檢測胚胎染色體拷貝數的試劑盒、裝置和方法

2023-11-07 11:06:22

專利名稱：檢測胚胎染色體拷貝數的試劑盒、裝置和方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測胚胎染色體拷貝數的試劑盒、裝置以及方法。
背景技術：
染色體拷貝數異常和人類的疾病有著密切的關係。平均每1000個新生兒中，有9 個會攜帶因染色體拷貝數異常而導致的疾病⑴。因此在胎兒尚未出生之前能夠檢測出染色 體拷貝數是很重要的。然而，目前所用的診斷方法，包括羊膜穿刺和羊絨毛膜取樣，都屬於 有創傷的方法，會給孕婦和胎兒帶來一定的風險。用血清蛋白標記物和超聲波來檢測胎兒 是否有染色體拷貝數異常的疾病雖無創傷，但不是直接檢測致病因素，因而準確性和靈敏 度都不太好(2)，也存在不能儘早地發現染色體拷貝數異常疾病的問題。這樣的現狀促使研 究人員去開發一種精確而且靈敏度高的無創診斷和檢測方法。自從母體血液中的胚胎DNA被發現之後(3)，無創傷地直接診斷和檢測胚胎染色體 異常性成了一個重大的研究課題。2007年，盧煜明教授和他的同事們證明可以用母體血漿 mRNA中胎盤特異基因4的突變位點比例來斷定胚胎是否有21號染色體3倍體⑷。突變位 點比例同時也被用來判斷18號染色體是否為3倍體⑸。它的局限性在於突變位點在人群 中並不普遍，所以這些方法只適用於一部分人群。在同一時期，數碼PCR(digital PCR，或 dPCR)被用來檢測胚胎的染色體3倍體(6)』 (7)。數碼PCR的優勢是不依賴任何突變位點，但 它的精確度不夠高，而且需要大量血樣，加大了採樣的困難。近年來迅猛發展的高通量測序技術解決了以上的問題。這些技術包括Illumina 公司的 Genome Analyzer , Life Technologies 公司的 S0LiD(9)，以及 Helicos 公司的 HeliSCOpea°)，能一次性地檢測出幾億乃至幾十億個序列。用這些技術來檢測母體血漿DNA 時，血漿中微量的胚胎DNA的染色體數目的變化能被檢測出來(11)』(12)』㈦)。但因為測序的成 本太高，目前這些技術尚未被普遍使用。同時，從母體血液中檢測胚胎染色體的局部拷貝數 的變化還屬於未解決的難題。用高通量測序來檢測母體血漿中胚胎染色體的拷貝數變化有 一些優勢，但目前價錢昂貴，不能普及。而且測序的偏差(CV)比較高，檢測的精確度和穩定 性也都有待改進。測序的偏差也決定了這種方法只適合少數幾個染色體，如21號染色體， 18號染色體，而且目前還不適合於染色體局部拷貝數變化的檢測。用高通量測序來檢測染色體數目的變化的高成本和難度主要因為母體血漿中胚 胎DNA的含量比較低，低時只佔5%，尤其在胚胎發育的早期。母體血漿中的大部分DNA還 是母體DNA。胚胎染色體數目或局部拷貝數的變化很容易被母體DNA的背景所覆蓋。因此 分離母體和胚胎DNA的方法也就成為多年來研究的課題，但成效不大。比較成功的方法應 屬Baylor醫學院發明的針對組蛋白的分離方法(14)。不過分離出來的DNA量太少，只適合 於突變位點的檢測，不宜用來檢測染色體拷貝數的變化。

發明內容
針對上面檢測胚胎染色體拷貝數的方法中的種種問題，發明人根據母體血漿中胚胎DNA和母體DNA的長度設計出一種能有效地低成本檢測出胚胎染色體全部或局部拷貝數 的試劑盒、裝置及方法。本發明是基於以下的事實如在文獻中報導的(15)，母體血漿中的胚胎DNA大部分 為IOObp到250bp的片段，且150bp到170bp的DNA尤其佔多數，雖然母體的DNA也有很小 部分分布在這個片段區域，但片段大於250bp的DNA基本上屬於母體的DNA。本發明的發明 人首次發現，雖然理由未知，各個染色體佔總DNA的比例在IOObp到250bp之間的任意一點 或任意一個區間處的DNA是均勻分布的，即各個染色體在IOObp到250bp之間的任何一點， 比如IlObp或167bp (此位點的DNA量最多)，與總DNA的比例代表了其他點的比例，因此， 也就代表了各個染色體佔IOObp到250bp之間的所有DNA的比例。