一種肝癌靶向性溶瘤腺病毒，其製備方法及用途的製作方法
2023-11-05 05:31:47
專利名稱：一種肝癌靶向性溶瘤腺病毒，其製備方法及用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種重組腺病毒，具體地說涉及一種肝癌靶向性溶瘤腺病毒，還涉及該病毒的製備方法及用途。
背景技術：
肝癌發病率與死亡率在我國一直居高不下，是危害我國人群健康的主要腫瘤，但目前尚無特效治療方法。如能研製有效的肝癌生物治療製劑，不僅對探索肝癌治療具有重要意義，而且具有明顯的社會和經濟效益。
腫瘤的發生發展往往是多基因協同作用的結果，僅靠恢復1個或幾個抑癌基因功能的基因治療方法一般難以奏效，美國伯明罕阿拉巴馬大學的Miller和Curiel於1996年在《Gene Therapy》雜誌上發表了一篇社論，首先提出了使用腫瘤選擇複製性腺病毒(tumor selective replication Adenovirus，TSRA，亦稱特異性溶瘤腺病毒selectively oncolytic Adenovirus)治療腫瘤的新策略，這種重組腺病毒一旦感染腫瘤細胞即可在細胞內複製增殖並裂解腫瘤細胞，細胞裂解後釋放的病毒顆粒可再次感染其它腫瘤細胞，直到將全部腫瘤細胞殺滅。但該病毒在正常細胞內不能增殖，對正常細胞損害不大。作為這種策略的實踐，Khuri等於2000年使用E1b55缺失的複製性重組腺病毒ONYX-015(d11520)選擇性裂解P53-腫瘤細胞，獲得可喜成績。該研究小組在2000年8月的《自然醫學》雜誌上報導在30名患有頭頸部癌的病人身上試用了選擇性攻擊P53缺陷的腫瘤細胞的腺病毒突變體ONYX-015並聯合常規化療，使25名患者的腫瘤縮小，其中8名患者的腫瘤完全消失。基因療法領域的先驅南加州大學的威廉.安德森評論說這項成果非常令人振奮，因為這是首次在數量較多病人參與的二期臨床試驗中取得大量的腫瘤消失且不復發的結果。ONYX-015也已用於肝癌的基因治療研究，儘管普遍認為ONYX-015僅對p53-肝癌細胞有裂解作用，但也有研究結果發現ONYX-015能在p53+肝癌細胞系如HepG2內複製，p53狀態與ONYX-015的複製缺乏相關性。最近幾年腺病毒突變體ONYX-015等多種增殖病毒已進入臨床試驗，為腫瘤的治療開闢了一個新的研究領域。
選擇複製性腺病毒之所以有很好療效，主要是因為腺病毒能自主複製，呈對數增殖，使其治療劑量成萬倍地放大。腺病毒溶瘤療法中，選擇複製性腺病毒能主動地尋找靶細胞，在靶細胞內進行複製，將癌細胞裂解殺滅。
AdE1區基因是腺病毒的複製啟動基因，包括E1a和E1b兩部分，它的表達與否直接關係到腺病毒能否複製。因此如果把整個腺病毒比作一部機器，那麼E1區就是這部機器的總開關，其作用至關重要。在腺病毒感染後的最初2.5小時內，只有E1a基因被轉錄、翻譯，此蛋白可激活對腺病毒複製必需的各種細胞基因和病毒基因的表達。以前所用的複製缺陷型腺病毒正是剔除了這段序列。而在選擇複製性腺病毒中正是保留和利用這一基因區，將其置於腫瘤組織或細胞特異的調控序列控制之下，或利用腫瘤細胞內特有的信號傳導途徑，使病毒複製並達到特異裂解殺滅癌細胞的目的。
腫瘤的基因療法需要面對的一個首要問題是靶向性或特異性。人們為了特異性地殺傷腫瘤細胞，根據腫瘤細胞的生物學特性，細胞表面的受體分子的分布以及胞內基因表達的特殊性，設計了一些靶向的方法。如多用於中樞神經系統腫瘤的逆病毒載體，即是利用了其特異整合於分裂細胞的性質，將目的基因導入正在分裂的腫瘤細胞。而腺病毒突變體ONYX-015則是利用了腫瘤細胞內突變的p53基因產物不能阻止細胞進入複製期而可允許其同時增殖複製，最後導致癌細胞裂解。目前，研究者們普遍採用一個靈活而具有廣泛意義的方法，即選用腫瘤特異性調控元件(啟動子和增強子)以驅動目的基因表達於特定的靶細胞。此法已用於肝癌、肺癌、胃癌、卵巢癌、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、結直腸癌、骨肉瘤、黑色素瘤等實體瘤的實驗研究。腺病毒溶瘤療法也同樣面對靶向性或特異性問題，特異性溶瘤腺病毒的構建大多也採用腫瘤特異性調控元件(啟動子和增強子)來驅動腺病毒於特定的靶細胞內複製。
理論上，可以通過調控腺病毒複製的各個環節來構建TSRAd；實際上近年來的研究表明，主要的策略就三種一是剔除(全部或部分)腺病毒在腫瘤細胞中複製時多餘的基因，而這些基因在正常細胞中卻必不可少，如通過與p53或Rb結合而激活細胞周期的基因；第二種策略則是用腫瘤特異的啟動子替換掉天然的病毒啟動子以控制病毒複製基因的表達；三是改造腺病毒纖毛蛋白，使其特異地感染腫瘤並在其中複製。
