肝炎與肝硬化的集成檢測反應板和蛋白晶片試劑盒的製作方法

2023-11-04 17:42:37

專利名稱：肝炎與肝硬化的集成檢測反應板和蛋白晶片試劑盒的製作方法
技術領域：
本實用新型屬於體外臨床檢驗和生物晶片技術領域，確切地說，是一種適用於肝炎、肝硬化與肝癌的診斷、預測和預後的六項指標(HBsAg，HCVAb，AFU，AFP，MAO，和HA)集成檢測的反應板和試劑盒。
背景技術：
病毒性肝炎是法定乙類傳染病，具有傳染性較強、傳播途徑複雜、流行面廣泛、發病率高等特點；部分乙型、C型肝炎患者可演變成慢性，並可發展為肝硬化和原發性肝細胞癌，對人民健康危害甚大。
我國是B型肝炎大國，全世界75％的B肝患者都集中在我國。6億多人已感染過B肝，約1.3億人攜帶B肝病毒，其中3000萬人患有慢性肝炎，又有約30％的慢性肝炎病人發展為肝硬化，其中部分可發塵肝癌，每年因肝病死亡的人數近30萬，其中半數為肝癌。尤其嚴重的是攜帶B肝表面抗原的孕婦，其中約40％可直接通過母嬰垂直傳播使嬰兒感染，每年約有80萬～100萬新生兒成為B肝病毒攜帶者。
C型肝炎主要通過輸血及血製品和不潔注射等途徑而引起傳播，感染患者易發展成慢性肝炎、肝硬化及肝癌。最新調查顯示，全國有4000萬C肝感染者。據臨床觀察研究發現，急性C肝感染後約50％～70％可轉為慢性，20％的人最終發展為肝硬化或肝癌，且其演變為肝癌的速度較B肝病毒引起者來得快速。
B型肝炎和C型肝炎的臨床診斷以病原學和血清學診斷為主，B型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)是B型肝炎的特異性免疫學診斷標誌，而抗HCV是檢測C型肝炎的主要指標。
B型肝炎和C型肝炎引起的慢性肝損均可導致肝硬化的發生。人類肝硬化的病理改變多數較為緩慢，從肝細胞的損傷、炎症甚至壞死，到細胞外基質(ECM)的異常增生和沉積，需要經過數年甚至數十年的時間，平均大約3～5年的時間。由於肝臟具有很強的代償功能，有時即使肝硬化處於進展活動期，患者的臨床表現也不典型；即使患者表現有症狀，也往往缺乏診斷特異性。目前為止，基於肝臟活檢的病理學診斷仍然為肝硬化診斷的金標準。但其為創傷性診斷，具有致損傷甚至潛在的致死性危險，病人順從性差，費用較貴。此外，還存在以下一些缺點。首先是標本誤導的可能性，典型的莫過於在彌散性的肝臟病變中只能檢測一個纖維化的階段，如活檢標本較小，也可能發生標本誤導，如會有一個或兩個匯管匯高區時，或會有一個肝細胞的小葉，但不會有周圍的細胞外基質；另外，在不同的肝臟病理學家之間，在對肝纖維化的分類和程度的評判方面也可發生高達25％的差異；第三，一次的肝活檢只是提供靜態的信息，不能反應細胞外基質產生和降解之間平衡的動態變化，也不能充分地揭示出潛在性的病原學機制。基於以上種種原因，肝纖維化的無創性診斷越來越引起醫生和患者的注目。
目前，在臨床上應用較多的是MAO(單胺氧化酶)、HA(透明質酸)、層黏蛋白(LN)等指標。測定它們的血清含量，可反映肝臟內皮細胞、貯脂細胞和成纖維細胞的變化，如果它們的血清水平升高常常提示患者可能存在肝纖維化和肝硬化。
肝纖維化時，多種ECM的組成和含量均發生了明顯的變化，參與ECM代謝酶類也有相應的改變。通過對血清中有關酶類的檢測，對肝纖維化具有診斷意義。單胺氧化酶(MAO)是一些單胺類物質的氧化酶，分布於肝、腦等器官的線粒體中和血漿中。膠原合成時，MAO催化原膠原分子上的賴氨醯殘基，促進膠原分子內和分子間的共價交聯，形成穩定的膠原纖維。肝纖維化後期，MAO可升高；門脈-中央靜脈纖維間隔形成者80％升高，假小葉形成者絕大多數升高。
透明質酸(HA)是由間質細胞合成的一種大分子葡胺多糖，分布在各種結締組織中。肝臟中的內皮細胞是血液中HA清除的主要場所。肝纖維化後期至肝硬化時，肝竇內皮細胞的窗孔因毛細血管化減少或消失，血清中的HA可顯著增高。所以，一旦HA明顯增高，常提示纖維化程度較重，或已在肝硬化階段。