基於以上的發現，本發明人發明了相對無創且經濟方便地檢測胚胎染色體拷貝數 的試劑盒、裝置和方法。本發明的一種檢測胚胎染色體拷貝數的試劑盒包括從母體取血液的器械；適合 將所述血液中的血細胞和血漿分離的器械；抽提所述血漿中的DNA的試劑和器械；通過物 理方法根據所述DNA的片段大小對其進行分離的試劑和器械；和取100bp-250bp之間的任 意一點或任意一個區間的所有DNA進行測序的試劑和器械。優選地，所述物理方法是瓊脂糖凝膠電泳的方法。優選地，所述檢測胚胎染色體拷貝數的試劑盒還包括將所述DNA製成供雙端測 序的文庫的試劑和器械。優選地，所述檢測胚胎染色體拷貝數的試劑盒還包括對所述從血漿中抽提的 DNA或所述供雙端測序的文庫進行PCR擴增的試劑和器械。優選地，其中所述100_250bp之間的任意一點或任意一個區間的DNA是 150bp-170bp 的 DNA。優選地，其中所述100_250bp之間的任意一點或任意一個區間的DNA是167bp的 DNA。優選地，其中所述雙端測序對所述DNA兩端各20_100bp的雙端短序列進行測試。本發明的另一種檢測胚胎染色體拷貝數的試劑盒包括從母體取血液的器械；適 合將所述血液中的血細胞和血漿分離的器械；抽提所述血漿中的DNA的試劑和器械；將所 述DNA製成可供雙端測序的文庫的試劑和器械；和對所述DNA進行雙端短序列測序的試劑 和器械。優選地，所述雙端短序列是所述DNA兩端各小於50bp的核苷酸。優選地，本發明的另一種檢測胚胎染色體拷貝數的試劑盒還包括對所述從血漿 中抽提的DNA進行PCR擴增的試劑和器械。本發明的一種檢測胚胎染色體拷貝數的裝置包括檢測模塊，用於對母體血漿樣 本中的DNA進行測序；比對模塊，用於將所述DNA的測序結果與染色體組序列圖譜進行比 對，以確定所述DNA中的每段DNA來自幾號染色體以及所述每段DNA的序列長度；計算模 塊，用於計算在同一樣本內所述DNA中100bp-250bp之間的任意一點或任意一個區間的所 有DNA中來自待測染色體與來自參考染色體的DNA片段數的比值，並計算各個樣本間所述 比值的變異，根據所述變異的數值確定待測染色體的拷貝數；以及輸出模塊，用於輸出所述 待測染色體的拷貝數。
優選地，對所述母體血漿樣本中DNA進行測序僅包括對所述DNA中100bp_250bp 之間的任意一點或任意一個區間的DNA進行測序，通過物理方法可以分離出固定長度區間 的 DNA。優選地，所述母體血漿樣本中DNA在檢測前被製作成可供雙端測序的文庫。優選地，所述雙端測序對所述DNA兩端各小於50bp的雙端短序列進行測試。優選地，對所述DNA的所述雙端短序列進行測試後，通過與染色體組序列圖譜進 行比對確定每段所述DNA的長度。優選地，所述母體血漿樣本中DNA在檢測前進行了 PCR的擴增。優選地，所述母體血漿樣本中DNA在被製作成可供雙端測序的文庫之前或之後進 行了 PCR的擴增。優選地，所述100_250bp之間的任意一點或任意一個區間的DNA是150bp_170bp 的 DNA。優選地，所述100_250bp之間的任意一點或任意一個區間是DNA是167bp的DNA。優選地，所述參考染色體是2號、7號、12號、14號染色體或它們的任意組合。優選地，所述待測染色體是13號、18號、21號、X、Y染色體或它們的任意組合。本發明的一種檢測胚胎染色體拷貝數的方法包括以下步驟取母體血液；將所述 血液中的血漿和血細胞分離；通過物理方法將所述血漿中的DNA根據所述DNA的片段大小 對其進行分離；對所述DNA中100bp-250bp之間的任意一點或任意一個區間的DNA進行 測序；將所述DNA中100bp-250bp之間的任意一點或任意一個區間的所有DNA的測序結 果與染色體組序列圖譜進行比對，以確定所述DNA中100bp-250bp之間的任意一點或任意 一個區間的所有DNA中的每段DNA來自幾號染色體；以及計算在同一樣本內所述DNA中 100bp-250bp之間的任意一點或任意一個區間的所有DNA中來自待測染色體與來自參考染 色體的DNA片段數的比值，並計算各個樣本間所述比值的變異，根據所述變異的數值確定 待測染色體的拷貝數。