醯基載體蛋白-dna序列及合成的製作方法

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專利名稱:醯基載體蛋白-dna序列及合成的製作方法
本申請是1986年7月31日提交的美國專利申請891529號的後續部分。
醯基載體蛋白是於蛋白質可被分離作體外使用，或者可使蛋白於細胞內被轉移到葉綠體或與體內修變脂肪酸產生有關之細胞器內的條件下被轉錄的。本發明所提供的構建物可在種子組織中使用種子特異性啟動子表達醯基載體蛋白。
植物為食品原料和食物成品提供了豐富的來源。植物脂肪酸可廣泛用於多種工業目的，如作為植物油用於烹調，用作潤滑劑以及在醇酸樹脂中用作特殊化學品等。大部分植物脂肪酸為18碳原子的，通常只有少數脂肪酸具有16個以下的碳原子。就許多應用目的來說，期望具有8至14個脂肪酸的脂肪酸。為此，在建立生產其中大部分脂肪酸為14或少於14碳原子之植物油的方法上集中了相當大的興趣。
為達到這一目的，必須改變導致脂肪酸生成並使之伸長為較高級脂肪酸之代謝途徑的組成成分。為此，必須能夠產生一種或多種脂肪酸代謝鏈上的成分，並藉以改變植物代謝過程。此外，脂肪酸代謝途徑中的個別成分還可能具有重要的工業應用價值。
Kuo和Ohlrogge(Archives of Biochem.and Biophys.(1984)234290-296)描述了菠菜醯基載體蛋白的一級結構。Ohlrogge和Kuo(J.Biol.Chem.(1985)2608032-8037)報導了在不同組織中有不同表達的醯基載體蛋白的不同異構體。Crouch等人(J.Mol.Appl.Genet.(1983)2273-283)報導了編碼napin蛋白之cDNA的合成。
本發明提供了用於表達植物醯基載體蛋白的DNA構建物。特殊構建物是使用在種子成熟期間的植物胚胎中導致表達的轉錄起始區製成的。可通過改變參予脂肪酸生成之代謝途徑的葉綠體或相關細胞器中的組成成分來調節脂肪酸的量和組成。
本發明提供了生產醯基載體蛋白的方法及成分，其中醯基載體蛋白作為一種體外使用的或連同植物種子生成的終產物，可用以修變體內脂肪酸的表達。為此目的，須製備DNA構建物，其中是將編碼植物醯基載體蛋白的序列連接到在預期宿主中有表達醯基載體蛋白之功能的轉錄起始和終止調節區上。
該表達構建物在轉錄的5′-3′方向上提供了一個轉錄起始調節區(其為結構性的或調節性的)、一個編碼醯基載體蛋白之至少一種功能性蛋白的開放讀碼，期望包括一個用於轉位到葉綠體上作體內使用的轉換肽序列，以及一個在適當的宿主中有功能活性的轉錄終止調節區。
調節區將根據所用宿主而有所不同。當在原核或真核微生物，特別是單細胞宿主內表達時，可使用多種結構性的或可調節的啟動子。在這些情況下，製備醯基載體蛋白的主要目的是將此醯基載體蛋白於體外使用。
大多數情況下，構建物將包括在植物中有功能活性的調節區，用以提高醯基載體蛋白的產生，進而藉以提高和/或修變脂肪酸組成。
所用的編碼序列可得自於天然來源，亦可以是合成的，或者以此兩種途徑得到的。為從天然來源獲得基因，可使用多種植物或細菌作為基因的來源。這些植物包括菠菜、芸苔屬植物如油菜或甘藍型油菜、椰子、棉花、紅花、向日葵、萼距花等。用以獲得基因的各種方法包括製備基因組成cDNA文庫。可基於醯基載體蛋白的胺基酸序列來製備探針。因為不同來源的醯基載體蛋白之間存在有相當程度的免疫交叉反應性，故可利用原核和真核生物的多克隆抗體自某特殊來源中分離醯基載體蛋白，並進一步用於自其它植物來源分離醯基載體蛋白。之後測定整個的或部分的醯基載體蛋白序列，並基於肽序列設計探針。如只測得部分DNA序列，該部分序列即可滿足需要，或者移動基因以確保得到整個編碼序列。
一旦得到了預期的序列，即可以各種方法操縱之。當序列包括非編碼的側接區時，可使用核酸酶如Bal31切斷側翼區，亦可用限制性核酸內切酶作限制性酶切，或者使用體外誘變、引物修復來進行修飾，或者用其它方法向序列內引入突變或損傷。這樣即在天然存在的序列上完成了轉換、顛換、缺失和插入。此外，可以合成全部或部分序列，其中可改變一個或多個密碼子以提供修變了的胺基酸序列，或者引入一個或多個密碼子的突變以提供方便的限制性酶切點或達到其它與構建或表達有關的目的。可進一步使用合成的接合物或連接子，向基因內引入一個或多個方便的限制性酶切點。
醯基載體蛋白可以是任何一種可見於某特殊宿主內的同工酶，如由Ohlrogge和Kuo定名的見於菠菜中的ACP-Ⅰ和ACP-Ⅱ(見上述文獻)，或者見於其它植物宿主內的其類似物。
其中特別有用的是菠菜醯基載體蛋白，尤其是具有下列序列的ACP-Ⅰ。
菠菜 ACP-Ⅰ
a)cDNA序列b)由DNA序列推測出的胺基酸序列c)經蛋白質序列分析(Kuo和Ohlrogge，1984，上述文獻)測得的胺基酸序列＊b)和c)之間存在差異處該有用的序列通常有至少300bp，大多至少約360bp，較好是411bp，這裡的整個編碼序列包括411個鹼基對。此外，可能還有自編碼區之5′或3′末端伸展出的5′和3′非編碼側接區，長度可由1至200個或200個以上bp，通常有少於100bp，尤其是少於約10bp天然存在之非編碼側接區的起始密碼子的側翼。
編碼醯基載體蛋白或其功能性片段的開放讀碼在其5′端連接到轉錄起始調節區。有許多轉錄起始調節區均可利用，其提供了多種結構或調節功能，如包括結構基因的轉錄。根據所用宿主的不同，轉錄起始調節區可包括來自病毒、質粒之結構基因或染色體基因等的區域。前已述及的轉錄起始區有得自細菌和酵母宿主如大腸桿菌、枯草桿菌、啤酒酵母者，其包含有β-半乳糖苷酶基因、λ左或右啟動子、糖酵解酶啟動子等。用於植物的轉錄起始區是與nopaline、章魚鹼、mannopine、1，3-二磷酸核酮糖羧化酶(大和小亞基)、花椰菜鑲嵌病毒的全長啟動子、napin、雲扁豆蛋白等的結構基因有關的區域。
其中特別有用的是那些在種子生長期間受到調節的啟動子，尤其是在胚胎的子葉中合成的啟動子。這些調節區包括napin、雲扁豆蛋白和大豆球蛋白等基因的調節區。特別有用的調節區是得自芸苔屬，特別是油菜和甘藍型油菜者。調節區一般至少約150bp且不超過約3500bp，大多不超過約2500bp，可望不多於約1000bp。雖然Crouch等人(上述文獻)已描述了napin基因，但並沒有公開其調節區，亦沒有述及調節區在異源基因方面的應用。
轉錄起始調節區和編碼區可以直接連接，其中可存在有方便的限制性切點或者已向兩個區域引入了這樣的限制性切點，必要時亦可藉助於合成的接合物或連接子。許多調節區是作為質粒得到的，其中起始和終止調節區被一多聚連接子所分離，這樣即可得有許多適於結構基因插入的限制性切點。這些表達構建物大多是可為微生物宿主利用的。