在逆轉錄病毒載體介導的肝癌自殺基因療法研究中，用血管內皮生長因子VEGF上遊的缺氧應答元件HRE與AFP核心啟動子AF0.3構成的雜合啟動子HREAF，可指導自殺基因HSV tk在幾乎所有產生或不產生AFP的(如HLF)肝癌細胞系中特異性高表達，增強子HRE在缺氧條件下選擇性地激活了不產生AFP的肝癌細胞中的痕量AFP啟動子活性。因此，雜合啟動子HREAF大大拓展了AFP啟動子在肝癌靶向性或特異性基因治療中的應用範圍。不過在此逆轉錄病毒載體介導的肝癌自殺基因療法中，由於存在「旁觀者效應」，肝臟幹細胞還是難免會被波及，肝儲備能力會受到影響。
經檢索，目前僅見國外有構建含AFP甲胎蛋白及HRE缺氧應答元件的逆病毒載體，以及不帶有肝癌靶向性的E1區缺失的腺病毒載體，尚未見到構建肝癌靶向性可複製性溶瘤腺病毒進行肝癌基因治療的報導。
發明內容
本發明的目的是提供一種肝癌靶向性的溶瘤腺病毒，以及該腺病毒的製備方法及用途。
本發明的肝癌靶向性溶瘤腺病毒包含缺氧應答元件HRE和AFP核心啟動子AF0.3來構建的肝癌靶向性的雜合啟動子HREAF，以及腺病毒E1區複製啟動基因，腺病毒E1區複製啟動基因位於肝癌靶向性雜合啟動子的下遊。
本發明採用穿梭質粒構建重組腺病毒穿梭質粒，再經同源重組構建重組腺病毒質粒，經純化、酶切，轉染細胞，包裝出目的重組腺病毒顆粒。
本發明的肝癌靶向性溶瘤腺病毒的製備方法包括以下步驟1、克隆HRE和AF0.3及構建雜合啟動子HREAF(1)設計缺氧應答元件HRE、AFP核心啟動子AF0.3的PCR引物，以人肝細胞癌細胞基因組DNA為模板，進行PCR擴增。
(2)將PCR產物克隆至pGEM-T easy載體，構建質粒pGEM-HRE和pGEM-AF0.3。
(3)進行PCR及酶切鑑定及測序鑑定。
(4)雜合啟動子HREAF的構建。將HRE與AF0.3進行PCR擴增，回收PCR產物並純化、酶切後，在體外連接，得雜合啟動子HREAF。
2、構建腺病毒穿梭質粒pShuttle-HREAF-E1和pShuttle-HREAF-E1Δ55重組腺病毒所需的細菌同源重組系統包括E.coli BJ5183(Stratagene公司產品)和穿梭質粒pShuttle、pShuttle-CMV以及腺病毒骨架質粒pAdEasy-1。pShuttle可供插入包含調控序列至polyA加尾信號的完整基因，pShuttle-CMV則可供插入僅含翻譯起始密碼至終止密碼的編碼序列。但在本發明中，需要在穿梭載體中插入不同來源的調控序列HREAF、編碼序列AdE1或AdE1Δ55，並且需要為其提供polyA加尾信號。因此本發明中將要構建的穿梭質粒pShuttle-HREAF-E1和pShuttle-HREAF-E1Δ55均不能在pShuttle或pShuttle-CMV的基礎上直接構建，需先對其進行改構，本發明選擇在pShuttle中插入polyA加尾信號。改構路線如圖3所示。
(1)設計穿梭質粒構建所需引物。
(2)重組腺病毒穿梭質粒pShuttle-HREAF-E1的構建及鑑定。將腺病毒穿梭載體pShuttle和pShuttle-CMV分別進行酶切，連接酶切片段並轉化，獲得在pShuttle中插入了SV40加尾信號序列的重組腺病毒穿梭質粒pShuttle-R；將pShuttle-R和HREAF的PCR產物分別進行酶切，連接酶切片段並轉化，獲得在pShuttle-R中插入了調控序列HREAF的重組腺病毒穿梭質粒pShuttle-HREAF；將pShuttle-HREAF和AdE1的PCR產物分別進行雙酶切，連接酶切片段並轉化，獲得在pShuttle-HREAF中插入了腺病毒AdE1基因的重組腺病毒穿梭質粒pShuttle-HREAF-E1，採用PCR及酶切方法進行鑑定。
(3)pShuttle-HREAF-E1Δ55的構建及鑑定由於腺病毒的包裝能力有限，為了構建出腺病毒衣殼能包裝得下的肝癌特異性溶瘤腺病毒，本發明構建了pShuttle-HREAF-E1Δ55。pShuttle-HREAF-E1Δ55的構建路線與pShuttle-HREAF-E1相似。
將pShuttle-HREAF和缺失E1b55的AdE1Δ55基因的PCR產物分別進行酶切，連接酶切片段並轉化，獲得重組腺病毒穿梭質粒pShuttle-HREAF-E1Δ55，採用PCR及酶切方法進行鑑定。
3、生產重組溶瘤腺病毒AdhafE1Δ55(1)採用AdEasy XL adenoviral vector system(Stratagene公司產品)生產重組腺病毒的原理，該系統中骨架質粒pAdEasy-1長33.5kb，已剔除了E1區和E3區，含有氨苄青黴素抗性基因；已克隆入外源目的基因的穿梭質粒如pShuttl-HREAF-E1和pShuttl-HREAF-E1Δ55分別長10.45kb和9.3kb，均含有卡那黴素抗性基因。骨架質粒和穿梭質粒均含有pBR322複製起始位點，可在細菌中複製擴增。
將構建好的穿梭質粒進行線性化，與pAdEasy-1一起轉化感受態細菌進行同源重組，經抗生素抗性選擇，再經體外酶切鑑定。鑑定後的重組腺病毒質粒被轉化至重組缺陷型菌株大量擴增。純化後的重組腺病毒質粒經酶切，暴露出左右反向重複序列(ITR)後轉染細胞，包裝出目的重組腺病毒顆粒。