優選地，所述物理方法是是瓊脂糖凝膠電泳的方法。優選地，本發明的上述檢測胚胎染色體拷貝數的方法還包括在通過物理方 法分離所述DNA大小之前或之後將DNA製成可供雙端測序的文庫，其中對所述DNA中 100bp-250bp之間的任意一點或任意一個區間的DNA進行測序採用的是雙端測序的方法。優選地，所述100_250bp之間的任意一點或任意一個區間的DNA是150bp_170bp 的 DNA。優選地，所述100_250bp之間的任意一點或任意一個區間的DNA是167bp的DNA。優選地，所述雙端測序對所述DNA兩端各小於50bp的雙端短序列進行測試。優選地，本發明的上述檢測胚胎染色體拷貝數的方法還包括將所述DNA的所述 雙端短序列的測試結果與染色體組序列圖譜進行比對以確定每段所述DNA的長度的步驟。優選地，本發明的上述檢測胚胎染色體拷貝數的方法還包括在通過所述物理方 法分離所述DNA之前或所述測序之前對所述DNA進行PCR擴增的步驟。本發明的另一種檢測胚胎染色體拷貝數的方法，包括以下步驟取母體血液；將 所述血液中的血漿和血細胞分離；對所述血漿中的DNA製作成可供雙端測序的文庫；對所 述DNA雙端測序文庫的雙端短序列進行測序；將所述測序的結果與染色體組序列圖譜進行比對，確定每段所述DNA序列來自幾號染色體以及每段所述DNA序列的長度；以及取所述 DNA的序列長度在100bp-250bp之間的任意一點或任意一個區間的所有DNA的測序和比對 結果，計算在同一樣本內所述DNA中100bp-250bp之間的任意一點或任意一個區間的所有 DNA中來自待測染色體與來自參考染色體的DNA片段數的比值，並計算各個樣本間所述比 值的變異，根據所述變異的數值確定待測染色體的拷貝數。優選地，所述100_250bp之間的任意一點或任意一個區間的DNA是150bp_170bp 的 DNA。優選地，所述100-250bp之間的任意一點或任意一個區間的DNA是167bp的DNA。優選地，所述雙端測序對所述DNA兩端各小於50bp的雙端短序列進行測試。可替換地，上述的檢測胚胎染色體拷貝數的方法也可以通過測試所述血漿中的 DNA的單端長序列以代替雙端測序，此時可以包括也可以不包括對所述血漿中的DNA製作 成可供雙端測序的文庫的步驟，因為測試單端長序列的文庫可以與供雙端測序的文庫是同 一文庫。當用本發明的試劑盒、裝置及方法來計算胚胎DNA的染色體數或染色體局部拷貝 數的變化，發現計算出來的胚胎DNA的染色體數或染色體局部拷貝數不但精確，而且需要 的血樣很少，計算所需的序列數目可以大大減少，從而大幅度地降低測序成本。


圖1是將母體血漿的DNA製成可供雙端測序的文庫後，用的瓊脂糖凝膠電泳後 的圖像。左邊的通道是DNA IOObp標準樣的圖像，右邊的通道是可供雙端測序的文庫DNA 的圖像，最明顯的條帶位於^Obp左右，其中包含了 120bp的連接引物。圖2是樣品G367的DNA片段大小的分布圖。圖3是比對後樣品G367中確定來自X染色體的DNA片段根據片段大小所做的分 布圖。圖4是計算得出的和實際測得的G367X染色體的DNA片段根據片段大小所做的分 布圖，圖中帶星號的線表示G367樣品的總DNA序列數乘以X染色體的百分比後得到的圖 形，圓圈代表實際檢測到的X染色體的序列數。如圖中所示，計算得出的G367X染色體的 DNA片段的分布與實際測量得到的分布基本相同，兩條線基本完全吻合。
具體實施例方式需要說明的是，在不矛盾的情況下，本申請中的實施例及實施例中的特徵可以相 互組合。下面將參考附圖並結合實施例來詳細說明本發明。本發明的附圖及其實施例僅僅 用於解釋本發明，並不構成對本發明的任何限制。名詞解釋雙端短序列是指緊接著5』端連結引物的小於50bp的序列和緊接著3』端連結引 物的小於50bp的序列。優選地，雙端短序列是指緊接著5』端連結引物的不大於36bp的序 列和緊接著3』端連結引物的不大於36bp的序列。單端長序列是指緊接著5』端連結引物的大於99bp的序列或緊接著3』端連結引 物的大於99bp的序列。