因為血清學指標比明顯的臨床症狀出現早，在健康人群中定期或不定期的進行肝炎、肝硬化相關血清指標的檢測，對於肝臟疾病的早發現、早治療有著重要意義，有利於肝病的預防，改善預後狀況。另一方面，由於B肝、C肝容易誘發肝癌，在對肝炎患者檢測肝炎指標的同時檢測肝癌相關指標也有重要意義。
甲胎蛋白(AFP)被廣泛用於原發性肝癌的早期診斷及肝癌手術療效的監測、術後的隨訪以及高危人群的隨訪。病毒性肝炎、肝硬化患者AFP濃度有不同程度的升高，但其水平通常低於100μg/L。其升高原因主要是由於受損傷的肝細胞再生而幼稚化時，肝細胞便重新具有產生AFP的能力，隨著受損肝細胞的修復，AFP逐漸恢復正常。
值得提出的是α-L-巖藻糖苷酶(AFU)，血清AFU測定以其對檢出小肝癌的高敏感性，對預報肝硬變並發肝癌的高特異性，和與AFP測定的良好互補性，而越來越被公認為是肝癌診斷、隨訪和肝硬變監護的不可或缺的手段。國內對24例肝細胞癌患者進行血清AFU和AFP相關研究，發現AFU診斷敏感必為87％，特異性為78％，而AFP則分別為65％和89％(診斷界限為，20ug/L)。提示AFU診斷的敏感性好，而特異性較AFP低。血清中AFU活性和陽性率與肝癌直徑大小無明顯相關性。小肝癌組血清AFU陽性率70.8％顯著高於AFP(37.5％)。AFP陰性和AFP升高而不足以診斷原發性肝癌者，其血清AFU的陽性率達80.8％。肝組織活檢證實為原發性肝癌者，血清AFU的陽性率為AFP陽性率的3倍以上。在肝硬化患者中檢測AFU，如其活性增加，對發現一些較小的腫瘤更具有價值，此時AFP不能對較小的腫瘤做出診斷。因此，應用和推廣AFU作為原發性肝癌新的診斷指標，具有重要的意義，尤其是AFP陰性和小細胞肝癌的診斷價值更大。因與AFP無明顯相關可互補診斷，聯合檢測可提高肝癌的檢出率。
目前的血清學檢測方法以ELISA方法為主，每次只能檢測單個指標，在進行多指標檢測上費時、費力、費錢，難以滿足人數眾多的檢驗市場，不利於體檢的日常化、平民化普及。蛋白晶片技術與免疫診斷技術相結合產塵的診斷用蛋白晶片技術是最近幾年來新興的高科技技術，在多指標並行快速檢測方面有著無可比擬的優勢，具有集成化、高通量、自動化、微型化、信息化等特點，是免疫診斷的發展方向。本實用新型通過對六個指標的快速檢測實現對肝炎、肝硬化與肝癌的診斷，預測和預後，對疾病的預防和治療有著重要的指導意義。

發明內容
本實用新型的目的是提供一種可同時對乙C型肝炎、肝硬化與肝癌進行預測，診斷和預後判斷的方法。我們的試劑盒通過檢測血清或血漿中的HBsAg，HCVAb，AFU，AFP，MAO和HA這六項或六項以上指標，來達到這一目的。
在本實用新型的第一方面，提供了一種乙C型肝炎、肝硬化與肝癌的診斷和預測六項指標集成檢測反應板，反應孔板包括基板和位於基板上的反應孔，所述的反應孔包括2-384個樣本孔，1-300個標準品孔，其中，其特徵在於每一反應孔的底部有固相載體，且在固相載體上包被著抗HBsAg，HCVAg，抗AFP，抗AFU，抗MAO，抗HA等六種或以上抗原或抗體的微點陣。在每一反應孔內還設有一定位基準點。
在一優選例中，所述的固相載體是NC膜、或PDVF膜。
在另一優選例中，所述樣本孔的數量為1-300個。
在另一優選例中，所述的抗HBsAg，HCVAg，抗AFP，抗AFU，抗MAO，抗HA等六種抗原或抗體在固相載體上各有2-8個點樣點。
在另一優選例中，所述反應孔每孔設有一個定位基準點。
在本實用新型的第二方面，提供了一種乙C型肝炎、肝硬化與肝癌的診斷和預測六項指標集成檢測試劑盒，它包括本實用新型上述的乙C型肝炎、肝硬化與肝癌的診斷和預測六項指標集成檢測反應板。
在另一優選例中，還包括酶標工作液、檢測液和標準品。
在另一優選例中，所述的酶標工作液由HRP標記的相應抗原或單克隆抗體組成，所述的檢測液由發光物和過氧化氫二種試劑組成，使用前混合。
在另一優選例中，所述的發光物為魯米諾、異魯米諾或其衍生物。