(2)細菌中重組腺病毒質粒的產生和鑑定將穿梭質粒pShuttl-HREAF-E1和pShuttl-HREAF-E1Δ55線性化，分別與骨架質粒pAdEasy-1一起轉化感受態細菌，抗生素平板選擇培養，只有具備卡那黴素抗性的重組質粒pAdhafE1或pAdhafE1Δ55可被選擇。分別挑出pAdhafE1克隆及pAdhafE1Δ55克隆，抽提質粒，進行酶切鑑定。
(3)哺乳動物細胞中產生腺病毒發明人選擇重組質粒pAdhafE1Δ55來進行重組腺病毒AdhafE1Δ55的包裝生產。將重組質粒pAdhafE1Δ55大量擴增、純化，經酶切，暴露出左右ITR後轉染哺乳動物細胞(如293細胞)，進行重組腺病毒顆粒AdhafE1Δ55的包裝。待細胞出現完全病變，回收細胞，提取重組腺病毒基因組DNA，作為模板，進行PCR鑑定，同時設立陰性對照。
4、AdhafE1Δ55對人肝癌細胞的特異殺傷作用(1)形態學觀察AdhafE1Δ55對人肝癌細胞的特異殺傷將人肝癌細胞和肺癌細胞鋪板，以低劑量溶瘤腺病毒AdhafE1Δ55分別攻擊，缺氧條件下培養，觀察細胞生長情況。
(2)MTT實驗檢測AdhafE1Δ55對人肝癌細胞的特異殺傷將人肝癌細胞和肺癌細胞鋪板，以低劑量溶瘤腺病毒AdhafE1Δ55分別攻擊，缺氧誘導條件下培養。分別測定各孔細胞的光吸收值，繪製細胞生長曲線，並對各腫瘤細胞在各時間點上進行AdhafE1Δ55感染與否之間的生存狀況比較，以及對各腫瘤細胞之間在各時間點上進行生存率的比較。
(3)RT-PCR檢測E1a的表達以AdhafE1Δ55分別感染人肝癌細胞和肺癌細胞，培養收集細胞，提取總RNA，用RT-PCR檢測E1a的表達。
腫瘤的進展需要建立新生血管為其供應氧氣和營養物質，具備血管形成能力也就成為腫瘤生長的前提條件。在促進腫瘤新生血管生成的眾多因素中，VEGF扮演了極其重要的角色，其表達是在缺氧條件下通過存在於其基因5』端上遊的HRE來誘導的。HRE於缺氧條件下誘導目的基因增強表達，存在組織或細胞特異性，其組織或細胞特異性是由與其緊鄰的啟動子所限定。肝癌被認為是高血管分布的腫瘤，不過仍發現它比相應的非腫瘤組織表達更高水平的VEGF。Ido等觀察由HRE和AF0.3雜合而成的啟動子HREAF介導的肝癌特異性，亦證明增強子HRE在缺氧條件下誘導的目的基因的增強表達可被啟動子AF0.3限定於肝癌細胞內(Ido A，Uto H，Moriuchi A，et al.Genetherapy targeting tor hepatocellular carcinomaselective and enhanced suicidegene expression regulated by a hypoxia-inducible enhancer linked to a humanα-fetoprotein promoter.Cancer Research，2001；613016-3021)。
根據肝癌高表達VEGF的特點及雜合啟動子HREAF所介導目的基因表達的高效、嚴謹的肝癌特異性，如果將HREAF用於指導溶瘤腺病毒在肝癌細胞內特異複製並裂解之，則會因特異性溶瘤腺病毒具有的「複製與裂解的一一對應關係」特點，而至少在理論上可避免對肝儲備能力的影響，儘可能地達到特異殺傷肝癌細胞的要求。因為肝臟再生過程則呈有序適度特徵，氧供充足，不同於在肝炎、肝硬化等組織中會由缺氧條件及多種細胞因子和生長因子而介導VEGF的表達，亦不同於在實體瘤中會因瘤體增長過快及無序新生血供而導致主要由缺氧條件介導VEGF表達。
本發明採用選擇複製性腺病毒溶瘤策略進行肝癌基因治療，為了解決肝癌基因治療中的靶向性或特異性問題，並儘量針對所有AFP產量不等的肝癌，發明人構建了雜合啟動子HREAF指導的肝癌靶向性溶瘤腺病毒AdhafE1Δ55，並進行了初步的體外肝癌細胞特異殺傷研究，取得了預期的對肝癌細胞的特異殺傷結果。利用本發明的重組腺病毒，可以製備用於治療肝癌的藥物。本發明的重組腺病毒可作為肝癌生物治療的選擇之一，為肝癌患者帶來福音。
本發明的創新點在於用可複製性溶瘤腺病毒代替逆病毒，通過腺病毒本身的複製達到裂解靶細胞的目的，與複製缺陷型腺病毒相比，本發明保留和利用了腺病毒複製啟動基因AdE1基因，使病毒複製並達到特異裂解殺滅癌細胞的目的。並具有以下優點1，靶細胞不一定在複製分裂期即可被殺傷，效率高。2，腺病毒不插入靶細胞核基因組，無致突變作用。3，一過性作用，安全性高。
圖1為pGEM-HREAF結構示意圖。
圖2為雜合啟動子HREAF構建示意圖。
圖3為重組質粒pShuttle-HREAF-E1構建示意圖。
圖4為重組質粒pShuttle-HREAF-E1Δ55構建示意圖。
圖5為AdEasy XL adenoviral vector system生產重組腺病毒示意圖。
