富馬酸二甲酯在製備預防和治療移植物抗宿主病及移植物抗白血病藥物中的應用的製作方法

2023-10-06 03:15:55 1

本發明涉及富馬酸二甲酯在製備預防和治療移植物抗宿主病及移植物抗白血病藥物中的應用。

背景技術：

異基因造血幹細胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT)是當今治療惡性血液病的有效手段，急性移植物抗宿主病(acute graft-versus-host-disease,aGVHD)是其重要併發症，aGVHD是移植物中以T細胞為主的淋巴細胞識別宿主抗原致敏、增殖、分化，直接或間接攻擊宿主組織器官產生的病理損傷。目前臨床常規防治GVHD的經典方案為環孢菌素(CSA)+短程甲氨喋呤(MTX)，然而此類藥物是針對整個免疫系統的，其不僅導致感染增加，而且部分患者仍會發生嚴重GVHD，嚴重影響患者的預後。因此尋找有效防治GVHD而不影響移植物抗白血病的新方法顯得尤為重要。

富馬酸二甲酯(Dimethylfumarate，DMF)，分子式CH3OOCCH＝CHCOOCH3，分子量144.13。它最初被確認為一種非常有效的缺氧細胞的放射增敏劑。後來結合三個其它富馬酸酯基(FAE)的DMF在德國被授權口服治療牛皮癬(Fumaderm)。偶見報導治療其它疾病，如類脂質漸進性壞死，環狀肉芽腫，結節病也被發現用DMF治療。近日，III期臨床試驗發現，DMF(BG-12)成功地降低了多發性硬化症的殘疾進程的復發率和復發時間。DMF被認為具有無重大免疫抑制的免疫調節特性。歐盟EMA在2013年3月21日批准DMF以名稱「Tecfidera」推薦作為多發性硬化症MS的口服治療劑；2013年3月27日美國FDA批准Tecfidera膠囊治療成人復髮型多發性硬化症。

目前，對於造血幹細胞移植後移植物抗宿主病的預防和治療，現有的藥物存在一定的副作用，缺乏有效藥物的治療，也沒有DMF對aGVHD進行預防及治療的報導。

技術實現要素：

本發明所要解決的技術問題是提供一種富馬酸二甲酯在製備預防和治療移植物抗宿主病及移植物抗白血病藥物中的應用。

為解決以上技術問題，本發明採用如下技術方案：

本發明提供一種富馬酸二甲酯或含有富馬酸二甲酯的藥物組合物在製備藥物中的用途，該藥物用於預防和治療異基因造血幹細胞移植後的急性移植物抗宿主病。

具體地，該藥物用於抑制異基因造血幹細胞移植後活化的T細胞的增殖。

具體地，該藥物用於抑制樹突狀細胞的增殖、活化和抗原提成能力。

具體地，該藥物用於抑制Th1細胞反應。

具體地，該藥物用於減輕急性移植物抗宿主病的同時保留移植物抗白血病效應。

由於上述技術方案的實施，本發明與現有技術相比具有如下優點：

本發明通過動物實驗研究發現富馬酸二甲酯具有明顯的抑制急性移植物抗宿主病的作用，可用來製備預防和治療移植物抗宿主病及移植物抗白血病的藥物。

附圖說明

附圖1為小鼠的生存曲線、臨床評分變化曲線圖，其中，DMF組與control組相比小鼠生存時間明顯延長(P＝0.005)；

附圖2為control組和DMF組小鼠肺部、肝臟和腸道、皮膚組織H&E染色圖，control組小鼠肝、肺、小腸間質、皮膚可見淋巴細胞浸潤，而DMF組小鼠肝、肺、小腸間質、皮膚淋巴細胞浸潤明顯減少；