圖1是本實用新型一種固相載體上乙C型肝炎、肝硬化與肝癌檢測的六項指標的點樣示意圖圖2是本實用新型的反應孔中進行的各抗原——抗體反應的示意圖具體實施方式
乙C型肝炎、肝硬化與肝癌六項指標集成檢測的關鍵是要使六項指標檢測的靈敏度和特異性均達到要求以保證結果的準確司靠，而相應的難點是如何將濃度差高達10000倍的各檢測指標整合到一個孔裡來檢測。經過深入而廣泛的研究，本實用新型採用兩種不同的反應方式進行檢測，並對檢測反應板作了改進，同時本實用新型採用的微點陣檢測技術，酶免疫夾心法和化學發光檢測技術，大大提高了檢測的靈敏度和特異性，從而解決了上述問題。
具體而言，為提高乙C型肝炎、肝硬化與肝癌六項或六種以上指標(HBsAg，HCVAb，AFU，AFP，MAO和HA)的檢測效率，本實用新型應用微點陣檢測技術，結合酶免疫夾心法和化學發光檢測技術設計了一種乙C型肝炎、肝硬化與肝癌六項指標集成檢測反應板，反應孔板包括基板和位於基板上的反應孔，所述的反應孔包括2-384個樣本孔，1-300個標準品孔，其中，其特徵在於每一反應孔的底部平面上有固相載體，且在固相載體上包被著抗HBsAg，HCVAg，抗AFP，抗AFU，抗MAO，抗HA等六種或以上抗原或抗體的微點陣。
各反應孔的數量沒有特別限制，通常樣本孔為2-384個，較佳地2-50個。標準品孔1-300個，較佳地2-8個。
在本實用新型中，反應孔的形狀和大小沒有特別限制，可以是圓形、方形、六角形、橢圓形、或其他形狀。大小通常為直徑0.1nm-8cm，深度為0.1nm-4cm。
在本實用新型中，反應板基板的材料可以選用本領域常用的各種材料，較佳的基板材料包括玻璃、塑料、陶瓷等。
在本實用新型中，包被乙C型肝炎、肝硬化與肝癌抗原或抗體的固相載體可以選用本領域常用的各種固相載體，包括(但並不限於)玻璃片、塑料、硝酸纖維(NC)膜、PDVF膜等，較佳的固相載體包括NC膜、PDVF膜。
在固相載體上，各有抗HBsAg，HCVAg，抗AFP，抗AFU，抗MAO，抗HA等六種抗原或抗體2-8個點樣點，較佳地2-5個點樣點。此外，較佳地在固相載體上還包括一個定位點(見圖1)。各點樣點之間的距離通常為0.1nm-20mm。
另一方面，本實用新型還提供了一種乙C型肝炎、肝硬化與肝癌六項或以上指標集成檢測蛋白晶片試劑盒，該試劑盒可實現多指標並行化、微型化、高通量檢測。它包括本實用新型的反應孔板、洗滌液、酶標工作液、檢測液(A、B)、標準品等。其中，酶標工作液由HRP標記的相應抗原或單克隆抗體組成，檢測液由發光物和過氧化氫二種試劑組成，發光物為魯米諾、異魯米諾或其衍生物，使用前混合。
在本實用新型中，各指標的檢測採用酶免夾心法或競爭法，檢測原理如圖2所示。詳細敘述如下1)將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體。封閉，除去未結合的位點。
2)加受檢血清和酶標溶液，酶標溶液包含六項檢測指標的相應的酶標抗體(夾心法)。採用夾心法檢測的指標，特異的酶標抗體與血清中的抗原形成複合物，並進一步與固相抗體形成雙抗夾心複合物。
3)洗滌除去未結合的抗體，抗原及雜質。
4)加底物固相上的酶催化底物，化學發光，CCD檢測，光強度與標本中受檢抗原的量呈正相關。
本實用新型巧妙地綜合利用了蛋白質微點陣檢測技術，酶免疫夾心法和競爭法，以及化學發光檢測技術，實現了乙C型肝炎、肝硬化與肝癌六項指標的同時檢測。
下面結合具體實施例，進一步闡述本實用新型。應理解，這些實施例僅用於說明本實用新型而不用於限制本實用新型的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。
實施例1檢測反應板的製備取96孔板，設置42-84個樣本孔，1-8個標準品孔。在每個反應孔的底部放置一固相載體(NC膜或PDVF膜)，且在固相載體上包被著抗HBsAg，HCVAg，抗AFP，抗AFU，抗MAO，抗HA等六種抗原或抗體的蛋白質微列陣(圖1)。
