用作預防豬囊蟲病的基因工程疫苗及其製備方法
2023-10-22 18:32:02 1
專利名稱：用作預防豬囊蟲病的基因工程疫苗及其製備方法
技術領域：
本發明涉及B型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)蛋白或基因作為載體，攜帶豬帶絛蟲保護性抗原表位，構建亞單位蛋白疫苗以及核酸疫苗。
背景技術：
囊蟲病是由豬帶絛蟲的幼蟲-豬囊尾蚴感染豬或人而引起的人畜共患寄生蟲病，在我國有27個省、市自治區發現本病。豬是最主要的中間宿主，人不僅是中間宿主，而且是唯一的終末宿主。該病在我國流行廣泛，對畜牧業和人類健康帶來很大危害。因此加強豬囊蟲病的防治在促進養豬業發展、改善公共衛生方面均具有重要意義。目前關於囊蟲病的防治還未有成熟的手段，過去的化學藥物治療以及蟲體抗原免疫都已經暴露了很大的局限性。免疫預防是一種有效途徑。隨著分子生物學技術的發展，寄生蟲免疫學研究也取得較大進展，通過尋找相關基因，在體外克隆並表達該基因，用表達產物作為抗原進行免疫和診斷是解決其抗原來源的有效手段。
有關豬囊蟲病的基因工程疫苗研製，國內外均有報導。Johnson等克隆出分子量為45kD的羊帶絛蟲六鉤蚴抗原，用其製成的疫苗，對羊的保護率達94％。這一突破性成果提示，用基因工程的方法研製豬囊蟲疫苗是可行的。Kalina等用酸性核糖體磷蛋白(簡稱arpP2)特異性引物從豬囊尾蚴的cDNA表達文庫中分離出arpP2基因，並在大腸桿菌中表達了分子量為15kD的蛋白，他們預測arpP2抗原在自身免疫病尤其是腦囊蟲病診斷和免疫預防中具有應用前景。巫雪豔等製備了以豬囊尾蚴全蟲抗原和轉移因子為主體的複合疫苗，經田間免疫試驗表明，此複合疫苗能使豬產生較強的免疫保護力，保護率達90％，且保護時間達半年以上。核酸疫苗作為繼減毒疫苗、基因工程疫苗後的第三代疫苗，以其全面誘導免疫應答，具有安全無毒，長效持久，表達穩定，生產簡便，成本低廉，貯運方便等優點，已在細菌、病毒、寄生蟲等感染性疾病及腫瘤的預防和治療領域中顯示巨大潛力。但豬囊蟲DNA疫苗方面的研究尚處於起步階段，報導甚少。Harrison等成功研製出羊帶絛蟲DNA疫苗，對羊的保護率率達90％以上，證明DNA疫苗能成功控制細胞外寄生性蠕蟲病。孫樹漢等研製出了豬囊尾蚴保護性抗原cCI的DNA疫苗，後又用豬IL-4真核表達質粒與cCl DNA疫苗聯合應用，初步顯示IL-4具有良好的免疫佐劑性能。高榮等構建了豬囊尾蚴表達型cDNA文庫，篩選出豬囊尾蚴的抗原基因TS21，構建了TS21的真核表達型載體VTS21，成功進行了體外真核表達研究，為進一步研製豬囊蟲DNA疫苗提供了基礎。
目前國內有關豬囊蟲疫苗的研究有兩個重點一是豬囊尾蚴細胞疫苗的研究，天津農科院首次採用了細胞工程技術，確定了細胞苗的製備方法，初步建立了生產工藝，生產的細胞苗具有良好的免疫保護力。存在問題是細胞株的穩定性較差。另一個是核酸疫苗。目前國內外尚無商品化的豬囊蟲疫苗。
發明內容
本發明的目的就是為了研製一種效果持久、安全性好且成本低的用作預防豬囊蟲病的疫苗及其製備方法。
本發明的技術解決方案一種用於預防豬囊蟲病的基因工程疫苗，它以B肝病毒的核心蛋白或B肝病毒的核心蛋白基因為載體，在該載體的第1位胺基酸至第183位胺基酸之間的多個位置上用基因工程方法插入豬囊尾蚴保護性抗原，構成預防豬囊蟲病的亞單位蛋白疫苗或核酸疫苗。