附圖3為DMF對同種T細胞反應的抑制作用圖，其中，*表示P＜0.05；

附圖4為DMF對脾細胞增殖能力的抑制作用圖，其中，*表示P＜0.05；

附圖5為DMF組小鼠細胞因子TNF-α的分泌抑制圖；

附圖6為DMF組小鼠細胞因子IFN-γ的分泌抑制圖；

附圖7為DMF組中對CD80的抑制作用圖；

附圖8為DMF組中對CD86的抑制作用圖；

附圖9為DMF組中對CD40的抑制作用圖；

附圖10為DMF組中對細胞因子IL-6的表達抑制圖；

附圖11為DMF組中對細胞因子TNF-α的表達抑制圖；

附圖12為CD4+Treg和CD8+Treg的細胞百分比圖；

附圖13為CD3+T、CD4+T和CD8+T的細胞百分比圖；

附圖14為CD4+T和CD8+T的細胞百分比圖；

附圖15為小鼠生存曲線圖；

附圖16為小鼠體內白血病細胞的活體成像圖。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發明做進一步詳細的說明，但本發明並不限於以下實施例。本發明中若無特別說明，原料均可市購獲得，方法為本領域的常規方法。

一：材料和方法

(一)、動物

7～8周齡SPF級BALB/c小鼠(H-2d)，體重20～24g；6～8周齡SPF級C57BL/6小鼠(H-2b)，體重20～24g，購自中國上海實驗動物中心。所有的程序是根據動物護理委員會和美國國立衛生研究院的關懷和使用動物的指南進行。所有實驗小鼠均飼養於SPF(specific pathogen-free facility)級別的隔離籠中，飼料及墊料均經60Co輻照滅菌處理，飲用水經高溫高壓滅菌及酸化處理並加入慶大黴素，於蘇州大學實驗動物中心無菌層流房中飼養。

(二)、細胞株

小鼠B淋巴瘤細胞株A20(帶luciferace)培養於含10％胎牛血清的RPMI1640完全培養基中，37℃、5％CO2飽和溼度孵箱中培養，取對數生長期細胞用於實驗。

(三)、主要試劑及耗材

DMF：sigma公司，美國

甲基纖維素：sigma公司，美國

3H-TdR：中國科學院上海應用物理研究所

CD16/CD32FcR阻斷抗體：BD Pharmingen，美國

PE-CD3ε單克隆抗體：BD Pharmingen，美國

FITC-CD4單克隆抗體：BD Pharmingen，美國

PE-cy5.5-CD8α單克隆抗體：BD Pharmingen，美國

APC-CD69單克隆抗體：BD Pharmingen，美國

FITC-H-2Kb單克隆抗體：BD Pharmingen，美國

PE-H-2Kd單克隆抗體：BD Pharmingen，美國

PE-IL-17單克隆抗體：BD Pharmingen，美國

APC-IFN-γ克隆抗體：BD Pharmingen，美國

PE-TNF-α克隆抗體：BD Pharmingen，美國

Foxp3染色試劑盒：ebioscience，美國

RPMI-1640培養基：Hyclone，美國

DMEM培養基：Gibco，美國

胎牛血清：Hyclone，美國

青黴素、鏈酶素：石家莊拜斯德醫藥化工有限公司

蘇木精-伊紅染色：碧雲天生物科技有限公司

試劑盒：Promega，美國

96孔U形底培養板：Becton Dickinson，美國

96孔平底培養板：Becton Dickinson，美國

(四)、實驗方法

1、小鼠脾細胞、造血幹細胞懸液的製備

1.1、小鼠脾細胞懸液的製備

頸椎脫位處死小鼠，於超淨臺內無菌操作取出小鼠脾臟，載玻片輕柔研磨直至大部分脾臟細胞均已研出，尼龍網過濾所得細胞懸液，1200rpm 4℃離心5min，棄上清，加入2ml的1×紅細胞裂解液，混勻，室溫放置5min，加入5ml RPMI-1640培養基，1200rpm 4℃離心5min，棄上清，用1ml的1×PBS重懸細胞，計數。置於4℃待用。