儘管已分離出了在植物中有功能活性的許多轉錄起始和終止區(特別是由Ti和Ri質粒上的基因中得到的)，但這些區域並沒有達到包含多聚連接子、標誌物、複製系統等的真正可用之構建物的水平。再者，對於本發明來說，其主要興趣在於使表達得以調節，以便在種子中啟動轉錄過程。為此目的，基因如napin基因是有重要意義的。
可使用一篩選napin宿主(如Crouch，1983，上述文獻中所述的油菜種子宿主)之基因組文庫的探針來獲得napin調節區，該探針包含一相鄰於結構基因之3′或5′末端或中間編碼序列的序列。通過鑑定於嚴格條件下與探針雜交的片段，即可鑑定出具有napin結構基因的片段。可通過限制性酶切圖和DNA序列分析鑑定napin結構基因的潛在的調節序列5′端。可以在各種條件下操作這些序列，以全部或部分地除去編碼napin的密碼子，留下非編碼的5′區而沒有或基本上沒有napin編碼區。在某些情況下，可期望除去相鄰於起始密碼子的短的非編碼區，其一般是少於大約20bp，大多少於約10bp。有關更詳細的內容請參見實驗部分。
在將醯基載體蛋白結構基因的開放讀碼與轉錄起始調節區相連接之後，作為該構建方法的一個結果，功能性轉錄起始調節區即可被包含或引入其中。終止區可與起始區一樣來自同一結構基因即醯基載體蛋白基因，或者方便時可來自不同的結構基因。終止區通常包括終止密碼子和編碼聚腺苷酸化作用的序列。
可通過引入一用於細胞內轉位的單一序列，特別是引入到種子的白色體內或其它植物細胞的葉綠體內以括入基因或對其進行修變。
在組建表達構建物中，通常是將表達構建物或其片段的各種組分插入到能夠在細菌宿主如大腸桿菌中複製的常用克隆載體內。文獻已描述了大量的已有載體。
每次克隆後，可分離質粒並作進一步的操作，如限制性裂解、插入新的片段、連接、刪除、切斷、插入、體外誘變或引物修復，以便將各組分裁製成預期的序列。一旦製成構建物，之後即可轉移到適當載體內，以進一步依照轉化植物細胞的方法操縱之。
正常情況下，表達構建物將包括一個具有為在宿主中表達所必需的調節區，並提供為選擇轉化細胞所需之標誌物的結構基因。該基因可提供對細胞毒性劑如抗生素、重金屬、毒素等的抗性，同時為營養缺陷型宿主提供自養及病毒的免疫性等。根據不同宿主種的數目來引入表達構建物或其組分，可使用一個或多個標誌物，使不同的選擇條件適用於不同的宿主。
本發明所用將構建物引入植物宿主內的方法並不是很嚴格的。任何能提供有效轉化的方法均可使用。這些方法包括使用Ti或Ri質粒、微量注射、電穿孔、脂質體融合等。許多情況下，期望得到在一側或兩側由T-DNA接界的、特別是有左和右邊緣區，更好是有左邊緣區的構建物。當構建物使用根癌病土壤桿菌(A.tumefaciens)或髮根病土壤桿菌(A.rhizogenes)作轉化模型時這一特點是十分有用的，不過在使用其它轉化模型時T-DNA邊緣區也是有用的。
當將土壤桿菌(Agrobacterium)用於植物細胞轉化時，可使用能引入到土壤桿菌內、以與存在於土壤桿菌宿主中的Ti或Ri質粒的T-DNA進行同系重組的載體。含有用於重組之T-DNA的Ti或Ri質粒可以是有防護能力的(能夠引起癭形成)或沒有防護能力的(不能引起癭形成)，只有當vir基因存在於已轉化之宿主中時後一種情況才是可允許的。有防護能力的質粒可產生正常植物細胞和癭的混合體。
在某些使用土壤桿菌作為轉化植物細胞之載體的情況下，可將由T-DNA邊緣區接界的表達構建物插入到廣譜宿主載體內，文獻中已對這些廣譜宿主載體作了描述。最常用的是pRK2或其衍生物(如見Ditta等，1980，PNAS USA，777347-7351和歐洲專利申請0120515號，這些文獻已被列為參考文獻)。因已被表達構建物所包括，而且T-DNA貢獻一個或多個標誌物，這樣即充許選擇已轉化的土壤桿菌和已轉化的植物細胞。業已發現了許多可為植物細胞所用的標誌物，如抗氯黴素、氨基糖苷及潮黴素等的抗性標誌。對於本發明來說，使用何種抗性標誌並不重要，可根據特定宿主或構建方法來優選某種標誌物。
該表達構建物可為多種活性體植物所利用，特別是用於參予植物油生產的植物。這些植物包括芸苔屬，如甘藍型油菜(napus)和油菜(Campestris)、向日葵、紅花、棉花、萼距花屬(Cuphea)、大豆和穀物。
使用土壤桿菌轉化植物細胞時，可使外植體結合並與已轉化的土壤桿菌保溫足夠時間以使之轉化、之後殺死細菌並將植物細胞培養在一適當的選擇培養基內。一旦愈創組織形成，即可依照已知方法使用適當的植物激素來促進幼芽形成，並將幼芽移入適於植物再生的生根培養基內。之後使植物生長，長成種子並使種子反覆傳代並用以分離植物油。
亦可使用DNA序列作為探針，探尋在並非由其中得到基因的宿主中產生的醯基載體蛋白。此外，依照本主題發明所產生的醯基載體蛋白也被來製備檢測醯基載體蛋白的方法中所用的相應抗體。亦可將醯基載體蛋白連同葉綠體溶解產物一起使用來提高體外製得之脂肪酸的生產和/或改變脂肪酸組成。還可用醯基載體蛋白研究植物和細菌中脂肪酸生成的機理。
下列實施例旨在進一步闡明本發明，而不是對其加以限制。
實驗部分材料和方法克隆載體使用的克隆載體包括pUC載體，即pUC8和pUC9(Vieira和Messing，(1982)Gene 19259-268)、pUC18和pUC19(Norrande等，(1983)Gene26101-106;Yanisch-Perron等，(1985)Gene33103-119)，以及用氯黴素抗性基因交換上述pUC質粒的氨苄青黴素抗性作標誌物的類似載體(pUC-CAM〔pUC12-Cm，pUC13-Cm〕Buckley，K.，Ph.D.Thesis，U.C.S.D.，CA1985)。如用pUC-CAM的多克隆位點交換pUC18和pUC19載體的多克隆位點以產生出具CAM抗性的pCGN565和pCGN566。還使用了pUC118和pUC119。兩者分別是具有在pUC的NdeⅠ位點插入了M13之基因間區(即從5465處的HgiAⅠ位點到5941處的AhaⅢ位點)的pUC18和pUC19(得自於Vieira J.和Messing.J.，Waksman Institute，Rutgers University.Rutgers，N.J.)。
材料得自於Bethesda Research Laboratories的末端脫氧核苷酸轉移酶(TDT)、核酸核酸酶H(RNaseH)、大腸桿菌DNA聚合酶、T4激酶和限制性內切酶;得自New England Biolabs的大腸桿菌DNA連接酶;得自Life Sciences有限公司的反向轉錄酶;得自Amersham公司的同位素及得自Bachem有限公司(Torrance，CA)的Ⅹ-gal。
