神經壞死病毒的rt-pcr檢測方法

2023-11-07 19:07:07

專利名稱：神經壞死病毒的rt-pcr檢測方法
技術領域：
本發明涉及病毒的檢測方法，尤其是涉及一種神經壞死病毒(Nervous necrosis virus, NNV)的 RT-PCR 檢測方法。
背景技術：
神經性腦病和視網膜病是一種由神經壞死病毒(Nervous necrosis virus, NNV)引起的病毒性神經壞死，該病的特點是引起魚類腦部和視網膜壞死和空泡化、遊泳異常和身體變黑([l]Mori K, Nakai Τ, Muroga K, Arimoto Μ, Mushiake K, Furusawa I Properties of a new virus belonging to nodaviridae found in larval striped jack(Pseudocaranx dentex)with nervous necrosis. Virology 1992,187(1) :368-371; [2]Lin C-C, Lin JH-Y, Chen M-S, Yang H-L :An oral nervous necrosis virus vaccine that induces protective immunity in larvae of grouper(Epinephelus coioides). Aquaculture 2007，268 (0044-8486) :265-273)。NNV 在全世界範圍內造成了大量海洋硬骨魚幼魚和未成年魚的死亡，並且被感染的硬骨魚種類也在逐年增加([3]Munday BL, Kwang J，Moody N :Betanodavirus infections of teleost sh :a review. Journal of Fish Diseases 2002，25 :127士 142)。根據其核苷酸序列、基因組結構、蛋白性質和血清學種類，發現病毒性神經壞死的病因——NNV，一種野田科病毒(Nodaviridae) ([4]Morit K， Mangyoku T， Iwamoto T， Arimoto Μ， Tanaka S， Nakai T-Serological relationships among genotypic variants of betanodavirus. Dis Aquat Organ 2003,57 (1-2) :19_26)。 NNV是一種直徑約為25-30nm的無包膜二十面體顆粒，遺傳物質包含兩條正意RNA單鏈， RNAl和RNA2。RNAl編碼一種RNA依賴的RNA聚合酶，而較小的RNA2編碼外膜蛋白([5] Lai YSiJohn JAjGuo IC,Chen SCiFang K,Chang CY:In vitro efficiency of intra-and extracellular immunization with mouse anti-YGNNVantibody against ye1low grouper nervous necrosis virus. Vaccine 2002，20 (25-26) :3221-3229 ; [6]Shieh JR, Chi SC :Production of monoclonal antibodies against grouper nervous necrosis virus (GNNV) and development of an antigen capture ELISA. Dis Aquat Organ 2005， 63(1) :53-60.) ο Nishizawa等人發現SJNNV外膜蛋白基因長1410bp，包含一個1023bp 的 0RF，編碼 340 個胺基酸，約 42kDa 的蛋白([7]Nishizawa Τ, Mori K，Furuhashi M， Nakai Τ,Furusawa I, Muroga K-Comparison of the coat protein genes of five fish nodaviruses,the causative agents of viral nervous necrosis in marine fish. JGen Virol 1995, 76 (Pt 7) :1563-1569.)。根據外膜蛋白部分基因序列進行系統分析，神經壞死病毒可分為四大種類黃帶揭餘神經壞死病毒(striped jack nervous necrosis virus, SJNNV)、紅鰭東方飩神經壞死病毒(tiger puffer nervous necrosis virus，TPNNV)、條斑星蝶神經壞死病毒(barfin flouder nervous necrosis virus，BFNNV)禾口赤點石斑魚神經壞死病毒(red-spotted grouper nervous necrosis virus, RGNNV) ([8]Dalla Valle L， Toffolo V，Lamprecht M，Maltese C，Bovo G，Belvedere P，Colombo L !Development ofa sensitive and quantitative diagnostic assay for fish nervous necrosis virus based on two-target real-time PCR. Vet Microbiol 2005，110 (3—4) :167-179)。逆轉錄鏈式聚合酶反應(RT-PCR)是一種用於檢測病毒和類病毒很有效、很流行的實用方法。這種方法之前已經應用到了一系列魚病病毒的檢測中，包括病毒性出血症敗血症病毒(viral hemorrhagic septicemia virus, VHSV)([9]Guillou JP, Merle G，Henault S，Hattenberger AM [Detection of viral hemorrhagic septicemia virus (VHSV) in rainbow trout(Oncorhynchus mykiss)by reverse transcription followed by polymerase chain reaction. Diagnostic validation]. Vet Res 1999， 30(1) :49-60.)