1.2、小鼠造血幹細胞懸液的製備

頸椎脫位處死小鼠，於超淨臺內無菌操作取出小鼠脊椎、股骨、脛骨，置於研缽輕柔擠壓研磨，重複此操作，直至大部分細胞均已研出。尼龍網過濾所得細胞懸液，1200rpm、4℃離心5min，棄上清，加入3ml的1×紅細胞裂解液，混勻，室溫放置5min，加入5ml RPMI-1640培養基，1200rpm 4℃離心5min，棄上清，用1ml的1×PBS重懸細胞，計數，置於4℃待用。

2、急性移植物抗宿主病模型的建立

實驗開始前一周，給BALB/C小鼠餵慶大黴素水溶液預防腸道感染，將小鼠分為實驗組(10隻)和對照組(10隻)，SPF級小鼠進行全身照射8.5Gy。照射4小時後尾靜脈注射供鼠(C56BL/6鼠)骨髓(1×107)及脾細胞(5×106)，誘導急性移植物抗宿主病模型。實驗組予DMF(30mg/kg，200μl每隻，-3d至+3d)灌胃，對照組予等量安慰劑(0.8％甲基纖維素)(200μl每隻，3d至+3d)灌胃。

3、aGVHD臨床表現觀察

移植後每天觀察受鼠一次，每2天測體重1次，觀察體重減輕、姿勢改變、活動度、體毛改變和皮膚完整性等臨床aGVHD指標。表1為異基因造血幹細胞移植後小鼠aGVHD臨床積分評分標準表。

表1

4、aGVHD病理組織學檢查

移植後10d處死部分小鼠，取肝臟、迴腸、肺、皮膚，用10％中性甲醛固定48小時。用濃度遞增酒精置換組織內水分，石蠟包埋並切成5μm厚度的切片，用二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，蘇木素－伊紅染色，樹膠封片。光學顯微鏡下觀察。aGVHD病理學主要研究肝臟、迴腸、肺、皮膚四個靶器官受損程度。肝臟GVHD病理學觀察匯管區淋巴細胞浸潤、膽管壞死、肝細胞灶狀壞死。小腸GVHD病理學觀察單個核細胞浸潤、杯狀細胞退化凋亡缺失、隱窩表面膿性分泌物、黏膜破損潰瘍。肺部GVHD病理學觀察肺間質炎症細胞浸潤。皮膚GVHD病理學觀察表皮界面壞死、炎症細胞浸潤、脂肪萎縮、毛囊減少。

5、系譜特異性嵌合度檢查

BALB/c受鼠H-2I類抗原分子為H-2d型，C57BL/6供鼠H-2I類抗原分子為H-2b型。造血幹細胞移植後10d取受體鼠的脾臟，製備脾細胞懸液，FACS緩衝液(PBS+0.5％BSA+0.1％疊氮鈉)重懸細胞並計數。細胞懸液先加CD16/CD32FcR阻斷抗體於4℃封閉20min，然後加特異性螢光標記抗體FITC-H-2Kb單克隆抗體，PE-H-2Kd單克隆抗體於4℃孵育20分鐘，離心沉澱細胞，FACS緩衝液洗滌一遍後重懸上BD流式細胞儀檢測，CellQuest軟體分析數據。

6、移植後小鼠脾淋巴細胞的獲取

頸椎脫臼法處死小鼠，於超淨臺內無菌操作取出小鼠脾臟，載玻片輕柔研磨直至大部分脾臟細胞均已研出，尼龍網過濾所得細胞懸液，1200rpm 4℃離心5min，棄上清，加入2ml 1×紅細胞裂解液，混勻，室溫放置5min，加入5ml RPMI-1640培養基，1200rpm 4℃離心5min，棄上清，1ml RPMI-1640培養基重懸細胞。吸取10μl用於計數。所獲得的無菌脾細胞可用於混合淋巴細胞反應和流式細胞術檢測。