構建菠菜葉的cDNA文庫依照Facciotti等人(Biotechnology(1985)3241-246)所述的方法在4M硫氰酸胍緩衝液內自嫩菠菜葉中提取總RNA.按Maniatis等人(Molecular CloningA Laboratory Manual.，Cold Spring HarborLaboratory，New York，1982)所述的方法，將總RNA過Oligo(dT)-纖維素柱層析兩次得到poly(A)+RNA。依照Gubler和Hoffman(Gene，1983，25263-269)的方法，經稍加改進在pUC13Cm中構建cDNA文庫。在合成第一股cDNA中刪除RNasin(如果不完全除去它會干擾第二股cDNA合成)，而且按文獻中所述的方法用dCTP接尾載體DNA並用dGTP接尾雙股cDNA而不使之倒轉。依照Hanahan(J.Mol.Biol.(1983)166557-580)的方法使已退火的cDNA轉化到足夠的大腸桿菌JM83(Messing，Recombinant DNA Technical Bulletin，NlH Publication NO.79-99，2(1979)NO.243-48)細胞內並散布於含有50ug/ml氯黴素和0.005%X-Gal的LB瓊脂平皿上(Miller，Experiments in Molecular Genetics，(1972)，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York)。
菠菜ACP-ⅠcDNA的鑑定經與得自各代表200個cDNA克隆之40份儲集品的克隆分析(見下述)DNA作Southern吸印(Southern，J.Mol.Biol.(1975)98503)和斑點吸印(見下述)雜交，篩選出總共約8000個cDNA克隆。一個與菠菜ACP-Ⅰ之16胺基酸區域至少有66%同源性的5′末端標記的合成寡核苷酸(ACPP4)5′-GATGTCTTGAGCCTTGTCCTCATCCACATTGATACCAAACTCCTCCTC-3′互補於一個能編碼菠菜ACP-Ⅰ(Kuo和Ohlrogge，Arch.Biochem.Biophys.，(1984)234290-296)之殘基49-64，即16胺基酸肽glu-glu-glu-phe-gly-ile-asn-val-asp-glu-asp-lys-ala-gln-asp-ile的DNA序列被用作ACP探針。
按下述方法製備作Southern和斑點吸印雜交的克隆分析DNA將瓊脂平皿中的轉化體以每10ml培養基10個克隆的分組轉移到含50ug/ml氯黴素的LB培養基中。將培養物於37℃震蕩孵箱內保溫過夜，之後用等體積培養基稀釋並使之生長5小時以上。將20份樣品的內容混合得到各200個cDNA克隆的儲集品。按Birnboim和Doly(Nucleic Acids Res.，(1979)71513-1523)所述的方法自這些細胞中提取DNA。經用苯酚和氯仿提取，之後用乙醇沉澱，將DNA純化至能夠用限制性內切酶消化。將DNA重新懸浮於無菌的蒸餾水中，用EcoRⅠ和HindⅢ酶切各1ug之40份儲集的DNA樣品並通過0.7%瓊脂糖凝膠作電泳分離。用Southern吸印雜交技術將DNA轉移到硝酸纖維素濾膜上。
依照產品說明書推薦的方法，用r-32pdATP和T4激酶標記ACPP4的5′末端。依照Berent等人(BioTechniques(1985)3208-220)的方法，對得自克隆分析DNA之Southern吸印轉移的硝酸纖維素濾膜進行雜交(24小時，42℃)並洗滌。將各1ug DNA儲集物加於0.5M NaOH中的尼龍膜濾片上，以製備同一組DNA儲集物的斑點印跡。將這些印跡與探針在42℃下於50%甲醯胺/1%SDS/1M Nacl中雜交24小時，並於室溫下在2×SSC/0.1%SDS(1×SSC＝0.15M Nacl;0.015M檸檬酸鈉;SDS＝十二烷基磺酸鈉)中洗滌。將與ACPP4寡聚探針雜交的得自儲集物的DNA轉化到JM83細胞內並按上述方法鋪板以製得各自分離的轉化體。將DNA加於已與ACPP4寡聚探針雜交的硝酸纖維素濾膜上以製備這些個別cDNA克隆的斑點印跡，並使用對儲集的DNA樣品作Southern吸印分析的同樣條件進行分析。
核苷酸序列分析經用限制性內切酶消化分析陽性克隆pCGN1SOL，並製得如下的部分酶切圖。
前面的PstⅠ位點被接尾所破壞＊＊具有所示可利用之限制性酶切點的多聚連接子使用限制性酶切、連接、轉化和分析(Maniatis等，1982，上述文獻)等標準的實驗室技術將cDNA再克隆到pUC118和pUC119中。製備單股DNA模板並使用Sanger二脫氧技術(Sanger等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA(1977)745463-5467)測定DNA序列。序列分析是使用Intelli Genetics有限公司的程序機組完成的。
pCGN1SOL含有一在3′端包括A殘基之伸延部分的約700bp cDNA插入片段，該伸延部分代表了mRNA的poly(A)尾部。推測61位上的ATG密碼子是編碼MET的翻譯起始密碼子。該密碼子是411核苷酸開放讀碼的起始，其中核苷酸229-471編碼一個其胺基酸序列幾乎完全與Ohlrogge和Kuo(上述文獻)前已公開的ACP-Ⅰ之胺基酸序列相符的蛋白質。在前面列出的序列中指出了兩個胺基酸序列之間的差異。除成熟蛋白質外，pCGN1SOL還編碼-56殘基轉換肽序列，其可望是一種核編碼的葉綠體蛋白。
Napin啟動子的構建pgN1克隆(為一甘藍型油菜基因組DNA的3.3Kb EcoRⅠ片段，其含有一克隆到pUC8中的napin基因;該克隆得自於Marti Crouch，University of Indiana)上有napin基因之ATG起始密碼子的298核苷酸上遊區。用EcoRⅠ和SstⅠ酶切pgN1DNA並連接到經EcoRⅠ/SstⅠ裂解的pCGN706上。(pCGN706是含有另一napin cDNA克隆pN2(Crouch等，1983上述文獻)之3′區及聚腺苷酸化序列的XhoⅠ/PstⅠ片段，其中所說的pN2在SalⅠ和PstⅠ位點被克隆到了pCGN566中)。用SalⅠ酶切所得克隆pCGN707並用酶Bal31處理以除去napin基因的某些編碼區。用Bal31處理後，用SmaⅠ酶切所得切斷了的DNA並重新連接。依照大小選擇出克隆中的一個pCGN713，經用EcoRⅠ和BamHⅠ消化將其再克隆到EcoRⅠ/BamHⅠ酶切的pEBL18(Dente等，Nucleic Acids Res.，(1983)111645-1655)和pUC118中，分別得到E418和E4118。經對E418模板作Sanger二脫氧序列分析進一步確定Bal31消化的程度。對啟動子區的Bal31刪除只擴展到起始密碼子的57核苷酸下遊區，從而含有napin編碼序列的5′末端和5′非編碼區的大約300bp。按Zoller和Smith(Nucleic Acids Res.(1982)106487-6500)的方法，使用寡核苷酸引物5′-GATGTTTTGTATGTGGGCCCCTAGGAGATG-3′進行體外誘變，剪裁E4118以刪除包含ATG起始密碼子之napin的所有編碼區域。經兩次轉化到大腸桿菌菌株JM83(Messing，J.，上述文獻)內並用SmaⅠ消化假定的轉化株以篩選適當的突變體。所得napin，啟動子克隆即pCGN778且含有由pgN1之EcoRⅠ位點到恰在napin之ATG起始密碼子前的A核苷酸處的298個核苷酸。經用EcoRⅠ和BamHⅠ酶切並連接到EcoRⅠ/BamHⅠ消化的pCGN565上而將啟動子區再克隆到氯黴素抗性本底材料中，以得到pCGN779c。
