一種鴨疫裡默氏桿菌lamp檢測試劑盒及其檢測方法

2023-10-05 23:38:49

專利名稱：一種鴨疫裡默氏桿菌lamp檢測試劑盒及其檢測方法
技術領域：
本發明屬於生物檢測技術領域，具體涉及一種鴨疫裡默氏桿菌LAMP檢測試劑盒及其檢測方法。
背景技術：
鴨疫裡默氏菌(Riemerella anatipestifer, RA)病是一種主要侵害鴨、火雞和其他鳥類的禽類接觸性傳染病，其血清型複雜，迄今為止，已公認的RA有21個血清型(1 21 型)，各血清型之間缺乏交叉保護的能力。該病主要病理變化是纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎、腦膜炎、乾酪樣輸卵管炎等，發病率高，病死率高，耐過鴨多成僵鴨，生長遲緩，造成極大的經濟損失，是目前危害禽類養殖業的主要傳染病之一。鴨疫裡默氏桿菌病多繼發其他疾病或與其他傳染性疾病並發，其臨床症狀和病理解剖往往缺乏特徵性，增加了疾病的診斷和防治難度，必須通過實驗室診斷進行確診。目前實驗室的診斷方法主要包括細菌學方法(如細菌的分離鑑定)、血清學方法(如酶聯免疫吸附試驗)和分子生物學(如聚合酶聯式反應)等方法，但上述方法所需檢測時間長、特異性和靈敏性低且必須配備專用設備，操作複雜，常有非特異性出現。近年來，由NotomiT等開發的一種簡單、迅速、特異的核酸擴增方法環介導等溫擴增技術(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)，被廣泛的應用於多種病毒性疾病和細菌性疾病的診斷中(Notomi，Τ.，Okayama, H.，Masubuchi, H.，et al. Nucleic Acids Res. 2000 (28), e63 ；K.Nagamine, Τ. Hase, Τ. Notomi. Molecular andCellular Probes. 2002(16) :223-229)。該技術使用4條不同引物識別6個不同區域的靶基因，應用鏈置換擴增反應在恆溫條件下完成擴增；具有很高的擴增效率，在15到60min內可將DNA 擴大IO9-IOki倍；不需要特殊試劑和精密設備。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種快速、特異性和靈敏性高的鴨疫裡默氏桿菌檢測試劑盒和檢測方法。為此，本發明公開了一種鴨疫裡默氏桿菌LAMP檢測試劑盒，其包含3對引物F3 和B3 ；FIP和BIP ；LF和LB，其中所述F3的核酸序列如SEQ ID NO. 1所示，所述B3的核酸序列如SEQ ID N0. 2所示，所述FIP的核酸序列如SEQ ID N0. 3所示，所述BIP的核酸序列如SEQ ID N0. 4所示，所述LF的核酸序列如SEQ IDN0. 5所示，所述LB的核酸序列如SEQ ID N0. 6 所示。在一些實施例中，所述鴨疫裡默氏桿菌LAMP檢測試劑盒還含有螢光染料、10X反應緩衝液、DNA聚合酶、dNTP(2. 5mM each)、甜菜鹼(Betaine solution, 5M) 所述螢光染料為能與雙鏈DNA結合產生螢光的染料，可為溴化乙錠、SYBRGreen I螢光染料或Hoechst 33258，最優選為STOR Green I螢光染料。另一方面，本發明還公開了一種鴨疫裡默氏桿菌的檢測方法，包括下列步驟