7、細胞表面染色及胞內染色

分別取方法6中獲得的脾淋巴細胞按照細胞表面標記(1-5)×105/孔，胞內染色及Treg細胞標記(1-5)×106/孔進行鋪板，細胞表面染色的具體步驟：PBS 100μl重懸細胞後置於96孔板中，先予CD16/CD32FcR阻斷抗體於4℃封閉FcR 20min，離心沉澱細胞，PBS 200μl重懸後加入細胞表面標記抗體，根據不同螢光進行組合(CD3CD4CD8CD69/孔)(CD3CD4CD8孔)，4℃避光孵育30min，1200rpm離心5min，棄上清，PBS 200μl重懸洗滌1遍，1200rpm離心5min，棄上清，PBS 200μl重懸後上BD FACS Calibur流式細胞儀檢測，需同時做四種螢光的單染管及陰性管用於調補償，CellQuest軟體分析數據。

胞內染色的具體步驟：取(1-5)×105/孔的脾淋巴細胞，加入含10％FBS的RPMI-1640培養基1ml置於24孔板中混勻，加入PMA(500ng/ml)+Ionomycin(500ng/ml)+BFA(Brefeldin A，是蛋白轉運抑制劑，抑制蛋白質從內質網轉運到高爾基體，從而抑制其向胞外分泌)，37℃、5％CO2培養箱刺激4小時，收集細胞並以FACS Buffer充分洗滌。PBS 100μl重懸後置於96孔板中，先予CD16/CD32FcR阻斷抗體於4℃封閉FcR20min，離心沉澱細胞，PBS200μl重懸後加入細胞表面標記CD4和CD8抗體，4℃避光孵育30min，1200rpm離心5min，棄上清，PBS 200μl重懸洗滌1遍，1200rpm離心5min，棄上清，然後以4％多聚甲醛100μl固定細胞40min，1200rpm離心5min，棄上清，加入1％saponin(皂素)破膜20min，1200rpm離心5min，棄上清，PBS 200μl重懸洗滌1遍，1200rpm離心5min，棄上清，分別加入PE-IL-17單克隆抗體，APC-IFN-γ克隆抗體，PE-TNF-α克隆抗體各1μl，避光孵育30min，1200rpm離心5min，棄上清，PBS 200μl重懸洗滌1遍，1200rpm離心5min，棄上清，PBS 200μl重懸上BD流式細胞儀檢測，需同時做四種螢光的單染管及陰性管用於調補償，CellQuest軟體分析數據。

8、混合淋巴細胞反應

製備移植後10d受體BALB/c小鼠的脾細胞作為反應細胞，移植後10d小鼠脾細胞轉為供體型(H-2b)，以照射後的(30Gy)BALB/c(H-2d)來源的脾細胞作為刺激細胞。細胞計數，調整效應細胞和刺激細胞的終濃度為5×106/ml 0.1ml/孔加入U形底96孔培養板，共制板3塊，每塊板設3個復孔。37℃、5％CO2培養箱培養3天，其中1塊板加入3H-TdR 1微居/孔，繼續培養。

9、乳酸脫氫酶釋放法測定反應細胞殺傷活性

試劑盒檢測細胞毒性作用的化學反應原理為：NAD++乳酸→丙酮酸+NADH，NADH+INT→NAD++formazan(紅色)。紅色化合物formaza對490nm波長光波吸收最明顯。以方法6中MLR體系的反應細胞作為效應細胞，以小鼠腫瘤細胞A20(H-2b)作為靶細胞，96孔U形底培養板培養。RPMI-1640完全培養基調整A20細胞濃度為2×105/ml。實驗孔中加入效應細胞和靶細胞各100μl，效應細胞對照孔加入效應細胞和完全培養基各100μl，靶細胞對照孔加入靶細胞和完全培養基各100μl。效:靶比設為12.5:1、25:1、50:1、100:1，加樣後平板離心機250×g離心4min，在37℃、5％CO2飽和溼度孵箱內孵育4h。孵育後平板離心機250×g離心4min，轉移50μl至新的96孔平底板，每孔加入50μl重懸的底物，蓋上板蓋室溫下避光孵育30min，每孔加入50μl終止液，酶聯免疫檢測儀讀取490nm吸光度值。按以下公式計算效應細胞細胞毒性：效應細胞毒性％＝(實驗孔OD-效應細胞自發釋放OD-靶細胞自發釋放OD)÷(靶細胞最發釋放OD-靶細胞自發釋放OD)×100。