雙端測序是指分別測試位於序列兩端的雙端短序列。DNA簇指由單一 DNA分子擴增而成的位於一定固體面積的多個DNA分子。在該申 請的實施例中，DNA簇指由單一 DNA分子擴增而成的位於1平方微米內的大約1000個DNA 分子。乳化PCR指的是將PCR(Polymerase Chain Reaction)的反應物，包括PCR模板 DNA、PCR引物、PCR聚合酶和鹼基置於一個油珠內進行PCR反應。通常情況下，乳化PCR的 模板只有一個DNA分子。實施例實施例1 一種檢測胚胎染色體拷貝數的方法步驟1 取母體血液，製備血漿在本實施例中，總共抽取了 5個母體血液樣品，血液樣品經高速離心後得到除去 了血細胞的血漿樣品，每個樣品的血漿量大約為1ml，樣品的代號為G367、G374、G379、 G435和G440。上述樣品均由中南大學湘雅醫學院的鄔玲仟教授採集得到。步驟2:提取血漿DNA可以使用Qiagen公司生產的DNA抽提試劑盒來提取血漿中的DNA(產品號為 57704)。 步驟3 將血漿DNA製成可供雙端測序的文庫將提取的DNA末端補平並進行5，端磷酸化將DNA30 μ 1、純水45 μ 1、具有IOmM ATP 的 T4DNA 連接酶緩衝液 10 μ IUOmM dNTP Mix 4 μ 1、T4DNA 聚合酶 5 μ 1、Klenow 酶1μ1、Τ4ΡΝΚ 5μ 1混合後，在20°C溫浴30分鐘(試劑為Illumina樣本準備試劑盒 PE-102-1001提供)。溫浴後採用QIAGEN QIAquick PCR純化試劑盒(part把8104)純化 DNA。末端懸A 將上步的產物溶解在32 μ 1緩衝液中，加入Klenow緩衝液5 μ l、lmM dATP 10 μ 1、Klenow Εχο_3 μ 1，在37°C保持30分鐘(試劑為Illumina樣本準備試劑盒 PE-102-1001 提供)，產物由 QIAGEN MinElute PCR 純化試劑盒(part把8004)連接DNA溶解在10 μ 1緩衝液中，加入DNA連接酶緩衝液h 25 μ 1、PE Adapter Oligo MixlOy 1，DNA連接酶5 μ 1，在20°C保持15分鐘(試劑為Illumina樣本準備試劑 盒PE-102-1001提供)。溫浴後採用QIAGEN QIAquick PCR純化試劑盒(part把8104)純化 DNA。圖1是每個樣品的DNA被製作成可供雙端測序的文庫，將該文庫中的DNA用 的瓊脂糖凝膠進行電泳，圖1是凝膠電泳的圖像，最明顯的條帶在^Obp左右，由於包含了 120bp的連接引物，因此母體血漿DNA主要片段集中在160bp左右。優選地，還可以對可供雙端測序的文庫進行PCR擴增1μ 1 DNA、22yl純水、 1 μ IPE PCR 引物 PE 2. OU μ 1 PE PCR 引物 PE 1. 0、2x Phusion DNA 聚合酶(Finnzymes 0y)(試劑為Illumina樣本準備試劑盒PE-102-1001提供)。通過PCR儀器擴增DNA，程序 為98 °C 30秒；98°C 40秒，65°C 30秒，72°C 30秒，共進行12個循環；72°C 5分鐘。步驟4 對所述DNA雙端測序文庫的雙端短序列進行測序用I Ilumina的cBot儀器將DNA雙端測序文庫中單一的DNA分子製成DNA簇，這一 步也可由乳化PCR將單一 DNA分子變成珠子上的多分子。將上面生成的DNA簇或乳化PCR得到的DNA珠在Illumina的Genome Analyzer或HKeq2000測序儀進行雙端測序。此過 程均由儀器本身自動完成。