一種用於預防豬囊蟲病的基因工程疫苗的製備方法，它以B肝病毒核心蛋白為載體，利用分子生物學技術和方法，在B肝病毒核心蛋白(HBc)基因的第1位胺基酸至第183位胺基酸之間的多個位置插入豬囊尾蚴保護性抗原基因，克隆至原核表達質粒上，轉化宿主菌，構建成工程菌，通過對含此質粒的工程菌誘導表達，獲得大量目的蛋白並對其進行純化，即可得到預防豬囊蟲病的亞單位蛋白疫苗；或者，以B肝病毒核心蛋白基因為載體，利用分子生物學技術和方法，在B肝病毒核心蛋白(HBc)基因的第1位胺基酸至第183位胺基酸之間的多個位置上插入豬囊尾蚴保護性抗原基因，克隆至真核表達質粒，轉化宿主菌並大量培養，柱純化質粒DNA，即獲得核酸疫苗(又稱DNA疫苗)。
本發明構建一種新型的預防豬囊蟲病的疫苗，它是以HBc抗原為呈現載體的亞單位蛋白疫苗或核酸疫苗，小鼠和仔豬動物試驗已經證明這種疫苗具有很好的免疫預防效果。
單獨用豬囊蟲抗原表位直接免疫動物，發現其保護性抗體產生的水平都很低，體液免疫反應不強。B肝病毒(HBV)的核心抗原(HBcAg)所具有的特殊結構特點，使其成為理想的構建疫苗的載體。HBc分子全長為183個胺基酸，可裝配成大小兩種顆粒，以大顆粒為主，分別為240和180個HBcAg單體，表面分別有120和90個刺突。用單克隆抗體對HBV核殼行免疫電鏡觀察，發現第78-83位胺基酸殘基位於刺突的尖部。HBc大致可分為裝配區(1-149)和核酸結合區(150-183)。有研究表明，在刺突部位插入外源片段，不影響顆粒形成，將149位後的胺基酸切除或切除後加上外源片段，也能保持形成顆粒的能力，其產物能在細胞內正確摺疊和裝配，且在真核和原核細胞內均能高效表達。假如能在HBc表面規則地排列所需要的多肽表位，就能作為免疫分子的載體，這樣每個顆粒攜有高密度的所需肽段，對產生免疫反應、結合受體等功能起重要作用。從免疫學角度看，HBc顆粒能顯著刺激T、B細胞產生免疫反應。若免疫分子插入刺突區，能以其多拷貝、天然構象方式呈現於HBc顆粒表面，有利於依賴空間構象的表位的識別與提呈，另插入外源序列能使HBc自身抗原性降低，可避免HBc過高的抗原性對外源抗原的不利影響，從而使刺突區插入的外源序列免疫原性得到顯著增強。除刺突外，C端α螺旋尾部也能在核殼表面形成小突出部位，是另一個B細胞識別位點。此外，HBc蛋白無傳染性，作為應用載體，十分安全可靠。
HBc顆粒用作免疫分子的載體有許多優點HBc抗原可由180或240個單體組成病毒樣顆粒，目的抗原表位被展示在HBc顆粒的表面可呈現天然結構；被免疫動物體內可檢測到Th1和Th2型細胞因子；重組抗原產生的特異行抗體滴度可大於1.3×106，而抗HBcAg抗體滴度要低於完整抗原誘導的抗HBcAg抗體滴度，誘導的免疫反應傾向於Th2細胞反應；缺乏載體的多肽表位不能引起記憶性免疫性反應，而採用HBc顆粒作為載體的疫苗保護時間長；對人細胞沒有直接毒性。在HBc基因的適當位置上插入豬囊尾蚴保護性抗原基因，構建出原核表達載體，通過對含此質粒的工程菌誘導表達，獲得大量目的蛋白並對其進行純化，即可得到蛋白疫苗。以此免疫動物，可刺激機體產生高滴度的保護性抗體。在此基礎上構建真核表達載體，即核酸疫苗，直接用於免疫動物，可刺激機體產生全面、持久、有效的保護性抗體。用兩種疫苗免疫的動物(小鼠、仔豬)對於絛蟲卵的攻擊均具有較高的保護率。故本發明對於預防豬囊蟲病具有重要價值。
本發明首次將HBc載體用於豬囊蟲病疫苗的研製方面。本發明將豬囊尾蚴保護性抗原表位或GST(穀胱甘肽還原酶)表位插入HBc的合適部位，經HBc的自我裝配後，表位將呈現在核心蛋白(HBc)顆粒表面，從而加強抗原呈遞能力，高水平地誘導T、B細胞的免疫反應，最終提高免疫豬對絛蟲卵的抵抗力。
圖1是一個雜合的攜帶了外源表位的HBcAg分子示意圖。
