未觀察到顯著的變化，儘管高剪切混合和凍融方法得到比其它方法高的應答。
[0131]此外，通過FACS考察⑶8+細胞的量:在I u g/ml抗-⑶28和抗-⑶49d的存在下，用5 u g/ml OVA或5 ii g/ml的OVA的⑶8肽抗原表位來刺激分離的脾細胞，持續I小時。在添加IOii g/ml布雷菲德菌素A和0.7 ii 1/ml莫能菌素/Golg1-stop後,細胞隨後在37°C下孵育5-6小時。在4°C下儲存過夜後，在FACS緩衝液中洗滌細胞，且隨後使用在FACS緩衝液中的抗-⑶8-PerCP-Cy5.5的1:200稀釋液，在4°C下用mAb來進行表面標誌物染色，持續30分鐘。立即通過流式細胞術，使用FACScan流式細胞儀(BD)來檢驗染色的細胞。與上述結果一致，與通過DRV方法但不是復乳和超聲方法獲得的那些應答相比，基於高剪切混合和凍融的製劑誘導顯著較高的CD8應答(圖9B)。
[0132]實施例13:通過高剪切混合生產穩定的CAF09 (DDA/MMG/聚(1: C))脂質體
[0133]CAF09由三種組分DDA、合成的MMG類似物(3_羥基_2_十四烷基-十八烷酸-2，3-二羥基丙酯)和聚(1:C)組成。首先，將用高剪切混合水化的DDA/MMG (CAF04)冷卻至60°C。在60°C下，將聚(1:C)溶液滴加到液面下，至脂質體溶液中，同時保持高剪切混合。當完成添加時，繼續高剪切混合，持續大約5分鐘。使CAF09溶液冷卻至室溫，然後冷凍。用於根據所公開的發明製造的CAF09 (165-225nm)的粒徑分布的數據顯示在圖14中。
[0134]實施例14:通過高剪切混合生產的具有不同脂質體佐劑的各種疫苗製劑
[0135]已經製備了具有來自多種疾病靶標如結核病、HIV、A型流感和衣原體的抗原的用高剪切混合生產的CAF01、CAF04、CAF05和CAF09脂質體的穩定製劑(表1)。
[0136]
【權利要求】
1.一種使用脂質粉末的高剪切混合來生產脂質體的方法，其中一種脂質組分是具有通式NR1R2R3R4-X的季銨化合物，其中R1和R2各自獨立地為含有從I至3個碳原子的短鏈烷基，R3獨立地為氫或甲基或含有從12至20個碳原子，優選地14至18個碳原子的烷基，且R4獨立地為含有從12至20個碳原子，優選地從14至18個碳原子的烴基，且X為本身無毒的、藥學上可接受的陰離子，所述脂質組分在水溶液中水化。
2.根據權利要求1所述的生產脂質體的方法，還包括中性脂質、糖脂和/或免疫增強劑。
3.根據權利要求1-2所述的生產脂質體的方法，其中所述高剪切混合基於轉子-定子原理、均化、超聲或擠出。
4.根據權利要求3所述的生產脂質體的方法，其中所述轉子的旋轉速度為至少3.400rpm。
5.根據權利要求1-4所述的生產脂質體的方法，其中所述脂質粉末是通過超臨界流體方法生產的。
6.根據權利要求1-5所述的生產脂質體的方法，其中所述季銨化合物為二甲基雙十八烷基銨(DDA)、或二甲基雙十八烯基銨(DODA)、或1，2-二油醯基-3-三甲基銨丙烷(DOTAP)U, 2- 二肉豆蘧醯基-3-三甲基銨丙烷、1，2- 二棕櫚醯基_3_三甲基銨丙烷、I, 2- 二硬脂醯基-3-三甲基銨丙烷和二油醯基-3- 二甲基銨丙烷(DODAP)、N-[1-(2，3- 二油醯氧基)丙基]-N，N，N-三甲基銨(DOTMA)、十八烯醯氧基(乙基_2_十七烯基-3-羥基乙基)咪唑啉鎗(D0HM)、1，2- 二油烯基-sn-甘油基-3-乙基磷酸膽鹼(DOEPC)和3-十四烷基氨基_叔丁基_N_十四烷基丙脒(二 C14-脒)。
7.根據權利要求6所述的生產脂質體的方法，其中所述脂質體額外地包含中性脂質，比如磷脂。
8.根據權利要求6-7所述的生產脂質體的方法，其中通過結合糖脂來穩定所述脂質體。
9.根據權利要求8所述的生產脂質體的方法，其中所述糖脂為a，a'-海藻糖6，6' -二山嵛酸酯(TDB)，或單分枝醯基甘油(MMG)或其合成類似物。
10.根據權利要求9所述的生產脂質體的方法，其中合成的MMG類似物為3-羥基_2_十四烷基_十八燒酸-2，3- 二羥基丙酯。
11.根據權利要求1-10所述的生產脂質體的方法，其中所述脂質體額外地包含免疫增強劑。
12.根據權利要求11所述的生產脂質體的方法，其中所述免疫增強劑選自C型凝集素受體，核苷酸結合寡聚化結構域(NOD)蛋白質及toll樣受體(TLR)家族，比如索狀因子(TDM)或合成類似物TDB，單分枝醯基甘油(MMG)或其合成類似物，鞭毛蛋白，脂多糖，肽聚糖或核酸變體，比如胞嘧啶:磷酸酯:鳥嘌呤(CpG)寡聚脫氧核苷酸和雙鏈核糖核酸(dsRNA)如聚肌苷酸:聚胞苷酸(聚(1:C))。
13.根據權利要求1-12所述的生產脂質體的方法，其中所述脂質體與大分子比如寡核苷酸、肽、蛋白質、碳水化合物和/或脂質複合。
14.一種根據任一前述權利要求生產的脂質體產品。
15.根據權利要求14所述的脂質體產品，其中所述脂質體包含DDA和TDB。
16.根據權利要求14所述的脂質體產品，其中所述脂質體包含DDA和合成的MMG類似物。
17.根據權利要求14-16所述的脂質體產品，其中所述脂質體還包含聚(1:C)。
18.根據權利要求14-17所述的脂質體產品，其包含抗原。
19.根據權利要求18所述的脂質體產品，其中所述抗原為ESAT6-Ag85B或ESAT6-Ag85B-Rv2660。
20.根據權利要求14-19的脂質體產品用於製造佐劑、疫苗、遞送系統、藥物或藥妝品的用途。
【文檔編號】A61K47/48GK103619325SQ201280031438
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2012年7月3日 優先權日:2011年7月4日
【發明者】拉斯·韋伯·安德烈亞森, 格裡斯·柯羅耶·伍德, 丹尼斯·克裡斯滕森 申請人:國立血清研究所