napin啟動子克隆的延伸pCGN779c只含有潛在之5′調節序列的298個核苷酸。可用見於原始λBnNa克隆上5′-EcoRⅠ位點之上遊區的1.8Kb片段延伸napin啟動子。將包含napin區域的λBnNa(得自M.Crouch)的～3.5Kb XhoⅠ片段再克隆到SalⅠ酶切的pUC119中，得到pCGN930。使HindⅢ位點接近於5′XhoⅠ位點，以將pCGN930的HindⅢ/EcoRⅠ片段再克隆到HindⅢ/EcoRⅠ酶切的Bluescript+(載體克隆系統，San Diego，CA)中，得到pCGN942。將用EcoRⅠ和PstⅠ酶切的pCGN779c與用EcoRⅠ和PstⅠ酶切的pCGN942相連接，以延伸napin啟動子，得到pCGN943。該啟動子含有保留在λBnNa上之napin基因原始ATG的～2.1Kb上遊序列。
napin暗盒(napin Cassettes)使已延伸的napin啟動子與napin3′調節區相結合，以製得用於表達種子特異性基因的napin暗盒。所用的napin3′區來自於含有再克隆到EcoRⅠ/SalⅠ酶切的pCGN565中之pgN1的XhoⅠ/EcoRⅠ片段(XhoⅠ位點位於距napin基因的終止密碼子18個核苷酸處)的質粒pCGN1924。連接HindⅢ/PstⅠ酶切的pCGN943和pCGN1924，製得napin暗盒pCGN944，其具有用於插入基因的獨特的克隆位點SmaⅠ、SalⅠ和PstⅠ。
napin-ACP構建物連接用HindⅢ/BamHⅠ酶切的pCGN1SOL、用HindⅢ和BamHⅠ酶切的pUC8和用BamHⅠ酶切的pUC118，構建成pCGN796。經用BamHⅠ消化並連接到BamHⅠ酶切的pCGN565上，使pCGN796中的ACP基因轉移到氯黴素本底中。用EcoRⅠ和SmaⅠ酶切所得到的pCGN1902並連接到EcoRⅠ/SmaⅠ酶切的pUC118上得到pCGN1920。在NcoⅠ位點切斷pCGN1902中的ACP基因，用Klenow片段處理進行充填，用SmaⅠ酶切並再連接即形成pCGN1919。如此即除去了來自ACP基因的5′編碼序列並重新產生ATG。經用EcoRⅠ消化pCGN1919、在該位點用Klenow片段填充並連接-PstⅠ連接子，便使該ACP側接以PstⅠ位點。該克隆被稱為pCGN945。將pCGN945的ACP基因作為BamHⅠ/PstⅠ片段移到用BamHⅠ和PstⅠ酶切的pUC118上即製得pCGN945a，這樣SmaⅠ位點(由pUC118提供的)將是在ACP序列的5′末端，從而有利於克隆到napin暗盒pCGN944中。將用SmaⅠ和PstⅠ酶切的pCGN945a連接到用SmaⅠ和PstⅠ酶切的pCGN944上即產生napin ACP暗盒pCGN946。之後通過自HindⅢ位點克隆，將napin ACP暗盒轉移到雙載體pCGN783中，得到pCGN948。
pCGN783的構建pCGN783是一含有根癌病土壤桿菌之左和右T-DNA邊緣區(Barker等，Plant Mol.Biol.(1983)2335-350)、pPH1JI之慶大黴素抗性基因(Hirsch等，Plasmid(1984)12139-141)、花椰菜鑲嵌病毒(CaMV)(Gardner等，Nucleic Acids Res.(1981)92871-2890)之35S啟動子、Tn5(Jorgensen等，見下述;Wolff等，出處同上(1985)13355-367)之卡那黴素抗性基因及來自pTiA6(Barker等，(1983)上述文獻)轉錄本7之3′區的雙質粒。
為了得到慶大黴素抗性標誌，從pPH1JI的3.1Kb EcoRⅠ-PstⅠ片段中分離慶大黴素抗性基因並克隆到pUC9中產生pCGN549。用含有慶大黴素抗性基因的HindⅢ-BamHⅠ片段取代pCGN587的HindⅢ-BglⅡ片段產生pCGN594。
按下述方法製備pCGN587將含有APHⅡ(Jorgensen等，Mol.gen.Genet.(1979)17765)之完整結構基因的HindⅢ-SmaⅠ片段克隆到pUC8(Vieira和Messing，Gene(1982)19259)中，因為有一個EcoRⅠ位點直接鄰接於SmaⅠ位點，故可將該片段轉化到HindⅢ-EcoRⅠ片段中。之後將含有APHⅡ基因之3′部分的PstⅠ-EcoRⅠ片段與一EcoR-BamHⅠ-SalⅠ-PstⅠ連接子結合到pUC7的EcoRⅠ位點(pCGN546W)。因為該構建物並不貢獻卡那黴素抗性，故將APHⅡ基因的BglⅡ-PstⅠ片段插入到BamHⅠ-PstⅠ位點(pCGN546X)以得到卡那黴素抗性。這一處理過程重新裝配了APHⅡ基因，從而使EcoRⅠ位點接於基因的側翼區。一個ATG密碼子是在帶有APHⅡ ATG起始密碼子之讀碼區的上遊並在其外面。將來自APHⅡ之5′末端的Sau3A-PstⅠ片段(該片段沒有此過餘的ATG)插入到pCGN546W的BamHⅠ-PstⅠ位點，以提供質粒pCGN550，即避開了不需要的ATG密碼子。
之後將含有APHⅡ基因的EcoRⅠ片段克隆到pCGN451的獨特的EcoRⅠ位點(其含有一適於表達的章魚鹼合成酶暗盒)，以提供pCGN552(IATG)。
pCGN451包括章魚鹼合成酶表達暗盒，該暗盒含有通過EcoRⅠ連接子與pTiA6之章魚鹼合成酶基因的3′非編碼區相融合的約1556bp5′非編碼區。pTi等同物是如Barker等人(Plant Mol.Biol.(1983)2325)所限定之3′區的核苷酸11，207至12，823和5′區的核苷酸13，643至15，208。
按下述方法得到5′區。將一含有編碼區之5′未端的小的已再克隆的片段作為BamHⅠ-EcoRⅠ片段克隆到作為質粒pCGN407的pBR322中。編碼區中BamHⅠ-EcoRⅠ片段有一個XmnⅠ位點、而pBR322有兩個XmnⅠ位點。用XmnⅠ消化pCGN407，用Bal31核酸酶切斷並將EcoRⅠ連接子加至該片段上。EcoRⅠ和BamHⅠ消化後，將各片段按大小分級分離，克隆各部分並測定序列。一種情況是除去整個編碼區和5′非翻譯序列的10bp，脫離5′非轉錄區被除去，mRNA帽位點和5′非翻譯區的16bp(至BamHⅠ位點)是完整的。經在7%丙烯醯胺凝膠上電泳分離得到這一小的片段並洗脫出長約130bp的片段。