可替換地，也可將上面生成的DNA簇或乳化PCR得到的DNA珠在11 Iumina的 GenomeAnalyzer或Hikq2000測序儀進行單端長序列的測序。在Illumina的Genome Analyzer和HiSeq2000測序儀上的測序步驟和反應條件與以上描述的一樣。步驟5 確定血漿中的DNA片段來自幾號染色體，並確定待測染色體的拷貝數是否 正常在進行了 DNA文庫的雙端測序後(可替換地，也可以是測定單端長序列)，當已 知了一個DNA片段兩端各36bp的鹼基序列後，可以將這兩端的序列與人類基因組標準序 歹丨J 37. 1 (http //www, ncbi. nlm. nih. gov/pro iects/genome/assembly/grc/human/data/ ？ build = 37)，該資料庫也稱hgl9比對，確定了這兩端的序列分別在染色體上的位置，該兩 端序列之間的距離就是該DNA片段的長度，同時該兩端序列所在的染色體位置即確定了該 DNA片段來自幾號染色體。圖2是根據上述的方法確定得到的樣品G367的DNA片段大小的分布圖，從圖中可 以看出，母體血漿的短DNA主要集中在IOObp到220bp之間。圖3是將比對後樣品G367中確定來自X染色體的DNA片段根據片段大小所做的 分布圖。所得到的圖形與圖2幾乎一致。步驟6 取DNA的序列長度在100bp_250bp之間的任意一點或任意一個區間的所 有DNA的比對結果，計算並確定待測染色體的拷貝數在本實施例中我們取了長度在150bp到區間的DNA片段的比對結果，將7 號和14號染色體作為參考染色體，X、Y和21號染色體作為待測染色體。表1中列出了在 150bp到區間，來自7、14、X、Y和21號染色體的DNA片段佔該區間的總DNA片段的 百分數樣品 chr7 chrl4 chr21 chrXchrYG367_46xx 0.010527261 5. 440913867 3. 168290974 1. 3591621044. 011180933G374_46xx 0. 012214554 5. 451782745 3. 164119016 1. 3536778943. 962889744G379_46xx 0.009586766 5. 445655908 3. 170272522 1. 3522686254. 037545306G452_47xy 0.060654459 T21 5. 371282594 3. 174026866 1. 5010533123. 490446542G440_45x 0.0101686 5. 467367816 3. 189015757 1. 3566645683.679299238根據比對的結果，得知G367的X染色體的序列數佔總序列數的4. 0112%，可以驗 證本發明的發現的是將圖2的縱坐標乘以4. 0112%得到了與圖3非常吻合的圖形，具體 參見圖4，圖中帶星號的線表示G367樣品的總DNA序列數乘以X染色體的百分比後得到的 圖形，圓圈代表實際檢測到的X染色體的序列數。在表2中列出了 5個樣品中來自X和Y染色體的DNA片段數佔150bp到區間的總DNA片段數的百分數與來自7號和14號染色體的DNA片段數佔150bp到區 間的總DNA片段數的百分數的比值，也列出了這些比值的平均值和標準誤差。根據平均值 和標準誤差，得到Z數值Z=(樣品比值-平均值)/標準誤差。在該實施例中，根據Z數 值可以判斷胚胎中X和21號染色體的個數以及Y染色體是否存在，在此聲明，本發明不用 於非醫學需要的胎兒性別鑑定或者性別選擇性的人工終止妊娠的性別鑑定。
權利要求
1.一種檢測胚胎染色體拷貝數的試劑盒，包括 從母體取血液的器械；適合將所述血液中的血細胞和血漿分離的器械； 抽提所述血漿中的DNA的試劑和器械；通過物理方法根據所述DNA的片段大小對其進行分離的試劑和器械；和 取100bp-250bp之間的任意一點或任意一個區間的所有DNA進行測序的試劑和器械。
2.根據權利要求1所述的試劑盒，其中所述物理方法是瓊脂糖凝膠電泳的方法。