、sleeping disease virus([10]Villoing SiCastric J,Jeffroy J,Le Ven A, Thiery R，Bremont M :An RT—PCR—based method for the diagnosis of the sleeping disease virus in experimentally and naturally infected salmonids. Dis Aquat Organ 2000，40 (1) :19-27.)、大馬哈魚傳染性貧血症病毒(infectious salmon anaemia virus) ([ll]Mikalsen AB, Teig A，Helleman AL, Mj aaland S，Rimstad E-Detection of infectious salmon anaemia virus (ISAV) by RT-PCR after cohabitant exposure in Atlantic salmon Salmo salar. Dis Aquat Organ 2001，47 (3) : 175-181.)水生呼腸孤病毒屬(fish aquareovirus) ([12]Seng EK, Fang Q，Lam TJ, Sin YM !Development of a rapid, sensitive and specific diagnostic assay for fish Aquareovirus based on RT-PCR. J Virol Methods2004,118 (2) :111-122.)、敗血症病毒(hemopoietic necrosis virus) ([13]Popova AG,Oreshkova SF,Zhchelkunov IS,Rudakova SL,Zhchelkunova Tl， Tikunova NV, Blinova NN, Il' ichev AA : [RT-PCR-based methods for identification and typing of infectious hemopoietic necrosis virus in salmons]. Vopr Virusol 2008,53(3) :39-43.) ο在過去的幾年裡，使用引物對592/1017，釆用RT-PCR檢測NNV已經在幾個實驗室使用([14]Nishizawa T，Mori K_i，Nakail T，Iwao urusawa ，MurogA K !Polymerase chain reaction (PCR) amplification of RNA of striped j ack nervous necrosis virus (SJNNV). DISEASES OF AQUATIC ORGANISMS 1994，18 :103-107.)。神經壞死病毒對幼魚和未成年魚的致死率很高，對網箱養殖造成巨大的聚集損失。但是目前還沒有一種簡單，經濟的治療方法，那麼在感染初期有效檢測該病毒就顯得非常重要([2]Lin C-C, Lin JH-Y, Chen M-S, Yang H_L An oral nervous necrosis virus vaccine that induces protective immunity in larvae of grouper (Epinephelus coioides). Aquaculture 2007，268 (0044-8486) :265-273.)。在過去的幾年裡，幾種檢測神經壞死病毒的方法得到建立免疫組織化學法([15]Breton AL, Grisez L, Sweetman J，Ollevier F:Viral nervous necrosis (VNN) associated with mass mortalities in cage-reared sea bass，Dicentrarchus labrax(L.). Journal of Fish Diseases 1997， 20 :145-151.)^1^^([16]Comps M, Trindade M, Delsert C !investigation of fish encephalitis viruses (FEV) expression in marine fishes using DIG-Iabelled probes. Aquaculture 1996，143 :113-121.)，魚細胞系([17]Chi SCiLin SCiSu HMiHu WW: Temperature effect on nervous necrosis virus infection in grouper cell line and in grouper larvae. Virus Res 1999，63 (1-2) : 107-114.)微流體晶片和抗原捕獲 ELISA ([6]Shieh JR, Chi SC-Production of monoclonal antibodies against groupernervous necrosis virus (GNNV) and development of an antigen capture ELISA. Dis Aquat Organ 2005,63(1) :53-60.)。但是大部分這些方法都要求使用昂貴的使用設備和試劑。RT-PCR技術是一種快速、特異性好和靈敏的病毒檢測方法([18]Guo ZX,Weng SP,Li G， Chan SM,He JG !Development of an RT-PCR detection method for mud crab reovirus. J Virol Methods 2008,151 (2) :237-241.)。

發明內容
本發明的目的在於提供神經壞死病毒的RT-PCR檢測方法。本發明的第二目的在於提供一種神經壞死病毒的RT-PCR檢測試劑盒及其製備方法。所述神經壞死病毒的RT-PCR檢測方法包括以下步驟一、RT-PCR弓丨物設計根據已獲得的NNV外膜蛋白基因序列，使用軟體I^rimer Premier 5設計5條用於
建立檢測方法的引物，所述引物序列如下表所示
權利要求