11、GVL模型的建立

為進一步觀察DMF在抑制aGVHD過程中對移植物抗白血病作用的影響，實驗設計分二組，每組10隻小鼠：第一組：SPF級BALB/c小鼠DMF組，予DMF(30mg/kg，-3d至+3d)灌胃；CO608.5Gy照射預處理，照射4小時後輸注C57BL/6小鼠的骨髓(1×107)細胞+脾細胞(5×106)+小鼠BALB/c背景的帶luciferace的A20腫瘤細胞(5×106)。第二組：SPF級BALB/c小鼠control組，對照組予安慰劑(0.8％甲基纖維素)灌胃後，CO60 8.5Gy照射預處理，照射4小時後輸注C57BL/6小鼠的骨髓(1×107)細胞+脾細胞(5×106)+小鼠BALB/c背景的帶luciferace的A20腫瘤細胞(5×106)。建立小鼠移植物抗白血病模型。移植後每周在小動物活體成像儀上實時觀測小鼠體內的腫瘤負荷。觀察時腹腔注射底物100μg，8秒後予乙醚麻醉小鼠，在小動物活體成像儀上觀察注射腫瘤細胞小鼠體內的腫瘤負荷。每2天小鼠稱重，aGVHD評分，對各實驗組小鼠的aGVHD發病率、發病時間及症狀嚴重程度以及小鼠體內腫瘤負荷進行比較。

12、統計學分析

採用Student-Newman-Keulsa,b檢驗分析數據，GraphPad Prism 5軟體(GraphPad Software Inc.)作統計分析並繪圖。採用Kaplan-Meier法繪製小鼠白血病生存曲線並採用log-rank檢驗生存期。分析所得P值小於0.05定義為有統計學意義。

二、實驗結果

1.DMF具有抑制異基因移植後急性移植物抗宿主病(aGVHD)的作用

TBI預處理後所有小鼠均出現放射反應、進食飲水量減少，移植後一周左右開始出現體重減輕。安慰劑(0.8％甲基纖維素)control組小鼠6天後出現中到重度的aGVHD表現如倦怠、納差、弓背、脫毛、腹瀉等現象，並出現GVHD相關消耗性體重減輕及死亡。移植後7d出現死亡，移植後53d全部死亡，而DMF組小鼠aGVHD表現症狀輕，移植後8d開始出現死亡，有6隻小鼠生存60d以上。小鼠的生存曲線、臨床評分變化曲線見圖1。選移植後10d為研究時間點，取control組和DMF組小鼠肺部、肝臟和腸道、皮膚組織H&E染色，control組小鼠腸道的隱窩腺體擴張及上皮細胞壞死、淋巴細胞浸潤，肺間質炎症細胞浸潤，肝臟匯管區淋巴細胞浸潤，皮膚表皮界面部分壞死、局部炎症細胞浸潤、脂肪萎縮伴局部毛囊減少。而DMF組小鼠腸道隱窩腺體擴張及上皮細胞壞死、淋巴細胞浸潤明顯減少，肺間質炎症細胞少見，肝臟淋巴細胞減少，皮膚結構相對完整、炎症細胞少見(圖2)。

2.DMF直接抑制移植後活化的T細胞增殖

2.1DMF抑制CD3/CD28活化的T細胞的增殖

取小鼠脾臟細胞，應用CD3/CD28抗體刺激T細胞增殖，用3H-UdR摻入處於DNA合成期的細胞，用液體閃爍計算儀測定每分鐘脈衝數(CPM)以測知3H-TdR或3H-UdR含量，用公式計算細胞抑制率。通過與control組比較，分析DMF組對小鼠同種T細胞反應的抑制作用。數據分析見圖3，相同體外實驗重複3遍。