圖6為重組腺病毒質粒pAdhafE1的酶切鑑定，其中1，3為酶切前，2，4為PacI酶切後，5為DNA markerλ-Hind III圖7為質粒pAdhafE1Δ55電泳圖，其中1，2，3，5，6，7為質粒pAdhafE1Δ55，4為DNA markerλ-Hind III圖8為PacI酶切鑑定pAdhafE1Δ55圖，其中1，2，3，5，6，7為pAdhafE1Δ55的PacI酶切產物，4為DNA markerλ-Hind III圖9為細胞病變效應圖，圖中a為病變孔細胞，b為對照孔細胞。
圖10為重組腺病毒AdhafE1Δ55的基因組DNA，其中1為DNA Markerλ-HindIII digest，2為293細胞中包裝出的AdhafE1Δ55，3為HepG2細胞中包裝出的AdhafE1Δ55。
圖11為重組腺病毒AdhafE1Δ55的PCR鑑定電泳圖，其中1為DNA Marker DL20002為以293細胞中包裝出的重組腺病毒基因組DNA為模板PCR擴增HREAF3為以HepG2細胞中包裝出的重組腺病毒基因組DNA為模板PCR擴增HREAF4為陰性對照圖12為AdhafE1Δ55對人肝癌細胞的特異殺傷作用圖，其中a為Be17402細胞/AdhafE1Δ55，b為對照Be17402細胞，c為HepG2細胞/AdhafE1Δ55，d為對照HepG2細胞，
e為PLA801C/AdhafE1Δ55，f為對照PLA801C。
圖13為肝癌細胞感染AdhafE1Δ55後的生存曲線圖。
圖14為RT-PCR方法檢測AdhafE1Δ55感染肝癌細胞後E1a的特異表達圖，其中1，2，3分別為HepG2、Bel7402和PLA801C細胞的G3PDH RT-PCR產物4為DNA Marker DL2000，5，6，7分別為HepG2、Bel7402和PLA801C細胞的E1a RT-PCR。
具體實施例方式
實施例一 克隆HRE和AF0.3及構建雜合啟動子HREAF1、從Genbank中查出人血管內皮生長因子VEGF上遊缺氧應答元件HRE及人α-甲胎蛋白核心啟動子AF0.3的序列，並進行內部酶切位點的分析(1)含缺氧應答元件HRE序列為見GenBank data accession no.M63971，序列中SacI與PstI之間(1188-1572)約380bpDNA片段即為缺氧應答元件HRE。
(2)含α-甲胎蛋白核心啟動子AF0.3序列為見GenBank data accessionno.L34019，序列中723～981之間的259bpDNA片段即為AFP核心啟動子AF0.3。設計出缺氧應答元件HR、AFP核心啟動子AF0.3的PCR引物，缺氧應答元件HRE引物上遊引物見序列表中序列1，下遊引物見序列表中序列2。在其上遊引物中插入HindIII位點，便於隨後插入增強子序列，下遊引物中插入BamHI位點，以利於後續的連接、克隆操作。預期擴增產物約560bp。
AFP核心啟動子AF0.3引物上遊引物見序列表中序列3，下遊引物見序列表中序列4。在其上遊引物中插入BamHI位點，便於隨後插入增強子序列，下遊引物中插入HindIII位點，以利於後續的連接、克隆操作。預期擴增產物約310bp。
3、缺氧應答元件HRE、AFP核心啟動子AF0.3的PCR擴增以人肝細胞癌HepG2細胞(購自中國醫學科學院基礎醫學研究所)基因組DNA為模板，分別用設計的引物進行HRE和AF0.3的高保真PCR擴增，電泳觀察，可見分別有約310bp和560bp的擴增條帶，且為主要產物，與預期的結果一致。
4、將缺氧應答元件HRE、AFP核心啟動子AF0.3的PCR產物克隆至pGEM-T easy載體，構建質粒pGEM-HRE和pGEM-AF0.3。
將HRE和AF0.3的上述PCR產物經乙醇沉澱後，用Taq DNA聚合酶加A尾，然後與T載體相連，轉化JM109宿主菌(Stratagene公司產品)，鋪於含X-gal、IPTG、Amp的瓊脂平皿中，結果長出許多藍色和白色菌落。白色菌落即為侯選克隆。
5、缺氧應答元件HRE、AFP核心啟動子AF0.3的PCR及酶切鑑定各挑白色克隆，熱裂解法製備質粒作模板，用特異引物分別進行HRE和AF0.3的PCR擴增，電泳觀察，可見挑取的克隆均能擴增出約310bp和560bp的目的片段。提取質粒pGEM-HRE和pGEM-AF0.3，進行BamHI+HindIII雙酶切鑑定，可見質粒pGEM-HRE可酶切出約560bp的目的片段，pGEM-AF0.3可酶切出約310bp的目的片段。
結合以上對質粒pGEM-HRE和pGEM-AF0.3的PCR及酶切鑑定結果，表明克隆入pGEM-T easy載體的缺氧應答元件HRE、AFP核心啟動子AF0.3的酶切位點及大小正確，送pGEM-AF0.3和pGEM-HRE質粒到上海生工公司測序。