將這一按大小分離得到的DNA片段連接到M13mp9中，測定幾個克隆的序列並將此序列與章魚鹼合成酶基因的已知序列進行比較。M13構建物被定名為p14，用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切其質粒，以提供連接到含有pTiA6(GarfinKel和Nester，J.Bacteriol.(1980)144732)之上遊5′序列的XhoⅠ至BamHⅠ片段以及含有3′序列之EcoRⅠ至XhoⅠ片段的小片段。
將所得的XhoⅠ片段克隆到pUC8衍生物的XhoⅠ位點中，所得質粒稱為pCGN426。該質粒不同於pUC8在於具有用DNA聚合酶Ⅰ填充的單一EcoRⅠ位點，而且當將XhoⅠ連接子插入到pUC8的獨特HincⅡ位點時，由於HincⅡ限制性內切酶有核酸酶汙染物，故丟失了PstⅠ和HindⅢ位點。所得的質粒pCGN451在5′非編碼區(其具有包括T-DNA之右邊緣區、mRNA帽位點和5′非翻譯序列之16bp的1550bp5′未翻譯的序列)和3′區(其包括267編碼區、終止密碼子、196bp3′未翻譯的DNA、polyA位點和1，153bp3′未翻譯的序列)之間有一適於插入蛋白編碼序列的單一EcoRⅠ位點。pCGN451也提供了右側T-DNA邊緣區。
用EcoRⅠ酶切在適當定向上具有OCS5′和OCS3′的所得質粒pCGN451，並將得自含完整卡那黴素抗性基因之pCGN551的EcoRⅠ片段插入到EcoRⅠ位點，以提供在適當定向上有卡那黴素抗性基因的pCGN552。
這一OCS/KAN基因被用以為反轉型雙載體pCGN587提供可選擇標誌。
工程化章魚鹼合成酶啟動子暗盒的5′部分包括在bp15208-13644(Barker的序列編號)處始自XhoⅠ的pTiA6DNA，它還含有參予T-DNA轉移過程的T-DNA邊緣序列(邊緣區)。在質粒pCGN587中，來自pCGN552的OCS/KAN基因提供了一個可選擇的標誌及右側邊緣區。首先將左側邊緣區作為HindⅢ-SmaⅠ片段(pCGN502)(鹼基對602-2213)克隆到M13mp9中，並作為KpnⅠ-EcoRⅠ片段再克隆到pCGN565中以提供pCGN580。pCGN565是一基於pUC8-Cm的克隆載體，但保留有pUC18連接子。用BamHⅠ將pCGN580切成線狀並用於取代pVCK102(Knauf和Nester，Plasmid(1982)845)的較小BglⅡ片段，製得pCGN585。用得自含有OCS/KAN基因之pCGN552的XhoⅠ片段取代pCGN585的較小SalⅠ片段，得到pCGN587。
用得自pUC18的HindⅢ-BamHⅠ多聚連接子區取代含有5′-OCS-卡那黴素-OCS-3′(OCS是帶有5′標示之啟動子區和3′終止密碼區的章魚鹼合成酶基因，見美國專利申請775，923號，申請日為1985年9月13日)的pCGN594HindⅢ-BamHⅠ區域。
pCGN566含有已插入到pUC13-Cm之EcoRⅠ-HindⅢ位點之pUC18的EcoRⅠ至HindⅢ多聚連接子。將含有ORF1和-2pTiA6之pNW31C-8.29-1(Thomashow等，Cell(1980)19729)的HindⅢ-BglⅡ片段再克隆到pCGN566的HindⅢ-BamHⅠ位點產生pCGN703。
將含有轉錄本7之3′區(相當於pTiA6(Barker等，(1983)上述文獻)的鹼基2396-2920)的pCGN703之Sau3A片段再克隆到pUC18的BamHⅠ位點產生pCGN709。用pCGN587的EcoRⅠ-SmaⅠ片段(其含有卡那黴素抗性基因(APH3-Ⅱ))取代pCGN709的EcoRⅠ-SmaⅠ多聚連接子區產生pCGN726。
將pCGN726的EcoRⅠ-SalⅠ片段加上pCGN734的BglⅡ-EcoRⅠ片段之後插入到pUC8-Cm的BamHⅠ-SalⅠ位點中產生pCGN738。經刪去900bp EcoRⅠ-EcoRⅠ片段，即由pCGN738得到pCGN726c。
為了構建pCGN167，用AluⅠ消化得到CaMV(Gardner等，(1981)上述文獻)的AluⅠ片段(bp7144-7735)並克隆到M13mp7(Messing等，Nucl.Acid Res.(1981)9309-321)的HincⅡ位點，製得C614。用EcoRⅠ酶切C614，產生含有35S啟動子的來自C614的EcoRⅠ片段，將其克隆到pUC8(Vieira和Messing等，Gene(1982)19259)的EcoRⅠ位點得到pCGN146。
為了修剪啟動子區，用BglⅡ處理並用Bal31切斷BglⅡ位點(bp7670)，之後將BglⅡ連接子連接到Bgl31處理的DNA中得到pCGN147。
用BglⅡ酶切pCGN528並插入pCGN147的BamHⅠ-BglⅡ啟動子片段中，製得含有啟動子區、可選擇標誌(有兩個ATG的KAN)和3′區的pCGN148a。將該片段克隆到pCGN528的BglⅡ位點中，從而使BglⅡ位點緊接於pCGN528的卡那黴素基因的側翼。
依照下述方法製備用於這一構建物的穿梭載體。用HindⅢ-BamHⅠ酶切含Tn5(其中包含一卡那黴素基因)的質粒(Jorgenson等，Mol.gen.Genet.(1979)17765)，並將含卡那黴素基因的HindⅢ-BamHⅠ片段插入到pACYC184(Chang和Cohen，J.Bacteriol.(1978)1341141-1156)之四環素基因中的HindⅢ-BamHⅠ位點內，製得pCGN525。將用XhoⅠ連接子插入到SmaⅠ位點內修飾的pTiA6(Thomashow等，Cell(1980)19729-739)的BamHⅠ片段19插入到pCGN525的BamHⅠ位點中，製得pCGN526。經用XhoⅠ酶切並再連接以刪除pCGN526的XhoⅠ片段，得到pCGN528。
將pMB9KanXXⅠ的BamHⅠ-卡那黴素基因片段克隆到pCGN148a的BamHⅠ位點，得到pCGN149a。
pMB9 KanXXⅠ是一種pUC4K變異體(Vieira和Messing，Gene(1982)19259-268)，其具有XhoⅠ位點缺失，但含有來自Tn903的功能性卡那黴素基因，以允許在土壤桿菌中進行有效的選擇。