a)取禽類的體液或組織液並以此為模板；b)利用3對引物F3和B3 ；FIP和BIP ；LF和LB進行LAMP反應，其中所述F3的核酸序列如SEQ ID NO. 1所示，所述B3的核酸序列如SEQ ID NO. 2所示，所述FIP的核酸序列如SEQ ID NO. 3所示，所述BIP的核酸序列如SEQ ID NO. 4所示，所述LF的核酸序列如SEQ ID NO. 5所示，所述LB的核酸序列如SEQ ID N0. 6所示，反應條件為94°C 5分鐘， O0C 20 秒，65°C 20-60 分鐘，80°C滅活； c)檢測LAMP反應產物。在一些實施例中，所述禽類為鴨、火雞、雞或鳥類中任何之一。在一實施例中，步驟b中所述反應條件為94°C 5分鐘，0°C 20秒，65°C 20分鐘，80°C 滅活；在一些實施例中，步驟c中所述檢測LAMP反應產物的方法為瓊脂糖凝膠電泳法、 螢光顯色法或分光光度計法。所述螢光顯色法為STOR Green I螢光顯色法。與現有技術相比，本發明具有如下的優點1) 6條引物對序列的8個特異區域進行識別，擴增反應只有在6條引物完全識別靶序列的情況下才能進行，在很大程度上減少了擴增反應的背景，保證了 LAMP擴增的高度特異性。2)對硬體設備基本無要求，在普通的生物學實驗室就可完成檢測工作，減少了汙染的機會並方便了實驗過程中的質控工作。3)檢測時間可以縮短到20分鐘，最低可以檢測出5個細菌，提高了靈敏度。4)可視化鑑定，向反應產物中加入螢光染料，如果有擴增，螢光染料就會和DNA結合，通過肉眼即可觀察反應液呈現明亮的橙黃色，如反應液沒有橙黃色，則說明呈陰性反應。本發明所述檢測試劑盒及其檢測方法具有快速、敏感、特異、成本低和操作簡單的特點，能較好的彌補當前鴨疫裡默氏桿菌檢測方法上的不足，可以滿足當前該病的檢測需求，易於大範圍推廣應用，可減少該病在鴨等動物中的流行，具有廣闊的市場前景和較大的經濟效益。


圖1本發明設計的LAMP弓丨物對不同細菌的LAMP擴增結果；圖2反應產物螢光染料顯色示意圖；圖3LAMP反應產物進行kpnl酶切結果；圖4LAMP對不同血清型鴨疫裡默氏桿菌檢測的結果；圖5不同作用時間對LAMP檢測鴨疫裡默氏桿菌的影響；圖6LAMP敏感性實驗結果；圖7PCR敏感性實驗結果。
具體實施例方式以下結合具體實施例，進一步闡述本發明。這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件或按照製造廠商所建議的條件。除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。實施例1 鴨疫裡默氏桿菌LAMP檢測按下列組成配製鴨疫裡默氏桿菌LAMP檢測反應液(1)反應液A 含有 IOX 反應緩衝液、Bst DNA聚合酶、dNTP(2. 5mM each) ,Betaine solution (5M)、3對引物其序列為F3 :3，CTAAAGATGGGGTTTCTGTG 5，(SEQ ID NO. 1)B3 :3，ATCCATAGGATTAGCTCCAG 5，(SEQ ID NO. 2)FIP :3』 TCGTTGGTTTTAGATGCTACTTCTTTTTTGCTAAAGAGATAGAGCTAGAGG 5』 (SEQ ID NO. 3)BIP :3』 TGGCAGGAGATGGTACCACTTTTTCAGCCACATTTTTAAGACCTT5，(SEQ ID N0. 4)LF :3，ACCATTTGAGCTCCCATATT 5，(SEQ ID N0. 5)LB :3，GCTACCGTATTAGCGCAAGC 5，(SEQ ID N0. 6)(2)反應液 B :10000 X SYBR green I反應液A每管M μ L體系組成為反應組分體積(μ L)IOXThermoPol 反應緩衝液10Bst DNA (8，000U/mL)1dNTP (2. 