圖2是各豬囊尾蚴保護性抗原表位插入HBc的不同位置的構建結構示意圖。
如圖所示，圖1中，A代表HBcAg的1-78位胺基酸，B代表插入的豬囊尾蚴保護性抗原表位，C代表HBcAg的79-149位胺基酸，D代表另一個豬囊尾蚴保護性抗原表位或GST表位。其中，B和D可以是一個單獨的表位，也可以是兩個融合的表位。
具體實施例方式
本發明的用於預防豬囊蟲病的基因工程疫苗是以B肝病毒的核心蛋白或B肝病毒的核心蛋白基因為載體，在該載體的第1位胺基酸至第183位胺基酸之間的多個位置上用基因工程方法插入豬囊尾蚴保護性抗原，構成預防豬囊蟲病的亞單位蛋白疫苗或核酸疫苗。其中豬囊尾蚴保護性抗原優選插入在B肝病毒的核心蛋白或核心蛋白基因第78-79位胺基酸之間或接在其第149位胺基酸處。所述的豬囊尾蚴保護性抗原最好採用豬囊尾蚴保護性抗原表位，如KETc1(n1)APMSTPSATSVRG；KETc12(n2)GNLLLSCLG；GK-1(n3)GYYYPSDPNTFYAPPYSA；GST(epi1)LVAAGVDYEDERISFQDWPK；GST(epi2)KPQEEKEKITKEILNGK；DD1IYCNRRTGKCQRMSAM；DD2FETLPNNVWYPVHAPNLG；DD3RSTLEDPSTMDLPIIPKQN；DD4TARQVSRLESGQA；DD5LRSLMFCDFVEPKG；DD6ANARGEAVCVLGAL；DD7KLLSAHNSTQHTSRKHK；DD8ERITISHRKQLA；DD9AKTNYPNERFKPIIRMNG；DD10HRKQLADNNFTQETAMTMI；DD11AHNSTQHTSRKHKVSLG；DD12AMPAQTAAKTNYPNERFKPI。
其中優選的豬囊尾蚴保護性抗原表位為KETc1(n1)APMSTPSATSVRG；KETc12(n2)GNLLLSCLG；GK-1(n3)GYYYPSDPNTFYAPPYSA；
GST(epi1)LVAAGVDYEDERISFQDWPK；GST(epi2)KPQEEKEKITKEILNGK。
本發明基因工程疫苗的製備方法是以B肝病毒核心蛋白為載體，利用分子生物學技術和方法，在B肝病毒核心蛋白(HBc)基因的第1位胺基酸至第183位胺基酸之間的多個位置上插入豬囊尾蚴保護性抗原基因，克隆至原核表達質粒上(該原核表達質粒可以是pET28a，pET18，pET32，pQE32)，轉化宿主菌，構建成工程菌，通過對含此質粒的工程菌誘導表達，獲得大量目的蛋白並對其進行純化，即可得到預防豬囊蟲病的亞單位蛋白疫苗；或者，以B肝病毒核心蛋白基因為載體，利用分子生物學技術和方法，在B肝病毒核心蛋白(HBc)基因的第1位胺基酸至第183位胺基酸之間的多個位置上插入豬囊尾蚴保護性抗原基因，克隆至真核表達質粒(該真核表達質粒可以是pcDNA3.1，pcDNA3.0，pVAX，Bacmid)，轉化宿主菌並大量培養，柱純化質粒DNA，即獲得核酸疫苗(又稱DNA疫苗)。
本發明亞單位蛋白疫苗(PCCE)的具體製備方法是，利用分子生物學技術和方法，將表位KETc1(n1)APMSTPSATSVRG和KETc12(n2)GNLLLSCLG插入HBc149的78和79位胺基酸序列之間，表位GK-1(n3)GYYYPSDPNTFYAPPYSA融合到149位胺基酸處，構建成原核表達質粒pET28a-Δc-3n，用SDS-PAGE以及測序證明其序列正確後，得到生產預防豬囊蟲病疫苗的基因工程菌，再大規模培養基因工程菌並誘導表達，經純化後獲得亞單位蛋白疫苗(PCCE)。