實施例2試劑盒製備製備含一乙C型肝炎、肝硬化與肝癌六項指標集成檢測的試劑盒，它含有實施例1的反應孔板一塊(8-200人份)，洗滌濃縮液1瓶，酶標工作液1瓶，檢測液A一瓶，檢測液B一瓶，標準品瓶。
洗滌濃縮液、酶標工作液、檢測液A、檢測液B實施例3乙C型肝炎、肝硬化與肝癌六項指標集成檢測按以下方法對各測試血請樣品進行檢測1.加檢測血請或標準品於相應反應孔內，100ul/孔。
2.加酶標工作液，75ul/孔。
3.30℃保溫振蕩反應60分鐘。
4.用洗液洗滌4-6次，每次5分鐘，振動。
5.加檢測液40ul/孔，使檢測液均勻分布於孔的底部。
6.CCD檢測，視發光信號強度曝光3-20秒。
結果判定依據不同指標的CutOff值，參考標準品梯度曲線，判定樣品血清的陰陽性。
與此同時，用常規方法對測試的血清樣品進行常規檢測。結果表明，用本實用新型的試劑盒得出的測試結果與常規方法相同。
在本實用新型提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本實用新型的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本實用新型作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權力要求書所限定的範圍。
權利要求1.一種肝炎、肝硬化與肝癌的診斷和預測六項指標集成檢測反應板，其特徵在於，反應孔板包括基板和位於基板上的反應孔，所述的反應孔包括2-384個樣本孔，1-300個標準品孔，其中，其特徵在於每一反應孔的底部有固相載體，且在固相載體上包被著抗HBsAg，HCVAg，抗AFU，抗AFP，抗MAO，抗HA等六種或以上抗原或抗體的微點陣，在每一反應孔內還設有一定位基準點。
2.如權利要求1所述的反應板，其特徵在於，所述的固相載體是NC膜、或PDVF膜。
3.如權利要求1所述的反應板，其特徵在於，所述樣本孔的數量為1-300個。
4.如權利要求1所述的反應板，其特徵在於，所述的抗HBsAg，HCVAg，抗AFU，抗AFP，抗MAO，抗HA等抗原或抗體在固相載體上各有2-8個點樣點。
5.如權利要求1所述的反應板，其特徵在於，在每一反應孔內還設有一定位基準點。
6.一種肝炎、肝硬化與肝癌的診斷六項集成檢測蛋白晶片試劑盒，其特徵在於，它包括權利要求1所述的肝炎、肝硬化與肝癌的診斷和預測六項指標集成檢測反應板。
7.如權利要求6所述的試劑盒，其特徵在於，還包括酶標工作液，檢測液和標準品。
8.如權利要求7所述的試劑盒，其特徵在於，所述的酶標工作液由HRP標記的相應抗原或單克隆抗體組成，所述的檢測液由發光物和過氧化氫二種試劑組成。
9.如權利要求8所述的試劑盒，其特徵在於，所述的發光物為魯米諾、異魯米諾或其衍生物。
專利摘要本實用新型涉及肝炎、肝硬化與肝癌的診斷，預測和預後的六項指標B型肝炎病毒表面抗原HBsAg，C型肝炎病毒抗體HCVAb，甲胎蛋白(alpha－fetoprotein，AFP)，α－L－巖藻糖苷酶(α－L－Fucosidase，AFU)，單胺氧化酶(Mono amine Oxidase，MAO)，透明質酸(hyaluronicacid，HA)集成檢測反應板和蛋白晶片試劑盒。所述的反應孔板包括基板和位於基板上的反應孔，所述的反應孔包括2－384個樣本孔，2－8個標準品孔，其中，每一反應孔的底部有固相載體，且在固相載體上包被著抗HBsAg，HCVAg，抗AFP，抗AFU，抗MAO，抗HA等六種或以上抗原或抗體的微點陣。本實用新型的反應板和試劑盒可簡便、快速、準確地實現多個人份的乙C型肝炎、肝硬化與肝癌的診斷，預測和預後的六項指標的同時檢測。
文檔編號G01N33/547GK2826438SQ200520119229
公開日2006年10月11日 申請日期2005年9月20日 優先權日2005年5月24日
發明者穆海東 申請人:穆海東