結果顯示：DMF處理後脾臟T細胞增殖受到明顯抑制，且其抑制作用與DMF給藥濃度成正相關(P＜0.05)。

2.2DMF抑制同種異基因反應性T細胞的增殖

C57BL/6小鼠脾細胞作為效應細胞(5×105/孔)，經CO60 30Gy照射後的BALB/c脾細胞作為刺激細胞，混合淋巴細胞反應3天。每組加入3H-TdR 1微居/孔，繼續培養16-18h，收集細胞，通過β液閃計數儀檢測反應細胞的增殖情況。DMF組T細胞增殖受到抑制，其抑制程度與給藥濃度呈正相關(p<0.05)(圖4)。

2.3取上述混合淋巴細胞反應的培養上清，應用ELISA法檢測小鼠混合淋巴細胞反應上清中細胞因子TNF-α、IFN-γ含量，結果顯示：DMF組小鼠細胞因子TNF-α、IFN-γ的分泌均受到抑制(圖5，6)。相同實驗重複3次。

4.DMF能抑制樹突狀細胞的增殖、活化和抗原提成能力

DMF組中，經LPS刺激活化的樹突狀細胞成熟受到抑制，見圖7、8、9。應用ELISA法檢測小鼠細胞因子IL-6、TNF-α含量，結果顯示：DMF組細胞因子IL-6、TNF-α的表達均受到抑制，見圖10、11。

5.DMF能增加Treg細胞的數量，抑制Th1細胞反應

選移植後10d為研究時間點，取兩組小鼠脾臟細胞，應用流式細胞儀對移植後小鼠脾臟淋巴細胞進行Treg、CD3+、CD4+、CD8+T細胞檢測。從細胞百分比分析DMF對小鼠Treg細胞、Th1細胞的作用。數據分析見圖12、13、14。分析比較DMF與Control兩組數據，結果顯示：DMF能增加小鼠脾臟Treg細胞數量，同時抑制Th1細胞的反應。差異有統計學意義(*表示P＜0.05，**表示P＜0.01)。相同實驗重複3遍。

6.DMF能夠在減輕aGVHD的同時保留GVL效應

第一組：SPF級BALB/c小鼠DMF組，予DMF(30mg/kg，-3d至+3d)灌胃；CO60 8.5Gy照射預處理，照射4小時後輸注C57BL/6小鼠的骨髓(1×107)細胞+脾細胞(5×106)+小鼠BALB/c背景的帶luciferace的A20腫瘤細胞(5×106)。第二組：SPF級BALB/c小鼠control組，對照組予安慰劑(0.8％甲基纖維素)灌胃後，CO60 8.5Gy照射預處理，照射4小時後輸注C57BL/6小鼠的骨髓(1×107)細胞+脾細胞(5×106)+小鼠BALB/c背景的帶luciferace的A20腫瘤細胞(5×106)。建立小鼠移植物抗白血病模型。結果顯示，DMF在減輕aGVHD的同時，不影響GVL效應。圖15，小鼠生存曲線。圖16，活體成像顯示小鼠體內的白血病細胞。

結論

綜上所述，本發明對DMF在GVHD模型中對GVHD和GVL的作用進行評估。我們發現，DMF具有抑制異基因造血幹細胞移植後急性移植物抗宿主病(aGVHD)的作用；能直接抑制移植後活化的T細胞反應；抑制樹突狀細胞的增殖、活化和抗原提成能力；抑制Th1細胞反應；可能是通過增加Treg細胞的數量來實現的，DMF能夠在減輕aGVHD的同時不影響GVL效應。

以上對本發明做了詳盡的描述，其目的在於讓熟悉此領域技術的人士能夠了解本發明的內容並加以實施，並不能以此限制本發明的保護範圍，且本發明不限於上述的實施例，凡根據本發明的精神實質所作的等效變化或修飾，都應涵蓋在本發明的保護範圍之內。