本發明核酸疫苗的具體製備方法是，利用分子生物學技術和方法，將表位KETc1(n1)APMSTPSATSVRG和KETc12(n2)GNLLLSCLG插入HBc149的78和79位胺基酸序列之間，表位GK-1(n3)GYYYPSDPNTFYAPPYSA融合到149位胺基酸處，得到亞單位蛋白疫苗(PCCE)的基因序列，再將人IL-2的信號肽序列加到該基因序列的5』端，並克隆至真核表達質粒pVAX3.0上，構建成核酸疫苗pVAX-S-Δc-3n，測序正確後，大量培養核酸疫苗工程菌，鹼裂解法提取質粒DNA，過柱純化，紫外分光光度計定量，即獲得核酸疫苗。
下面根據實施例進一步描述本發明的技術方案。
本發明將豬囊尾蚴保護性抗原表位或GST表位插入HBc基因的合適部位，構建出原核表達質粒和真核表達質粒，從而獲得預防豬囊蟲病的蛋白疫苗和核酸疫苗。
根據文獻報導的三個豬囊蟲抗原表位，由上海生工合成引物。含有HBc抗原基因序列的質粒pHBc由本實驗室保存，根據HBc序列合成一對引物。利用引物擴增HBc的1-149位胺基酸的DNA片段，並在78-79位之間引入酶切位點，在78-79間可插入豬囊蟲保護性抗原表位，在149位之後也可接豬囊蟲表位或GST表位。添加GST表位，能夠調節Th1和Th2細胞間的平衡。據資料顯示，GST表位能促進宿主細胞分泌高水平的IgG1、IgG2a和IgE，因此可認為該表位既刺激了Th1細胞又刺激了Th2細胞的功能，以致增強了保護性抗原誘導的保護性免疫應答效率。將含有保護性表位的HBc149基因片段克隆至原核表達載體上，測序正確後誘導表達並純化出目標蛋白，即製成亞單位蛋白疫苗，可用於免疫動物。若將測序正確後的含有保護性抗原表位的基因片段克隆至可用作核酸疫苗的真核表達載體上，經序列鑑定正確後，可利用工程菌大量擴增質粒，用鹼裂解法提取質粒並純化，即製成核酸疫苗，用於免疫動物。
實施例1如圖1所示，利用分子生物學技術和方法，將表位KETc1(n1)APMSTPSATSVRG和KETc12(n2)GNLLLSCLG插入HBc149的78和79位胺基酸序列之間，表位GK-1(n3)GYYYPSDPNTFYAPPYSA融合到第149位胺基酸處，構建成原核表達質粒pET28a-Δc-3n，用SDS-PAGE以及測序證明其序列正確後，再大規模培養工程菌並誘導表達，經純化後獲得亞單位蛋白疫苗，將此重組蛋白命名為PCCE，並用紫外分光光度計對其進行定量。
以肌肉注射法對小鼠進行免疫接種，輔以福氏不完全佐劑，3周後加強免疫一次，4周後再加強免疫一次，共注射三次。分別在免疫後第1、3、5、7、9周採集試驗組和對照組小鼠的血清，ELISA法檢測小鼠血清抗PCCE IgG，IgG2a和IgG1，取各組平均值作圖。另免疫接種4周後，分別取試驗組和對照組各10隻小鼠，每隻小鼠尾靜脈注射新鮮豬絛蟲卵10000枚，2月後放血處死，解剖觀察肌肉組織病理改變，計算保護率。
ELISA結果顯示，血清抗PCCE IgG陽性率為100％，隨著免疫次數增加，抗體滴度不斷升高，在第七周達最高值(約1∶106)，到第九周有所回落。抗體亞型IgG1和IgG2a也有同樣規律，兩者變化趨勢一致，但總體IgG1稍高於IgG2a。小鼠保護性試驗結果表明，PCCE對免疫組小鼠的相對保護率為89％。
實施例2在上例基礎上，利用分子生物學技術和方法，將人IL-2的信號肽基因序列加到PCCE蛋白基因序列的5』端，並克隆至真核表達質粒pVAX3.0上，構建成核酸疫苗pVAX-S-Δc-3n。測序正確後大量培養工程菌，提取質粒，過柱純化，紫外分光光度計定量，即獲得核酸疫苗。