5mM each)4Betaine solution(5M)5. 5FIP(IOyM)3BIP (10 μ Μ)3F3(10yM)1Β3(10μΜ)1LF(IOyM)1.5LB(IOyM)1.5總體積24(3)鴨疫裡默氏桿菌模板製備接種TSA上的鴨疫裡默氏桿菌WJ-4株單菌落至TSB液體培養基，37°C搖菌。然後再1 100轉接一次，搖菌至0D600 = 0. 6左右，各取ImL菌液12，000r/min離心lmin，去上清，滅菌PBS洗3次，ImL滅菌超純水重懸，製成模板備用。(4)鴨疫裡默氏桿菌WJ-4株LAMP檢測結果在反應液A中，加入製備的1 μ L鴨疫裡默氏桿菌模板，94°C水浴5分鐘，冰浴20 秒，加入IyL Bst DNA,混勻，65°C水浴20分鐘，80°C水浴滅活10分鐘，將反應產物分為2 份，一份加入IyL螢光染料STOR green I，觀察檢測結果，另外一份進行電泳檢測。結果均呈現特異性的反應，見圖1，泳道1-12分別為鴨疫裡默氏桿菌、禽大腸桿菌、禽沙門氏菌、 禽巴氏桿菌、禽結核分枝桿菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌、綠膿桿菌、禽李氏桿菌、禽敗血支原體、柔嫩艾美爾球蟲，泳道13為陰性對照；圖2中A顯橙黃色為陽性，B為陰性。(5)鴨疫裡默氏桿菌
對中LAMP反應產物進行kpnl酶切，酶切產物電泳檢測出現預期大小的2條特異性條帶，測序結果表明上述2片段與GroEL序列100%同源，結果進一步表明本發明建立的方法可對GroEL基因進行特異性擴增，見圖3。(6)鴨疫裡默氏桿菌不同血清型的LAMP檢測為驗證本發明對不同血清型鴨疫裡默氏桿菌檢測的效果，運用本發明對鴨疫裡默氏桿菌血清1、2、6、8、10、12、15以及未定型等11株細菌分別為模板，進行LAMP檢測，試驗步驟同上，瓊脂糖凝膠電泳結果表明本發明對上述血清型都可進行特異性檢測。見圖4 泳道1-2 血清1型；泳道3-4 血清2型；泳道5 血清6型；泳道6 血清8型；泳道7_8 血清10型；泳道9 血清12型；泳道10 血清15型；泳道11 未定型；泳道12 陰性對照。(7) LAMP反應時間的確立 為驗證本發明的最短檢測時間，對65 °C水浴步驟分別作了不同時間點的反應(分別為0、15、20、25、30、35、40、45、60分鐘)，其它試驗步驟同(4)所述，瓊脂糖凝膠電泳結果表明65°C水浴步驟作用20分鐘，即可進行結果判定，見圖5，圖中泳道1-10分別為0、15、 20、25、30、35、40、45、60分鐘和陰性對照。實施例2 =LAMP檢測鴨疫裡默氏桿菌的靈敏度(1)鴨疫裡默氏桿菌模板製備接種鴨疫裡默氏桿菌WJ4株至TSB液體培養基中，37 °C搖菌至OD6tltl = 0. 6左右， 取ImL菌液12，000r/min離心Imin,棄上清，滅菌PBS洗3次，ImLPBS重懸，製備的菌液濃度為 5 X IO5CFU/μ L，再用 PBS 分別稀釋成5 X IO4CFU/μ L、5 X IO3CFU/μ L、5 X IO2CFU/μ L、 lOOCFU/μ L、50CFU/y L、25CFU/y LUOCFU/μ L、5CFU/y L。(2) LAMP和PCR對鴨疫裡默氏桿菌靈敏度的檢測比較在反應液A中，加入上述實施例1製備的不同濃度的鴨疫裡默氏桿菌1 μ L作為模板，94°C水浴5分鐘，冰浴20秒，加入1 μ L Bst DNA,混勻，65°C水浴20分鐘，80°C水浴滅活 10分鐘，進行電泳檢測。結果表明本發明建立的LAMP檢測方法最低可以檢測出5個CFU的鴨疫裡默氏桿菌見圖6，圖中泳道1-9檢測的鴨疫裡默氏桿菌個數分別為5X10S、5X104、 5X103、5X102、100、50、25、10、5 ；泳道 10 陰性對照。依據GroEL序列，設計1對特異性的引物GroEL-F 5' TCAAGAGACGCACTTAAAAGAGGTG 3』GroEL-R :5，TGTACCTTTAGCCTCTTCCACAGTA 3，，加入上述實施例製備的不同濃度的鴨疫裡默氏桿菌1 μ L作為模板，按照下列反應體系進行PCR