6、測序鑑定缺氧應答元件HRE、AFP核心啟動子AF0.3已測序部分與文獻報導一致，在兩端已分別加入了HindIII和BamHI酶切位點，可確定質粒pGEM-HRE和pGEM-AF0.3中外源DNA片段HRE和AF0.3的插入方向。
7、雜合啟動子HREAF的構建將HRE與AF0.3進行PCR擴增，回收PCR產物並純化、酶切後，在體外進行連接，得雜合啟動子HREAF，將此連接產物克隆至pGEM-T easy載體，如圖1所不，經PCR、酶切及測序鑑定正確。
為了便於HREAF的構建，另設計了一條AF0.3下遊引物，帶入了SphI位點，如序列表中序列14所示。雜合啟動子HREAF的構建路線如圖2所示，預期可得約700bp的連接產物HREAF。
以HREAF連接產物作為模板，以HRE上遊引物與AF0.3下遊引物配對，進行PCR擴增，結果與預期一致。
根據對HRE和AF0.3序列酶切位點的分析以及HREAF的構建路線，可預期在連接產物HREAF中應有兩個SacI位點，相距約445bp。因此對HREAFPCR產物純化回收後，用SacI進行單酶切，結果如預期所料，酶切出了HREAF序列中部的445bp特異片段及兩端分別約200bp和50bp的條帶。
將HREAF PCR產物經乙醇沉澱後，用Taq DNA聚合酶加A尾，然後與T載體相連，轉化JM109宿主菌，鋪於含X-gal、IPTG、Amp的瓊脂平皿中，結果長出許多藍色和白色菌落。白色菌落即為侯選克隆。挑白色克隆，熱裂解法製備質粒作模板，用特異引物分別進行HREAF的PCR擴增，電泳觀察，可見擴增出約700bp的目的片段。
小提質粒pGEM-HREAF進行EcoR I單酶切鑑定，結果酶切出約700bp的目的片段。
結合以上對HREAF連接產物和質粒pGEM-HREAF的PCR及酶切鑑定結果，表明克隆入pGEM-T easy載體的雜合啟動子HREAF的酶切位點及大小正確，送pGEM-HREAF質粒到晶泰生物技術公司採用T7通用引物進行測序測定，HREAF測序結果如序列表中序列5所示，其中的缺氧應答元件HRE、AFP核心啟動子AF0.3分別與文獻報導一致，符合預期構建設想，可確定質粒pGEM-HREAF中外源DNA片段HREAF的插入方向分別如圖所示。
實施例二 腺病毒穿梭質粒pShuttle-HREAF-E1和pShuttle-HREAF-E1Δ55的構建1、設計穿梭質粒構建所需引物依據文獻中報導的缺氧應答元件HRE(GenBank data accession no.M63971)、AFP核心啟動子AF0.3(GenBank data accession no.L34019)、腺病毒E1a和E1b(GenBank data accession no.X02996)及穿梭質粒pShuttle多克隆位點(MCS)兩端的序列(Stratagene公司網站www.stratagene.com)，分別設計引物，並視載體構建的需要，在其5』端或3』端分別加入不同的限制性內切酶位點，用於各構建元件的PCR擴增，引物由賽百勝公司合成。
HREAF引物上遊引物如序列表中序列6所示，加入KpnI位點，下遊引物如序列表中序列7所示，加入XhoI位點，預期擴增目的產物約為720bp；E1a引物上遊引物如序列表中序列8所示，加入XhoI位點，下遊引物如序列表中序列9所示，預期擴增目的產物為1000bp(在RT-PCR中，可能會擴增出約1000bp、880bp或740bp的cDNA條帶)；E1b引物下遊引物如序列表中序列10所示，加入EcoRV位點。與E1a上遊引物配對，預期擴增目的產物為2950bp，為全長AdE1；E1bΔ55引物下遊引物如序列表中序列11所示，加入EcoR V位點。與E1a上遊引物配對，預期擴增目的產物為1720bp，為缺失E1b55的AdE1Δ55基因；pShuttle MCS兩端引物上遊引物如序列表中序列12所示，下遊引物如序列表中序列13所示，預期擴增目的產物大小據插入片段的大小而定；各次PCR反應條件根據引物搭配使用情況及目的產物大小而定。
2、重組腺病毒穿梭質粒pShuttle-HREAF-E1的構建將腺病毒穿梭載體pShuttle和pShuttle-CMV分別進行Xho I和EcoR I雙酶切，分別回收純化pShuttle來源的大片段和pShuttle-CMV來源的小片段，T4連接酶連接並轉化感受態細胞JM109，篩選陽性克隆子，經PCR及酶切鑑定，獲得在pShuttle中插入了SV40加尾信號序列的重組腺病毒穿梭質粒pShuttle-R。將pShuttle-R和HREAF的PCR產物分別進行Xho I和Kpn I雙酶切，乙醇沉澱後如上述方法進行連接、轉化、篩選、鑑定，獲得在pShuttle-R中插入了調控序列HREAF的重組腺病毒穿梭質粒pShuttle-HREAF。將pShuttle-HREAF和AdE1的PCR產物分別進行Xho I和EcoR V雙酶切，乙醇沉澱後如上述方法進行連接、轉化、篩選、鑑定，獲得在pShuttle-HREAF中插入了腺病毒AdE1基因的重組腺病毒穿梭質粒pShuttle-HREAF-E1。對上述構建的各質粒分別進行PCR和酶切鑑定。