用核酸疫苗免疫一月齡仔豬，三周後加強免疫一次。加強免疫兩周後，每頭豬灌胃20,000枚新鮮的感染性絛蟲蟲卵，三個月後放血處死，解剖觀察肌肉組織病理改變，計算保護率。
實驗結果表明，核酸疫苗pVAX-S-Δc-3n對免疫仔豬的相對保護率為83％。
實施例3利用分子生物學技術和方法，將表位KETc1(n1)APMSTPSATSVRG和KETc12(n2)GNLLLSCLG插入HBc的78和79位胺基酸序列之間，表位GST(epi1)LVAAGVDYEDERISFQDWPK融合到149位胺基酸處，構建成原核表達質粒pET28a-Δc-n1n2G1，用SDS-PAGE以及測序證明其序列正確後，將含有保護性抗原表位的HBc149片段亞克隆至真核表達質粒pcDNA3.0上，構建成核酸疫苗pcDNA-Δc-n1n2G1，測序正確後大量培養工程菌，提取質粒，過柱純化，紫外分光光度計定量，即獲得核酸疫苗。
用核酸疫苗免疫一月齡仔豬，三周後加強免疫一次。加強免疫兩周後，每頭豬灌胃20,000枚新鮮的感染性絛蟲蟲卵，三個月後放血處死，解剖觀察肌肉組織病理改變，計算保護率。
實驗結果表明，核酸疫苗pcDNA-Δc-n1n2G1對免疫仔豬的相對保護率為86％。
其它亞單位蛋白疫苗實施例利用分子生物學技術和方法，將多個不同的表位插入HBc的不同位置，克隆至原核表達質粒上，構建成多個不同的亞單位蛋白疫苗工程菌，具體構建結構如圖2所示，其它條件同實施例2。再大規模培養工程菌並誘導表達，將經純化後獲得亞單位蛋白疫苗用於免疫仔豬。結果表明對於絛蟲卵的攻擊均具有40-80％的保護率。
其它核酸疫苗實施例利用分子生物學技術和方法，將不同的表位插入HBc的不同位置，再克隆至真核表達質粒上，構建成不同的真核表達質粒，具體構建結構亦如圖2所示，其它條件同實施例3。測序證明其序列正確後，構建成核酸疫苗。大量培養工程菌，柱純化質粒DNA，用於免疫仔豬。結果表明對於絛蟲卵的攻擊均具有40-80％的保護率。
權利要求
1.一種用於預防豬囊蟲病的基因工程疫苗，其特徵在於它以B肝病毒的核心蛋白或B肝病毒的核心蛋白基因為載體，在該載體的第1位胺基酸至第183位胺基酸之間的多個位置上用基因工程方法插入豬囊尾蚴保護性抗原，構建成預防豬囊蟲病的亞單位蛋白疫苗或核酸疫苗。
2.按權利要求1所述的用於預防豬囊蟲病的基因工程疫苗，其特徵在於所述的豬囊尾蚴保護性抗原插入在B肝病毒的核心蛋白或核心蛋白基因第75-92位胺基酸之間或接在其第143-183位胺基酸之間。
3.按權利要求1所述的用於預防豬囊蟲病的基因工程疫苗，其特徵在於所述的豬囊尾蚴保護性抗原採用豬囊尾蚴保護性抗原表位。
4.按權利要求3所述的用於預防豬囊蟲病的疫苗，其特徵在於所述豬囊尾蚴保護性抗原表位是指KETc1(n1)APMSTPSATSVRG；KETc12(n2)GNLLLSCLG；GK-1(n3)GYYYPSDPNTFYAPPYSA；GST(epi1)LVAAGVDYEDERISFQDWPK；GST(epi2)KPQEEKEKITKEILNGK；DD1IYCNRRTGKCQRMSAM；DD2FETLPNNVWYPVHAPNLG；DD3RSTLEDPSTMDLPIIPKQN；DD4TARQVSRLESGQA；DD5LRSLMFCDFVEPKG；DD6ANARGEAVCVLGAL；DD7KLLSAHNSTQHTSRKHK；DD8ERITISHRKQLA；DD9AKTNYPNERFKPIIRMNG；DD10HRKQLADNNFTQETAMTMI；DD11AHNSTQHTSRKHKVSLG；DD12AMPAQTAAKTNYPNERFKPI。