權利要求
1.一種鴨疫裡默氏桿菌LAMP檢測試劑盒，其特徵在於其包含3對引物F3和B3 ；FIP 和BIP ；LF和LB，其中所述F3的核酸序列如SEQ ID NO. 1所示，所述B3的核酸序列如SEQ ID NO. 2所示，所述FIP的核酸序列如SEQ IDN0. 3所示，所述BIP的核酸序列如SEQ ID NO. 4 所示，所述LF的核酸序列如SEQ ID NO. 5所示，所述LB的核酸序列如SEQ ID NO. 6所示。
2.根據權利要求1所述的鴨疫裡默氏桿菌LAMP檢測試劑盒，其特徵在於其還含有螢光染料、10 X反應緩衝液、DNA聚合酶、dNTP、甜菜鹼。
3.根據權利要求2所述的鴨疫裡默氏桿菌LAMP檢測試劑盒，其特徵在於所述螢光染料為能與雙鏈DNA結合產生螢光的染料。
4.根據權利要求3所述的鴨疫裡默氏桿菌LAMP檢測試劑盒，其特徵在於所述螢光染料為溴化乙錠、SYBR Green I螢光染料或Hoechst 33258中之一。
5.根據權利要求3所述的鴨疫裡默氏桿菌LAMP檢測試劑盒，其特徵在於所述螢光染料為STOR Green I螢光染料。
6.一種鴨疫裡默氏桿菌的檢測方法，包括下列步驟a)取禽類的體液或組織液並以此為模板；b)利用3對引物F3和B3；FIP和BIP ；LF和LB進行LAMP反應，其中所述F3的核酸序列如SEQ ID NO. 1所示，所述B3的核酸序列如SEQ IDN0. 2所示，所述FIP的核酸序列如 SEQ ID N0. 3所示，所述BIP的核酸序列如SEQ ID N0. 4所示，所述LF的核酸序列如SEQ ID N0. 5所示，所述LB的核酸序列如SEQ ID N0. 6所示，反應條件為94°C 5分鐘，0°C 20秒， 650C 20-60 分鐘，80°C滅活;c)檢測LAMP反應產物。
7.根據權利要求6所述的檢測方法，其特徵在於所述禽類為鴨、火雞、雞或鳥類中任何之一。
8.根據權利要求6所述的檢測方法，其特徵在於步驟b中所述反應條件為94°C5分鐘， O0C 20 秒，65°C 20 分鐘，80°C滅活。
9.根據權利要求6所述的檢測方法，其特徵在於步驟c中所述檢測LAMP反應產物的方法為瓊脂糖凝膠電泳法、螢光顯色法或分光光度計法。
10.根據權利要求9所述的檢測方法，其特徵在於所述螢光顯色法為STORGreenI螢光顯色法。
全文摘要
本發明屬於生物檢測技術領域，具體涉及一種鴨疫裡默氏桿菌LAMP檢測試劑盒及其檢測方法。本發明公開了一種鴨疫裡默氏桿菌LAMP檢測試劑盒，其特徵在於其包含3對引物，它們的核酸序列如SEQ ID NO.1-6所示。本發明所述檢測試劑盒及其檢測方法具有快速、敏感、特異、成本低和操作簡單的特點，能較好的彌補當前鴨疫裡默氏桿菌檢測方法上的不足，可以滿足當前該病的檢測需求，易於大範圍推廣應用，可減少該病在鴨等動物中的流行，具有廣闊的市場前景和較大的經濟效益。
文檔編號G01N21/64GK102409084SQ20101029068
公開日2012年4月11日 申請日期2010年9月21日 優先權日2010年9月21日
發明者丁鏟, 於聖青, 仇旭升, 宋翠萍, 胡青海, 陳鴻軍, 韓先幹 申請人:中國農業科學院上海獸醫研究所