3.根據權利要求2所述的試劑盒，還包括將所述DNA製成供雙端測序的文庫的試劑 和器械。
4.根據權利要求1或3所述的試劑盒，還包括對所述從血漿中抽提的DNA或所述供 雙端測序的文庫進行PCR擴增的試劑和器械。
5.根據權利要求1所述的試劑盒，其中所述100-250bp之間的任意一點或任意一個區 間的 DNA 是 150bp-170bp 的 DNA。
6.根據權利要求4所述的試劑盒，其中所述100-250bp之間的任意一點或任意一個區 間的 DNA 是 150bp-170bp 的 DNA。
7.根據權利要求5或6所述的試劑盒，其中所述100-250bp之間的任意一點或任意一 個區間的DNA是167bp的DNA。
8.根據權利要求3所述的試劑盒，其中所述雙端測序對所述DNA兩端各小於50bp的雙 端短序列進行測試。
9.一種檢測胚胎染色體拷貝數的試劑盒，包括 從母體取血液的器械；適合將所述血液中的血細胞和血漿分離的器械； 抽提所述血漿中的DNA的試劑和器械； 將所述DNA製成可供雙端測序的文庫的試劑和器械；和 對所述DNA進行雙端短序列測序的試劑和器械。
10.根據權利要求9所述的試劑盒，其中所述雙端短序列是所述DNA兩端各小於50bp 的核苷酸。
11.根據權利要求9或10所述的試劑盒，還包括對所述從血漿中抽提的DNA進行PCR 擴增的試劑和器械。
12.—種檢測胚胎染色體拷貝數的裝置，包括檢測模塊，用於對母體血漿樣本中的DNA進行測序；比對模塊，用於將所述DNA的測序結果與染色體組序列圖譜進行比對，以確定所述DNA 中的每段DNA來自幾號染色體以及所述每段DNA的序列長度；計算模塊，用於計算在同一樣本內所述DNA中100bp-250bp之間的任意一點或任意一 個區間的所有DNA中來自待測染色體與來自參考染色體的DNA片段數的比值，並計算各個 樣本間所述比值的變異，根據所述變異的數值確定待測染色體的拷貝數；以及 輸出模塊，用於輸出所述待測染色體的拷貝數。
13.根據權利要求12所述的裝置，其中對所述母體血漿樣本中DNA進行測序僅包括對 所述DNA中100bp-250bp之間的任意一點或任意一個區間的DNA進行測序，通過物理方法可以分離出100bp-250bp之間的任意一點或任意一個區間的DNA。
14.根據權利要求12或13所述的裝置，其中所述母體血漿樣本中DNA在檢測前被製作 成可供雙端測序的文庫。
15.根據權利要求14所述的裝置，其中所述雙端測序對所述DNA兩端各小於50bp的雙 端短序列進行測試。
16.根據權利要求15所述的裝置，其中對所述DNA的所述雙端短序列進行測試後，通過 將所測得的DNA的雙端短序列與染色體組序列圖譜進行比對能夠確定每段所述DNA的長度 以及每段所述DNA來自幾號染色體。
17.根據權利要求12所述的裝置，其中所述母體血漿樣本中DNA在檢測前進行了PCR 的擴增。
18.根據權利要求14所述的裝置，其中所述母體血漿樣本中DNA在被製作成可供雙端 測序的文庫之前或之後進行了 PCR的擴增。
19.根據權利要求13或15所述的裝置，其中所述100-250bp之間的任意一點或任意一 個區間的DNA是150bp-170bp的DNA。
20.根據權利要求19所述的裝置，其中所述100-250bp之間的任意一點或任意一個區 間是DNA是167bp的DNA。
21.根據權利要求12所述的裝置，其中所述參考染色體是2號、7號、12號、14號染色 體或它們的任意組合。
22.根據權利要求12或21所述的裝置，其中所述待測染色體是13號、18號、21號、X、 Y染色體或它們的任意組合。