用BglⅡ和SphⅠ酶切pCGN149a。用BamHⅠ和SphⅠ酶切MⅠ(見下述)，並用分離到MⅠ的BamHⅠ-SphⅠ片段取代pCGN149a的這一小的BglⅡ-SphⅠ片段。如此即產生pCGN167，該構建物含有全長CaMV啟動子、1ATG-卡那黴素基因、3′未端和細菌的Tn903型卡那黴素基因。MⅠ是來自pCGN546X(見pCGN587的構建)的EcoRⅠ片段，並以一種使1ATG-卡那黴素基因中的PstⅠ位點鄰接於M13mp9之多聚連接子區的方式被克隆到M13mp9的EcoRⅠ克隆位點中。
將含有CaMV-35S啟動子、1ATG-卡那黴素基因和pTiA6之BamHⅠ-片段19 克隆到pUC19的BamHⅠ-HindⅢ位點內，製得pCGN976。將pCGN976的0.7Kb HindⅢ-EcoRⅠ片段(35S啟動子)和pCGN709的EcoRⅠ-SauⅠ片段(轉錄本7∶3′)克隆到pCGN566的HindⅢ-SalⅠ位點，製得pCGN766c。
將pCGN766c的0.7Kb HindⅢ-EcoRⅠ片段(CaMV-35s啟動子)連接到pCGN726c中的1.5Kb EcoRⅠ-SalⅠ片段(1ATG-KAN3′區)上，插入到pUC119的HindⅢ-SalⅠ位點產生pCGN778。用含有CaMV-35S啟動子和1ATG-KAN-3′區之pCGN778的2.2Kb區即HindⅢ-SalⅠ片段取代pCGN739的HindⅢ-SalⅠ連接子區，產生pCGN783。
通過轉化作用將pCGN948引入根癌病土壤桿菌EHA101(Hood等，J.Bacteriol.(1986)1681291-1301)內。將2ml EHA101的培養物在MG/L液體培養基中於30℃保溫過夜。取0.5ml接種於100ml MG/L液體培養基(Garfinkel和Nester，J.Bacteriol.(1980)144732-743)中，並使之在振蕩孵箱中於30°生長5小時。於7K離心沉澱細胞，重新懸於1ml MG/L液體培養基中並置於冰上。將大約1μg pCGN948DNA放入已加了200μl EHA101懸液的100μl MG/L液體培養基中;將含有DNA-細胞混合物的試管立即放入乾冰/乙醇浴中5分鐘，在37℃水浴中將試管內容快速融溶5分鐘，之後加入1ml新鮮MG/L培養基並於30℃振蕩2小時。離心收集細胞沉澱物並分散於含有100mg/L慶大黴素的MG/L平皿(1.5%瓊脂)上。自單個的慶大黴素抗性菌落分離質粒DNA，重新轉化到大腸桿菌內，並通過限制性內切酶定性分析以確證卡那黴素抗性EHA101含有pCGN948的完整拷貝。收集單個菌落並通過在含有100mg/L慶大黴素的平皿上作兩次以上劃線而純化之。
將甘藍型油菜(Wester變種)的種子在95%乙醇中浸泡4分鐘。浸於每100ml無菌溶液含50μl「Tween20」表面活性劑的1%次氯酸鈉溶液中滅菌。浸泡45分鐘後，用無菌蒸餾水將種子洗滌4次。將其植於寬7Cm、長7Cm、高10Cm，含50ml MS(Murashige最小量有機物培養基，Gibco)的無菌塑料盒(Magenta)內，其中MS的濃度為10/10(10/10th)，加有吡多素(50μg/L)、煙酸(50μg/L)、甘氨酸(200μg/L)，並用0.6%瓊脂固化。使種子於22℃在16小時-8小時光-暗循環(光強度約為65μEm-2s-1)條件下發芽並生長。5天後於無菌操作下取出籽苗，切掉下胚軸並切成長約4mm的碎片。將下胚軸碎片放在飼養平皿上，或者在固化的B50/1/1或B50/1/0培養基上之濾紙的頂上而沒有飼養層。B50/1/0培養基含有B5鹽和維生素(Gamborg，Miller和Ojima，Experimental Cell Res.(1958)50151-158)、3%蔗糖、2，4-二氯苯氧基乙酸(1.0mg/L)，pH調到5.8，且培養基是用0.6%Phytagar固化的;B50/1/1除含有上述成分外，另外還加有1.0mg/L激動素。經在B50/1/0或B50/1/1培養基上吸移1.0ml靜止期菸草懸浮培養物(按Fillatti等人，Mol.gen.Genet.(1987)206192-199中所述方法維持的)將飼養皿預先製備24小時。切下下胚軸碎片並在作土壤桿菌處理之前於飼養皿上放置24小時。
於30℃在MG/L液體培養基上孵育土壤桿菌的單個菌落，製備根癌病土壤桿菌(菌株EHA101×948)。16小時後收穫細菌並在MG/L液體培養基中製成每毫升108細菌的細菌懸液。將下胚軸碎片放入土壤桿菌懸液內並使之靜置30-60分鐘，以使細菌接種到下胚軸碎片上，之後移出並轉移到含有B50/1/1或0/1/0培養基(0/1/1是指1mg/L2，4-二氯苯氧基乙酸和1mg/L激動素，而0/1/0是指沒有激動素)之培養皿內。於22℃低光照下溫育之。細菌與下胚軸碎片共保溫24-48小時。移去下胚軸碎片並放在含500mg/L羧苄青黴素(有時是加濃度為10、25或50mg/L的硫酸卡那黴素)的B5 0/1/1或0/1/0培養基上，於22℃連續光照(光強度約65μEm-2s-1)下溫育7天。將碎片轉移到含1%蔗糖、3mg/L苄氨基-嘌呤和1mg/L玉米素的B5鹽培養基內，該培養基添加有500mg/L羧苄青黴素、10、25或50mg/L硫酸卡那黴素，並用0.6%Phytagar(Gibco)固化之。此後，每兩周為外植體換一次新鮮培養基。
一個月後即由在含卡那黴素之培養培上選擇的綠色愈創組織長出綠色嫩芽。幼苗繼續發育3個月。當其至少有1Cm長時，由愈創組織上切掉嫩芽並置於含1%蔗糖、不加生長物質、含300mg/L羧苄青黴素、並用0.6%Phytagar固化了的B5培養基上。使幼苗繼續生長並摘取幾片葉試驗新黴素磷酸轉移酶Ⅱ(NPTⅡ)活性。將得有NPTⅡ活性陽性結果的幼苗放在裝有含1%蔗糖、2mg/L吲哚丁酸、20mg/L羧苄青黴素，並用0.6%Phytagar固化了的B50/1/1培養基的Magenta盒子內。幾周後幼苗長出根並移到土壤中。該植物在生長室(growth Chamber)內，於22℃在16-8小時光-暗循環(光強度220μEm-2s-1)條件下生長並於幾周後移入溫室內。
Southern吸印分析資料試驗了自含pCGN948之根癌病土壤桿菌EHA101與甘藍型油菜下胚軸之混合細胞培養所再生的甘藍型油菜植物的適當整合及菠菜葉ACP基因的胚胎特異性表達。Southern分析是依照Dellaporta等人(plant Mol.Biol.Rep.(1983)119-21)的方法，使用由再生之植物的葉子分離的DNA進行的，並通過在CsCl梯度中成帶而一次離心純化的。用限制性內切酶EcoRⅠ切斷DNA(10μg)，在0.7%瓊脂糖凝膠上電泳並吸印轉移到硝酸纖維素濾膜上(見Maniatis等(1982)上述文獻)。用含有1.8Kb菠菜ACP序列的pCGN945DNA，或用自含有32p-dCTP標記(按製造商推薦的缺口翻譯方法，使用BRL缺口翻譯試劑盒〔Bethesda Research Laboratories，Gaithersburg，MD.〕完成這一標記)之napin 5′序列的pCGN936c(其為將pCGN930的HindⅢ/EcoRⅠ片段轉移到pCGN566中製得的)分離的EcoRⅠ/HindⅢ片段探查印跡。將印跡於42℃在50%甲醯胺、10×Denhardt氏試劑、5×SSC、0.1%SDS、5mMEDTA、100μg/ml牛胸腺DNA及10%硫酸葡聚糖(只用於雜交)中預雜交和雜交(各試劑已在Maniatis等(1982)上述文獻中述及)。在1×SSC、0.1%SDS中洗30分鐘並在0.1×SSC、0.1%SDS中於55℃洗兩次。