5.按權利要求4所述的用於預防豬囊蟲病的疫苗，其特徵在於所述豬囊尾蚴保護性抗原表位是指KETc1(n1)APMSTPSATSVRG；KETc12(n2)GNLLLSCLG；GK-1(n3)GYYYPSDPNTFYAPPYSA；GST(epi1)LVAAGVDYEDERISFQDWPK；GST(epi2)KPQEEKEKITKEILNGK。
6.權利要求1所述的基因工程疫苗的製備方法，其特徵在於它以B肝病毒核心蛋白為載體，利用分子生物學技術和方法，在B肝病毒核心蛋白基因的第1位胺基酸至第183位胺基酸之間的多個位置上插入多個豬囊尾蚴保護性抗原基因，克隆至原核表達質粒上，轉化宿主菌，構建成工程菌，通過對含此質粒的工程菌誘導表達，獲得大量目的蛋白並對其進行純化，即可得到預防豬囊蟲病的亞單位蛋白疫苗；或者，以B肝病毒核心蛋白基因為載體，利用分子生物學技術和方法，在B肝病毒核心蛋白基因的第1位胺基酸至第183位胺基酸之間的多個位置上插入豬囊尾蚴保護性抗原基因，克隆至真核表達質粒，轉化宿主菌並大量培養，柱純化質粒DNA，即獲得核酸疫苗。
7.按權利要求6所述的基因工程疫苗的製備方法，其特徵在於所述的原核表達質粒是指pET28a，pET18，pET32，pQE32；所述的真核表達質粒是指pcDNA3.1，pcDNA3.0，pVAX，Bacmid。
8.按權利要求6所述的基因工程疫苗的製備方法，其特徵在於利用分子生物學技術和方法，將表位KETc1(n1)APMSTPSATSVRG和KETc12(n2)GNLLLSCLG插入HBc的78和79位胺基酸序列之間，表位GK-1(n3)GYYYPSDPNTFYAPPYSA融合到149位胺基酸處，構建成原核表達質粒pET28a-Δc-3n，用SDS-PAGE以及測序證明其序列正確後，得到生產預防豬囊蟲病疫苗的工程菌，再大規模培養工程菌並誘導表達，經純化後獲得亞單位蛋白疫苗。
9.按權利要求6所述的基因工程疫苗的製備方法，其特徵在於利用分子生物學技術和方法，將表位KETc1(n1)APMSTPSATSVRG和KETc12(n2)GNLLLSCLG插入HBc的78和79位胺基酸序列之間，表位GK-1(n3)GYYYPSDPNTFYAPPYSA融合到149位胺基酸處，得到亞單位蛋白疫苗的基因片段，再將人IL-2的信號肽序列加到該基因片段的5』端，並克隆至真核表達質粒pVAX3.0上，構建成核酸疫苗pVAX-S-Δc-3n，測序正確後大量培養核酸疫苗基因工程菌，鹼裂解法提取質粒DNA，過柱純化，紫外分光光度計定量，即獲得核酸疫苗。
全文摘要
本發明涉及一種用作預防豬囊蟲病的基因工程疫苗及其製備方法，該疫苗是以B肝病毒的核心蛋白或B肝病毒的核心蛋白基因為載體，在該載體的第1位胺基酸至第183位胺基酸之間的多個位置上用基因工程方法插入豬囊尾蚴保護性抗原，構成預防豬囊蟲病的亞單位蛋白疫苗或核酸疫苗。其製備方法是以B肝病毒核心蛋白為載體，在B肝病毒核心蛋白(HBc)基因的第1位胺基酸至第183位胺基酸之間的多個位置上插入豬囊尾蚴保護性抗原基因，克隆至原核表達質粒或真核表達質粒上，轉化宿主菌，經誘導目的基因表達、獲得目的蛋白或柱純化真核表達質粒DNA，即可得到預防豬囊蟲病的亞單位蛋白疫苗或核酸疫苗。
文檔編號A61P33/00GK1634596SQ20041006567
公開日2005年7月6日 申請日期2004年11月11日 優先權日2004年11月11日
發明者鄧小昭, 刁振宇, 吳 琳, 周宗安, 陶開華, 劉玉, 王元倫, 高鍵, 王永山, 鄭紀山 申請人:中國人民解放軍南京軍區聯勤部軍事醫學研究所