23.一種檢測胚胎染色體拷貝數的方法，包括以下步驟取母體血液；將所述血液中的血漿和血細胞分離；通過物理方法將所述血漿中的DNA根據所述DNA的片段大小對其進行分離；對所述DNA中100bp-250bp之間的任意一點或任意一個區間的DNA進行測序；將所述DNA中100bp-250bp之間的任意一點或任意一個區間的所有DNA的測序結果與 染色體組序列圖譜進行比對，以確定所述DNA中100bp-250bp之間的任意一點或任意一個 區間的所有DNA中的每段DNA來自幾號染色體以及所述每段DNA的序列長度；以及計算在同一樣本內所述DNA中100bp-250bp之間的任意一點或任意一個區間的所有 DNA中來自待測染色體與來自參考染色體的DNA片段數的比值，並計算各個樣本間所述比 值的變異，根據所述變異的數值確定待測染色體的拷貝數。
24.根據權利要求23所述的方法，其中所述物理方法是是瓊脂糖凝膠電泳的方法。
25.根據權利要求M所述的方法，還包括在通過物理方法分離所述DNA大小之前或之 後將DNA製成可供雙端測序的文庫，其中對所述DNA中100bp-250bp之間的任意一點或任 意一個區間的DNA進行測序採用的是雙端測序的方法。
26.根據權利要求25所述的方法，其中所述100-250bp之間的任意一點或任意一個區 間的 DNA 是 150bp-170bp 的 DNA。
27.根據權利要求沈所述的方法，其中所述100-250bp之間的任意一點或任意一個區 間的DNA是167bp的DNA。
28.根據權利要求25-27中任一項所述的方法，其中所述雙端測序對所述DNA兩端各小 於50bp的雙端短序列進行測試。
29.根據權利要求觀所述的方法，還包括將所述DNA的所述雙端短序列的測試結果與 染色體組序列圖譜進行比對以確定每段所述DNA的長度的步驟。
30.根據權利要求M46或28中任一項所述的方法，還包括在通過所述物理方法分離 所述DNA之前或所述測序之前對所述DNA進行PCR擴增的步驟。
31.一種檢測胚胎染色體拷貝數的方法，包括以下步驟取母體血液；將所述血液中的血漿和血細胞分離；對所述血漿中的DNA製作成可供雙端測序的文庫；對所述DNA雙端測序文庫的雙端短序列進行測序；將所述測序的結果與染色體組序列圖譜進行比對，確定每段所述DNA序列來自幾號染 色體以及每段所述DNA序列的長度；以及取所述DNA的序列長度在100bp-250bp之間的任意一點或任意一個區間的所有DNA的 測序和比對結果，計算在同一樣本內所述DNA中100bp-250bp之間的任意一點或任意一個 區間的所有DNA中來自待測染色體與來自參考染色體的DNA片段數的比值，並計算各個樣 本間所述比值的變異，根據所述變異的數值確定待測染色體的拷貝數。
32.根據權利要求31所述的方法，其中所述100-250bp之間的任意一點或任意一個區 間的 DNA 是 150bp-170bp 的 DNA。
33.根據權利要求32所述的方法，其中所述100-250bp之間的任意一點或任意一個區 間的DNA是167bp的DNA。
34.根據權利要求32或33所述的方法，其中所述雙端測序對所述DNA兩端各小於50bp 的雙端短序列進行測試。
35.根據權利要求31所述的方法，其中通過測試所述血漿中的DNA的單端長序列以代 替雙端測序。
全文摘要
本發明涉及檢測胚胎染色體拷貝數的試劑盒、裝置和方法，使用本發明的試劑盒、裝置和方法能夠相對無創、經濟地檢測胚胎染色體的拷貝數。本發明主要基於發明人發現在母體血漿中的胚胎DNA大部分為100bp到250bp的片段，且各個染色體佔總DNA的比例與各個染色體佔母體血漿中100bp-250bp之間的任意一點或任意一個區間的DNA的比例是一致的。因此本發明的方法僅需要測定100bp到250bp之間的任意一點或任意一個區間的DNA中的每段DNA來自幾號染色體，並計算在同一樣本內100bp-250bp之間的任意一點或任意一個區間的所有DNA中來自待測染色體與來自參考染色體的DNA片段數的比值，並計算各個樣本間所述比值的變異，根據所述變異的數值確定待測染色體的拷貝數。
文檔編號C12Q1/68GK102108406SQ20101059523
公開日2011年6月29日 申請日期2010年12月20日 優先權日2010年12月20日
發明者周代星, 張建光, 王珺, 田鳳, 高揚 申請人:北京貝瑞和康生物技術有限公司