放射自顯影結果表明有兩條大約3.3和3.2Kb的帶雜交到得自四株植物之DNA的EcoRⅠ消化產物中，因為3.3和3.2Kb EcoRⅠ片段是存在於pCGN948的T-DNA區內，所以當用ACP基因(pCGN945)探查時，即判定了菠菜葉ACP構建物在植物基因組中的適當整合。用napin5′序列探查時，正如由測得的植物DNA-構建物DNA邊緣區片段之序列的序數所確定的，基因構建物存在於不同植物之單一或多個座位中。
Northern吸印分析資料經Northern吸印分析法檢測自napin啟動子整合之菠菜葉ACP基因的表達，結果表明在已轉化植物之一的種子中而不是葉子中含有構建物DNA。開花後21天由轉化的種子收集發育中的種子。自種子內切除胚胎並冷凍於液氮中。按Crouch等人(1983，上述文獻)的方法由已轉化之植物的種子胚胎和葉子中分離總RNA，按已知方法(Shewmaker等，Virology(1985)140281-288)在含甲醛的1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，並吸印到硝酸纖維素濾膜上(Thomas，Proc.Natl.Acad Sci USA(1980)775201-5205)。按上述方法對印跡預雜交、雜交並洗滌。該探針為一自pCGN945(只含有以缺口翻譯法標記的菠菜葉ACP序列)分離的PstⅠ/BamHⅠ片段。在已轉化之植物的胚胎材料中而不是葉子材料中檢測到～0.8Kb RNA帶，這就證明菠菜葉ACP基因的種子特異性表達。
雖然在ACP部分是大腸桿菌ACP時，亦顯示較高等植物脂肪酸生物合成基因可識別醯基-ACP底物，但不同來源的不同形式的ACP仍有可能影響體內脂肪酸合成的效率和/或終產物。例如，菠菜(Ohlrogge與Kuo，Biol.Chem.(1985)2608032-8037)和大麥(Hoj與Svendsen，Carlsberg.Res.Commun.(1984)49483-492)即含有不止一種形式的ACP。為了力求使用不同形式的ACP提高油料種子作油的價值，故分離並定性了見於油料種子作物蕪菁油菜(Brassica Campestris)中之ACP基因的cDNA拷貝。
以下是使用得自油菜而不是甘藍型油菜的napin啟動子將ACP基因整合到嵌合基因(Chimeric gene)內的方法。
自油菜(Brassica Campestris)變種「R-500」(蕪菁油菜的一種自身兼容性變種)收集未成熟的種子。在相當於大約開花後14至28天時收集整個種子。依照上述分離菠菜ACPcDNA克隆的方法，分離RNA並製備cDNA庫。為了探查cDNA文庫，用380A型Applied Biosystems DNA合成儀，依照廠商推薦的方法合成寡核苷酸(5′)-ACTTTCTCAACTGTCTCTGGTTTAGCAGC-(3′)。該合成的DNA分子以低嚴格程度雜交到編碼胺基酸序列(ala-ala-lys-pro-glu-thr-val-glu-lys-val)的DNA或RNA序列上。據報導，自甘藍型油菜(Brassica napus)的種子分離的ACP(Slabas等，7th International Symposium of the Structure and Function of Plant Lipids，University of California，Davis，CA，Plenum Press，N.Y.1987)與來自油菜(B.Campestris)種子之ACP的胺基酸序列是高度同源的。使用菌落雜交技術(Taub和Thompson，Anal.Biochem.(1982)126222-230)及相當於Wood等人(Proc.Natl.Acad.Sci(1985)821585-1588)所述之雜交條件下分析大約2200個不同的cDNA克隆。對兩個顯示與寡核苷酸探針產生明顯雜交之cDNA克隆的DNA序列分析結果表明，其中一個克隆，定名為pCGNIBcs，其所編碼的胺基酸序列與前述得自甘藍型油菜之ACP蛋白的胺基酸序列(Slabas等，上述文獻)具有顯著的同源性(相類性)，故證明其為編碼ACP-前體蛋白的克隆。pCGN1Bcs(亦稱為AGB1)的DNA序列如下所示
為了使油菜(Brassica Campestris)種子ACP在轉換基因之甘藍型油菜(B.napus)得以高水平的胚胎特異性表達，按前述製備pCGN946的方法使用編碼菠菜ACP的DNA序列，製成一相似於胚胎特異性嵌合基因的嵌合型基因。將pCGN1Bcs ACP編碼區裝配到存在於pCGN1803(見下述)中的油菜napin型啟動子元件內。
油菜(B.Campestris)napin啟動子暗盒的構建使用已建立的方法(Maniatis等，(1982)上述文獻)在λ載體Charon35中製得油菜DNA的BglⅡ部分的基因組文庫。經放大之文庫的滴度為～1.2×109個噬菌體/ml。使40萬個重組噬菌體於37℃經20分鐘吸附於DH1大腸桿菌細胞(Hanahan D.，J.Mol.Biol.(1983)166557)後，於NZY+10mM MgSO4+0.9%瓊脂糖中以每個9×9吋平皿105個噬菌體的密度在NZY平皿(NZYM如Maniatis等人(1982)在上述文獻中所述)鋪板。平皿於37℃保溫～13小時，於4℃冷卻2.5小時，並通過在平皿上鋪敷預切割的濾膜約1分鐘，並剝脫之，以使噬菌體吸附到基因濾網附加物(Gene Screen Plus)(New England Nuclear)上。使濾膜在1.5M Nacl、0.5M NaOH上漂浮1分鐘;在1.5M Nacl、0.5MTris-Hcl(pH8.0)中中和2分鐘，並在2×SSC中漂浮3分鐘以固定已吸附的噬菌體DNA。將濾膜風乾直到稍為潮溼，按前述Southern吸印分析的方法，於42℃進行預雜交和雜交。使用cDNA克隆BE5的XhoⅠ/SalⅠ片段(該片段是使用探針pN1(Crouch等，1983，上述文獻)自上述油菜(B.Campestris)種子cDNA文庫中分離的)，探查濾膜上含napin的克隆。有三個噬斑雜交在成對的濾膜上，並按前已述及的方法(Maniatis等(1982)上述文獻)純化噬斑。