1.神經壞死病毒的RT-PCR檢測方法，其特徵在於包括以下步驟 一、RT-PCR引物設計根據已獲得的NNV外膜蛋白基因序列，使用軟體I^rimer Premier 5設計5條用於建立檢測方法的引物，所述引物序列如下表所示
2.如權利要求1所述的神經壞死病毒的RT-PCR檢測方法，其特徵在於在步驟二中，所述在體外構建用於體外轉錄的重組質粒PSP-NNV的具體步驟如下DpSP-NNV質粒的構建使用NNV-IongR作為反向引物從病毒RNA樣品中RT-PCR獲得待檢測目的片段，其逆轉錄反應體系和反應程序如下NNV RNA2 μ NNV-IongR1 μ dNTP Mix,每種dNTP濃度為 IOmM1 μ 5xPrimescript緩衝液，又稱逆轉錄緩衝液2 μ RNase抑制劑0.25 μ Primescipt reverse transcriptase, 又稱逆轉錄酶 0.25 μ 無RNase水3 μ 混合均勻後42°C反應lh，70°C反應15min終止反應後迅速置於冰上； 然後將獲得的逆轉錄產物作為模板進行PCR擴增，反應體系和反應程序如下cDNA2 μ NNV-shortF1 μ NNV-shortR1 μ dNTP Mix,每種dNTP濃度為2.5 mM 2 μ Γα^ DNApolymerase,又稱聊酶0.25 μ 10xPCR緩衝液2.5 μ 水16.25 μ PCR 程序為95°C 3min ;94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 30s，35 個循環；72°C 5min ;將PCR產物用HindIII和XbalI內切酶做雙酶切，使用Ε. Ζ. N. A. Cycle Pure試劑盒回收酶切產物，然後將酶切產物連接到pSP64poly(A)載體上，轉化至感受態Ε. coli DH5 α 中，篩選陽性克隆並測序驗證；2)體外轉錄獲得作為陽性對照的小RNA片段(1)提取pSP-NNV質粒，並用EcoRI線性化後回收質粒，再用!Iomega體外轉錄試劑盒體外轉錄獲得小RNA片段，體外轉錄體系及條件如下5xTranscription Optimized緩衝液4 μ DTT, IOOmM2 μ Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor 20 40 urATP, rGTP, rUTP, rCTP各 1 μ 線性化DNA1SP6 RNA polymerase1 μ 加無RNase水至終體積為20 μ 離心後置於37°C lh;反應完後加入RQl RNase-Free DNase 2u，37°C孵育30min消化去除模板DNA，用酚/ 氯仿/異戊醇和氯仿/異戊醇抽提RNA，再用1. 2%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質量，並用分光光度計測RNA濃度；再根據RNA分子量確定單位體積RNA分子數，然後將RNA按分子數 1 χ IO1梯度稀釋，分別稀釋為1 X IO6到1 X IO2,由此獲得濃度梯度的作為陽性對照的小RNA 片段；所述酚/氯仿/異戊醇的體積比為25 24 1，所述氯仿/異戊醇的體積比為M 1。
3.一種神經壞死病毒的RT-PCR檢測試劑盒，其特徵在於設有盒體和檢測試劑，所述檢測試劑設有裂解液、吸附液、洗滌液、重蒸水、RT-PCR混合反應液、NNV-PCR反應液、陽性對照、陰性對照、RNA提取和RT反應管；所述裂解液、吸附液、洗滌液、重蒸水、RT-PCR混合反應液、NNV-PCR反應液、陽性對照、陰性對照、RNA提取和RT反應管設在盒體內。
4.如權利要求3所述的所述一種神經壞死病毒的RT-PCR檢測試劑盒的製備方法，其特徵在於包括以下步驟1)配製檢測試劑裂解液:5mol/L鹽酸胍，0. lmol/L EDTA，去離子水定容至1L，pH為8. 0 ； 吸附液將5g玻璃粉放在25 30mL水中懸浮，然後再加入等體積的濃硝酸反應，最後重新加水懸浮即可；洗滌液0. lmol/L 氯化鈉，lmmol/LEDTA, IOmmol/L iTris-HCl,去離子水定容至 1L，pH 為7. 5 ；再加入等體積的無水乙醇，搖勻；DEPC處理水往雙蒸水中加入DEPC至中濃度為0. 1 %，混勻2h後，高溫高壓滅菌2次； RT-PCR混合反應液每6μ 1溶液含有1μ 1 NNV-short2引物；1 μ 1 dNTP Mix，每種 dNTP 濃度為 IOmM ；2 μ 1 5 X Primescript 緩衝液；0. 25 μ 1 RNase 抑制劑；0. 25 μ 1 Primescipt reverse transcriptase,產於中國大連寶生物公司；0· 3 μ 1 甘油；1· 2 μ 1 DEPC處理水；NNV-PCR 反應液每 23 μ 1 溶液含有 1 μ 1 NNV-shortl 引物，1 μ 1 NNV_short2 引物， 1 μ 1 dNTPMix,每種 dNTP 濃度為 IOmM ；0. 25 μ 1 Taq DNA polymerase ；2· 5 μ 1 10XPCR 緩衝液；1.5μ 1甘油；15. 75 μ 1雙蒸水；陽性對照上述體外轉錄試驗所獲得的小片段RNA ； 陰性對照雙蒸水； RNA提取和RT反應管；2)將檢測試劑裂解液、吸附液、洗滌液、重蒸水、RT-PCR混合反應液、NNV-PCR反應液、 陽性對照、陰性對照、RNA提取和RT反應管置入盒體內。
全文摘要
神經壞死病毒的RT-PCR檢測方法，涉及病毒的檢測方法。提供神經壞死病毒的RT-PCR檢測方法、神經壞死病毒的RT-PCR檢測試劑盒及其製備方法。神經壞死病毒的RT-PCR檢測方法RT-PCR引物設計；含有檢測目的片段重組質粒pSP-NNV的構建和作為陽性對照的小RNA片段的製備；引物的特異性實驗和靈敏度檢測實驗；回收率實驗和方法有效性實驗。試劑盒設有盒體和檢測試劑，檢測試劑設有裂解液、吸附液、洗滌液、重蒸水、RT-PCR混合反應液、NNV-PCR反應液、陽性對照、陰性對照、RNA提取和RT反應管。試劑盒的製備方法配製檢測試劑；將檢測試劑置入盒體內。
文檔編號C12R1/93GK102312020SQ20111028802
公開日2012年1月11日 申請日期2011年9月26日 優先權日2011年9月26日
發明者敖敬群, 母尹楠, 陳新華 申請人:國家海洋局第三海洋研究所