3、pShuttle-HREAF-E1的構建及鑑定將上述各質粒作為模板，以pShuttle MCS兩端引物對插入片段進行PCR鑑定，可見pShuttle改構前MSC兩端之間僅有約150bp長，改構後的pShuttle-R由於插入了約230bp長的SV40加尾信號序列，MSC兩端之間距離變為約380bp長；插入HREAF後，間距進一步變為約1080bp；當插入了E1後，間距最終變為約4000bp。以pShuttle-HREAF-E1為模板，分別以特異引物對擴增HREAF、E1及HREAF-E1，可得預期大小分別約為700bp、2950bp及3650bp的特異外源片段。
當以Kpn I和EcoR V雙酶切上述各質粒時，在pShuttle-HREAF能得到與外源目的片段HREAF和pShuttle酶切片段大小相同的兩條帶；但由於E1內部有KpnI限制性內切酶位點，故在pShuttle-HREAF-E1得到了三條帶，僅其中一條與pShuttle酶切片段大小相同；但如果改用XhoI和EcoR V雙酶切，則在pShuttle-HREAF-E1能得到與外源目的片段E1和pShuttle-HREAF的XhoI和EcoRV雙酶切片段大小相同的兩條帶。
以上PCR及酶切鑑定結果表明pShuttle-R、pShuttle-HREAF及pShuttle-HREAF-E1構建正確。
4、pShuttle-HREAF-E1Δ55的構建及鑑定pShuttle-HREAF-E1Δ55的構建路線與pShuttle-HREAF-E1相似，只是把pShuttle-HREAF-E1構建示意圖(見圖3)中的E1 PCR產物換成E1Δ55PCR產物，最後構建成的穿梭質粒結構示意圖見圖4。
將pShuttle-HREAF和缺失E1b55的AdE1Δ55基因的PCR產物分別進行XhoI和EcoR V雙酶切，乙醇沉澱後如上述方法進行連接、轉化、篩選、鑑定，獲得在pShuttle-HREAF中插入了腺病毒AdE1Δ55基因的重組腺病毒穿梭質粒pShuttle-HREAF-E1Δ55。
pShuttle-HREAF-E1Δ55經過PCR及酶切鑑定後，將此質粒作為模板，以pShuttle MCS兩端引物對全部插入片段進行PCR鑑定，可見在插入了E1Δ55後，間距最終變為約2800bp。以特異引物E1a-up+E1bΔ55-down引物對PCR擴增E1Δ55，可得預期大小約為1720bp的特異外源片段。用XhoI和EcoR V雙酶切pShuttle-HREAF-E1Δ55，能酶切出與外源目的片段E1Δ55片段大小相同的特異條帶。PCR及酶切鑑定結果說明pShuttle-HREAF-E1Δ55構建正確。
實施例三 製備重組溶瘤腺病毒AdhafE1Δ551、採用AdEasy XL adenoviral vector system生產重組腺病毒(圖5)穿梭質粒構建好後，用PmeI將其線性化，與骨架質粒pAdEasy-1一起轉化BJ5183(Stratagene公司產品)感受態細菌。二質粒在菌體內同源重組，重組腺病毒質粒經卡那黴素抗性選擇，再經體外PacI酶切鑑定。重組腺病毒質粒經PacI酶切後應產生一條約30kb的大片段，和一條3.0kb(重組發生在左臂)或4.5kb(重組發生在pBR322複製起始位點)的小片段。未經PacI酶切的重組腺病毒質粒，在0.8％瓊脂糖凝膠電泳條帶上表現為頂部靠近上樣孔處的模糊條帶，經常還會有一條剛好在23kb DNA marker下面的小條帶。
鑑定後的重組腺病毒質粒被轉化至重組缺陷型菌株如JM109內大量擴增。純化後的重組腺病毒質粒即可經PacI酶切，暴露出左右ITR後經由Lipofectamine 2000(Invitragen公司)介導轉染293細胞(Stratagene公司產品)，包裝出目的重組腺病毒顆粒。
2、細菌中重組腺病毒質粒的產生和鑑定穿梭質粒pShuttl-HREAF-E1和pShuttl-HREAF-E1Δ55分別用PmeI將其線性化，分別與骨架質粒pAdEasy-1一起轉化BJ5183感受態細菌，鋪於卡那黴素抗性LB平板上選擇培養。在該受體菌中兩者的同源序列之間同源重組，重組後的質粒pAdhafE1和pAdhafE1Δ55具備卡那黴素抗性，因此只有都具備卡那黴素抗性的穿梭質粒pShuttl-HREAF-E1或pShuttl-HREAF-E1Δ55及重組質粒pAdhafE1或pAdhafE1Δ55可被選擇。挑出pAdhafE1及pAdhafE1Δ55克隆，抽提質粒，並用PacI酶切後，0.8％瓊脂糖凝膠電泳，根據電泳條帶大小鑑定pAdhafE1重組子見圖6和pAdhafE1Δ55重組子見圖7，圖8。可以見到未經PacI酶切的重組腺病毒質粒pAdhafE1和pAdhafE1Δ55，在0.8％瓊脂糖凝膠電泳條帶上表現為頂部靠近上樣孔處的模糊條帶，和一條剛好在23kb DNA marker下面的小條帶。經PacI酶切後，2個pAdhafE1重組子和4個pAdhafE1Δ55重組子均產生了一條約30kb的大片段和一條4.5kb(重組發生在pBR322複製起始位點)的小片段；另有2個pAdhafE1Δ55重組子產生了3.0kb(重組發生在左臂)的小片段，表明已在BJ5183細菌內成功地重組出了肝癌特異性溶瘤腺病毒質粒pAdhafE1和pAdhafE1Δ55。
3、哺乳動物細胞中產生腺病毒發明人選擇重組質粒pAdhafE1Δ55來進行重組腺病毒AdhafE1Δ55的包裝生產。
將重組質粒pAdhafE1Δ55大量擴增、純化，經PacI酶切，暴露出左右ITR後經由Lipofectamine2000介導轉染293細胞，進行重組腺病毒顆粒AdhafE1Δ55的包裝；或轉染HepG2細胞，在缺氧誘導培養條件下(1％O2，5％CO2和94％N2，37℃)進行重組腺病毒顆粒AdhafE1Δ55的包裝。
轉染後第7～8天，可見細胞出現病變，如圖9所示。
隨後病變區域逐漸擴大，直至完全病變。將細胞回收，凍融三次，釋放病毒，再分別接種於293細胞或HepG2細胞中，2天後細胞出現完全病變。將細胞回收，凍融三次，釋放病毒，離心取上清，提取重組腺病毒基因組DNA見圖10，作為PCR反應的模板，以雜合啟動子HREAF的上下遊引物對(HRE-up+AF0.3-down)進行PCR鑑定，同時設立以哺乳動物細胞基因組DNA為模板的陰性對照，結果如圖11所示。
雖然雜合啟動子HREAF片段中的兩個組成部分在哺乳動物細胞基因組DNA中均存在，但正常的哺乳動物細胞基因組DNA中並無HREAF這一雜合片段，因此可以確認在293細胞或HepG2細胞中包裝出的重組腺病毒即為AdhafE1Δ55。
快速CPE法測定重組腺病毒AdhafE1Δ55滴度約為2～3×106pfu/ml。
實施例四 AdhafE1Δ55對人肝癌細胞的特異殺傷作用使用上面實施例中經肝癌細胞HepG2包裝出的溶瘤腺病毒AdhafE1Δ55進行體外細胞水平的肝癌細胞特異殺傷試驗。
1、形態學觀察AdhafE1Δ55對人肝癌細胞的特異殺傷將5×104/孔人肝癌細胞系HepG2、Bel7402(購自中國醫學科學院基礎醫學研究所，國家ATCC細胞庫)和肺癌細胞系PLA801C(國家ATCC細胞庫保存)鋪於6孔板，以1×104pfu低劑量溶瘤腺病毒AdhafE1Δ55分別攻擊，缺氧誘導條件下(1％O2，5％CO2和94％N2，37℃)培養。結果，6天後HepG2、Bel7402細胞大部死亡，而PLA801C細胞則未受影響，生長正常。結果如圖12所示。
2、MTT實驗檢測AdhafE1Δ55對人肝癌細胞的特異殺傷將1～2×103/孔人肝癌細胞系HepG2、Bel7402和肺癌細胞系PLA801C鋪於96孔板，以1×104pfu低劑量溶瘤腺病毒AdhafE1Δ55分別攻擊，缺氧誘導條件下(1％O2，5％CO2和94％N2，37℃)培養。分別於24h、48h、72h及84h測定各孔細胞的光吸收值，繪製細胞生長曲線見圖13，並對各腫瘤細胞在各時間點上進行AdhafE1/55感染與否之間的生存狀況比較，以及對各腫瘤細胞之間在各時間點上進行生存率的比較(表1)。結合圖13和表1可以發現，人肝癌細胞系HepG2、Bel7402在感染AdhafE1Δ55 72h後，無論是相對於未感染AdhafE1Δ55的同種肝癌細胞，還是相對於也感染AdhafE1Δ55的肺癌細胞PLA801C，其存活細胞數均已顯著下降(P＜0.05)，而感染與未感染AdhafE1Δ55的肺癌細胞PLA801C之間在各時間點上的存活細胞數均無統計學上的差別(P＞0.05)。MTT實驗的結果說明重組溶瘤腺病毒AdhafE1Δ55可特異裂解、殺傷肝癌細胞HepG2和Bel7402。
表1 感染AdhafE1Δ55後腫瘤細胞生存狀況差異的t檢驗不同時間點生存率腫瘤細胞24h 48h 72h 84hHepG2-t/c 0.005551 0.088404 0.008462 0.000591Bel7402-t/c 0.002158 0.456552 0.012585 0.000114PLA801C-t/c 0.315335 0.98704 0.052304 0.737263HepG2--PLA801C 0.832517 0.061966 0.003758 0.002493Bel7402--PLA801C0.949824 0.522942 0.026352 0.003916HepG2--Bel7402 0.239669 0.216064 0.795694 0.280477(P值＜0.05為差異顯著)3、RT-PCR檢測E1a的表達以1×106pfu AdhafE1Δ55分別感染HepG2、Bel7402和PLA801C，缺氧誘導(1％O2，5％CO2和94％N2，37℃)培養3小時後，收集細胞，提取細胞總RNA，用RT-PCR檢測E1a的表達。結果在肝癌細胞HepG2和Bel7402檢測到了大小約為1000bp的E1a cDNA，說明AdhafE1Δ55在HepG2和Bel7402中表達了E1a，而在PLA801C中沒有表達見圖14。這個結果提示，在形態學觀察和MTT生化實驗中觀察到的AdhafE1Δ55對人肝癌細胞HepG2和Be17402的特異殺傷是由於該病毒在HepG2和Bel7402細胞中選擇性複製引起的。
序列表110中國人民解放軍軍事醫學科學院基礎醫學研究所120一種肝癌靶向性溶瘤腺病毒，其製備方法及用途130
16014170PatentIn version 3.2210121129212DNA213
4001ctcaagctta gctatgagtc tgggcttgg 29210221129212DNA213
4002ctcggatcct ttgggactgg agttgcttc 29210321131212DNA213
4003ctcggatcct ctgcaactta gggacaagtc a31210421128212DNA213
4004ctcaagcttg ttattggcag tggtggaa282105211900212DNA213
4005gtaatacgac tcactatagg gcgaattggg cccacgtcgc atgctcccgg ccgccatggc 60ggccgggaat tcgattctca agcttagcta tgagtctggg cttgggctga tagaagcctt120
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40014ctcgcatgcg ttattggcag tggtggaa 28
權利要求
1.一種肝癌靶向性溶瘤腺病毒，其特徵在於包含由缺氧應答元件HRE與AFP核心啟動子AF0.3構成的肝癌靶向性雜合啟動子和腺病毒E1區複製啟動基因，所說的腺病毒E1區複製啟動基因位於肝癌靶向性雜合啟動子的下遊。
2.根據權利要求1所述的腺病毒，其特徵在於所說的肝癌靶向性雜合啟動子具有序列表中序列7所示的核苷酸序列。
3.製備權利要求1或2所述的腺病毒的方法，其特徵在於包括以下步驟(1)克隆HRE和AF0.3及構建雜合啟動子HREAF；(2)構建腺病毒穿梭質粒pShuttle-HREAF-E1和pShuttle-HREAF-E1Δ55；(3)生產重組溶瘤腺病毒AdhafE1Δ55；(4)AdhafE1Δ55對人肝癌細胞的特異殺傷作用。
4.根據權利要求3所述的方法，其特徵在於克隆HRE和AF0.3及構建雜合啟動子HREAF包括以下步驟(1)設計引物，進行PCR擴增；(2)構建質粒pGEM-HRE和pGEM-AF0.3，並鑑定；(3)雜合啟動子HREAF的構建。
5.根據權利要求3所述的方法，其特徵在於構建腺病毒穿梭質粒pShuttle-HREAF-E1和pShuttle-HREAF-E1Δ55包括以下步驟(1)設計穿梭質粒構建所需引物；(2)製備pShuttle-R；(3)製備pShuttle-HREAF；(4)製備pShuttle-HREAF-E1；(5)製備pShuttle-HREAF-E1Δ55。
6.根據權利要求3所述的方法，其特徵在於生產重組溶瘤腺病毒AdhafE1Δ55包括如下步驟(1)將權利要求5構建好的腺病毒穿梭質粒線性化，經同源重組製備重組腺病毒質粒，酶切後轉染細胞，包裝出目的重組腺病毒顆粒；(2)細菌中重組腺病毒質粒的產生和鑑定將權利要求5構建好的腺病毒穿梭質粒線性化，轉化感受態細菌，抗生素平板選擇重組質粒pAdhafE1和pAdhafE1Δ55；(3)哺乳動物細胞中產生腺病毒將重組質粒擴增、純化，酶切後轉染細胞，包裝重組腺病毒顆粒。
7.權利要求1或2所述的重組腺病毒在製備肝癌治療藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種肝癌靶向性溶瘤腺病毒，其製備方法及用途。本發明的腺病毒是利用缺氧應答元件HRE和AFP核心啟動子AF0.3來構建雜合啟動子，構建保留有E1複製啟動區基因的重組腺病毒穿梭質粒，再經過同源重組構建重組腺病毒質粒，轉染細胞，包裝出目的重組腺病毒顆粒。本發明的腺病毒具有肝癌靶向性，能在肝癌細胞內自我複製，達到裂解癌細胞的目的。具有高效、無致突變作用、安全性高的優點，可用於製備肝癌的治療藥物。
文檔編號C12N15/11GK1603404SQ0312649
公開日2005年4月6日 申請日期2003年9月29日 優先權日2003年9月29日
發明者陸應鱗, 陳澤建, 杜芝燕, 徐丁堯, 藺會雲, 徐元基, 王妍 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院基礎醫學研究所