以下是BE5 CDNA序列。
BE5 CDNA 長度＝734
製作其中一個定名為λCGN1-2之克隆的限制性酶切圖(基因圖)，napin基因被定位到與2.7Kb XhoⅠ和2.1Kb SalⅠ交搭的兩個限制性片段上。將這兩個片段由λCGN1-2DNA再克隆到pCGN789(為一相同於pUC119的pUC基載體，其中正常多聚連接子被合成的連接子-5′GGAATTCGTCGACAGATCTCTGCAGCTCGAGGGATCCAAGCTT3′-〔其代表多聚連接子EcoRⅠ、SalⅠ、BglⅠ、PstⅠ、XhoⅠ、BamHⅠ、HindⅢ〕所取代)中。通過序列分析，進一步證實此亞克隆即napin。測定了整個編碼區以及伸延之5′上遊和3′下遊序列。
λCGN1-2NCG-186 長度＝4325線形序列
λCGN1-2napin基因為編碼相對應於BE5cDNA的mRNA者，經測定證明它們的核苷酸序列是準確匹配的。
按照構建pCGN944的相似方法，自λCGN1-2napin基因的5′末端和3′末端構建表達暗盒。經用SalⅠ酶切並再連接刪除pCGN940的大部分napin編碼區，以產生pCGN1800。使用合成的寡核苷酸5′-GCTTGTTCGCCATGGATACTTGTGTATGTTC-3′，將得自pCGN1800的單股DNA用於體外誘變反應(Adelman等，DNA(1983)2183-193)。該寡核苷酸在napin基因的啟動子區與ATG起始密碼子的連接處插入了一個EcoRⅠ和NcoⅠ限制性酶切位點。通過與用於誘變的寡核苷酸雜交以鑑定出一適用的突變體，分析其核苷酸序列並定名為pCGN1801。
經用EcoRⅠ部分消化並連接到用EcoRⅠ切斷的pCGN786(為一pCGN566氯黴素抗性基載體，其中以上述合成的連接子代替正常多聚連接子)上以再克隆一得自pCGN1801的1.7Kb啟動子片段，再用DNA聚合酶ⅠKlenow片段填成平頭，產生pCGN1802。經連接於用XhoⅠ和HindⅢ酶切的pCGN941將來自λCGN1-2napin基因的3′序列加到XhoⅠ/HindⅢ酶切的pCGN1802上從而完成暗盒的構建。所得到的表達暗盒，即pCGN1803含有1.725Kb napin啟動子序列以及1.265Kb napin3′序列，其間具有獨特的克隆位點SalⅠ、BglⅡ、PstⅠ和XhoⅠ。
用XhoⅠ和EcoRⅠ雙重切斷來自pCGN1Bcs的ACP-前體編碼區並連接到預先用SalⅠ和EcoRⅠ酶切的克隆載體pUC18上。將已連接的DNA轉化到適當的大腸桿菌宿主中，並使用pUC載體的青黴素抗性、蘭-白篩選系統(Vieira和Messing，Gene(1982)19259-268)篩選即產生含有一位於ACP前體編碼區終止密碼子下遊之唯一Dra3位點的質粒。用Dra3消化之後與PstⅠ連接子連接產生一個其中編碼區作為BglⅡ至PstⅠ片段被整齊地切斷的質粒，其中所說的片段被克隆到pCGN1803的PstⅠ和BglⅡ位點中，且該ACP前體編碼區至pCGN1803編碼的胚胎特異性表達信息之napin啟動子和終止子有著適宜的定向。之後將所得的嵌合基因引入雙載體中並轉移到土壤桿菌內，以使用上述適於pCGN946中菠菜ACP嵌合基因的同樣條件與甘藍型油菜下胚軸碎片共培養。
根據本主題發明，提供了編碼功能性醯基載體蛋白特別是植物醯基載體蛋白的序列，其可作為探針用於檢測醯基載體蛋白基因的存在、自植物和細菌材料中篩選基因組或cDNA文庫、以及用於某些分析法中以檢測醯基載體蛋白基因的存在等。此外，編碼序列可被用於製備表達構建物，編碼序列與轉錄和翻譯起始及終止調節區結合用以在適當宿主(即調節區在其中是有功能活性的)中完成表達。本發明特別涉及到使用ACP編碼序列連同在植物中有功能活性的、特別是處於調節下的轉錄起始區，以實現在種子中的表達。以這種方法可提高種子油的生產並適於調節其脂肪酸組成。
本說明書中引用的所有出版物和專利申請體現了本發明所屬領域內熟練技術人員的技術水平。列為本文參考文獻的所有出版物和專利申請與特別指出的各個出版物或專利申請有著同樣的參考意義。
雖然為了清楚理解本發明之目的，前面已通過闡述和實施例較為詳細地描述了發明的內容，但應明確指出的是，在本發明待批權利要求
的範圍內可以實踐某些改動或改進。
權利要求
1.編碼植物醯基載體蛋白的cDNA序列。
2.根據權利要求
1的cDNA序列，其中所說的植物是菠菜。
3.根據權利要求
1的cDNA序列，其中所說的植物是芸苔屬植物。
4.根據權利要求
3的cDNA序列，其中所說的芸苔屬植物是油菜。
5.根據權利要求
3的cDNA序列，其中所說的芸苔屬植物是甘藍型油菜。
6.包含編碼植物醯基載體蛋白之開放讀碼的DNA構建物，所說的開放讀碼結合於在細胞宿主中有功能活性的轉錄和翻譯起始及終止調節區並在其調節控制之下，其中至少有一種所說的調節區不同於所說開放讀碼的野生型區。
7.根據權利要求
6的DNA構建物，其中所說的開放讀碼編碼菠菜或芸苔屬植物醯基載體蛋白。
8.根據權利要求
6的DNA構建物，其中所說的調節區是在植物宿主中有功能活性的。
9.根據權利要求
8的DNA構建物，其中所說的轉錄起始區是在細胞分化期間被調節的。
10.根據權利要求
9的DNA構建物，其中所說的調節適於調節發育中的胚胎內的轉錄過程。
11.根據權利要求
10的DNA構建物，其中所說的轉錄起始調節區是napin調節區。
12.包含根據權利要求
6至11中任一項之DNA構建物的Ti或Ri質粒。
13.包含根據權利要求
6至11中任一項之DNA構建物的植物細胞。
14.根據權利要求
13的植物細胞，其中所說的植物細胞是胚胎細胞及種子的一部分。
15.根據權利要求
14的植物細胞，其中所說的植物是芸苔屬植物。
16.一種提高植物種子油生成的方法，其包括，使植物由小植物成長生出種子，其中所說的植物的細胞內含有根據權利要求
8的構建物，收穫所得到的提高了植物油含量的種子。
17.根據權利要求
16的方法，其中所說的植物是芸苔屬植物。
18.根據權利要求
16或17中任一項的方法，其中所說的轉錄起始調節區是napin區。
專利摘要
本發明提供了編碼醯基載體蛋白的DNA序列，該序列可用於生產作為終產物的醯基載體蛋白或在植物種子中提高種子油產量。還提供了被調節的啟動子，其基本上可限定醯基載體蛋白在種子組織中的表達。
文檔編號C07K14/415GK87106119SQ87106119
公開日1988年4月27日 申請日期1987年7月31日
發明者讓·C·克裡, 維·C·克瑙夫 申請人:加利福尼亞基因公司導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan